一株來源于土壤的耐鹽酵母菌鑒定及其與植物互作研究

毛慧芳 彭杰娣 楊棨博 周毅峰 田國政 劉曉鵬 唐巧玉 方慶

摘要[目的]鑒定一株來源于土壤的耐鹽酵母菌并探討其與植物的互作關系。[方法]對分離自恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤的一株真菌YSTEn005進行鑒定，并研究鹽脅迫下其與植物的互作關系。[結果]條件生長試驗表明，YSTEn005對NaCl的最高耐受水平可達10%，而對高濃度的K+不敏感。YSTEn005最適生長溫度為28 ℃，在含4%鹽的液體培養基中生長最快；其對pH耐受范圍較寬，可在pH 4.0～9.0條件下生長。顯微鏡下觀察YSTEn005是單細胞形態，菌體呈橢球型，并能夠行類似酵母的出芽生殖。克隆其18S rDNA，序列分析表明該真菌與高耐鹽酵母——漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）的親緣關系最近，推測YSTEn005很可能是漢遜德巴利酵母的一株變異種。該菌和擬南芥幼苗共培養顯示，YSTEn005的增殖可顯著降低植株在鹽脅迫下的存活率。[結論]試驗得到一株耐鹽酵母菌YSTEn005，該菌不能改善植物對鹽分的耐受性能。

關鍵詞真菌；耐鹽酵母菌；漢遜德巴利酵母；土壤

中圖分類號S154.3文獻標識碼A文章編號0517-6611（2017）21-0004-03

Identification of A Strain of Salttolerance Halophilic Yeast from Soil and Its Interaction with Plant

MAO Huifang1，2，PENG Jiedi2，YANG Qibo3，FANG Qing1，2* et al（1.Key Laboratory of Biological Resources Protection and Utilization of Hubei Province，Enshi，Hubei 445000；2.College of Biological Science and Technology，Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000； 3.Science and Technology College of Hubei University for Nationalities，Enshi，Hubei 445000）

Abstract[Objective] The aim was to identify a strain of salttolerance halophilic yeast from soil and study its interaction with plant.[Method] A halophilic yeast YSTEn005 was isolated from the Pinus massoniana rhizosphere soil in Enshi，and it interaction with plant was explored under salt stress.[Result] YSTEn005 could grow on the medium supplemented with up to 10% NaCl，and it appeared in sensitive to K+；the optimum growth temperature of YSTEn005 was 28 ℃，and growth rate was higher in medium with 4% NaCl than other series of degrees；YSTEn005 was tolerant to wide pH relatively，which ranged from 4.0 to 9.0.YSTEn005 was single cell pattern under microscope，and displayed budding similar to that of yeast.Cloning its 18S rDNA and analysis the sequence indicated that the YSTEn005 was evolutionally close to Debaryomyces hansenii，which is a halophilic yeast，suggesting that YSTEn005 was from this genus.When cocultured with plants，YSTEn005 growth promoted Arabidopsis seedlings dying significantly under salt stress conditions.[Conclusion] A strain of halophilic yeast YSTEn005 is obtained from soil，and the YSTEn005 growth is not helpful to plants tolerant to salt stress.

Key wordsFungi；Halophilic yeast；Debaryomyces hansenii；Soil

特殊生境（如鹽堿土壤、沼澤濕地）對真菌的類群有重要影響。長期生態適應，真菌類群很可能變化較大[2，5，8，11]。針對該地域的土壤，篩選真菌具有重要意義。恩施地處鄂西南山地，境內土壤多由灰質巖母巖風化而來[12]，植物種類繁多，其中馬尾松分布較廣。筆者采集湖北省恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤，進行土壤真菌篩選，獲得了一株耐鹽真菌，并研究了其與植物的互作關系。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1土壤樣品。菌株篩選土樣取自湖北省恩施市龍洞河附近的馬尾松根部5～8 cm深的土壤。

1.1.2培養基。菌株篩選采用馬丁氏培養基：磷酸二氫鉀 1.0 g/L，七水硫酸鎂0.5 g/L，蛋白胨5.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，瓊脂20.0 g/L，NaCl 0～12%，pH 6.5；條件生長試驗采用馬丁氏液體培養基；大腸桿菌DH5α培養采用LB培養基。

1.1.3分子克隆試劑。TE buffer，10 mmol/L Tris-HCl，1 mmol/L EDTA， pH 8.0；PCR擴增用Taq（Promega）， T4 DNA ligase與克隆載體pMD18-T[TaKaRa（大連）公司]；ddH2O；擴增引物（江蘇南京金斯瑞公司）（上游引物：GTAGTCATATGCTTGTCT；下游引物：CTTCCGTCAATTCCTTTAAG）。

1.2方法

1.2.1土壤懸液制備與菌株篩選。90.0 mL無菌水懸浮土樣10 g，于250 mL三角燒瓶中，150 r/min振蕩搖勻，25 ℃培養24 h；按照10-6至 10-1梯度稀釋培養后的土壤溶液，取樣品稀釋液0.1 mL涂布于馬丁氏培養基中（含NaCl濃度分別為 2%、4%～12%）， 28 ℃培養2～3 d；選取在含4%～10% NaCl的馬丁氏培養基上生長的菌落，劃線分離單菌落，對分離單菌落再次進行耐鹽性鑒定。

1.2.2耐受NaCl和KCl能力分析。將篩選出的YSTEn005菌株用無菌水懸浮，點1 μL于含不同濃度NaCl和KCl的馬丁氏固體培養基上，放入生化培養箱中培養3～5 d。

1.2.3條件生長試驗。初始接種量保持相同，分別在不同溫度（25、28、37 ℃）、pH（4.0～9.0）及含不同濃度的NaCl （2%～11%）等條件下振蕩培養（200 r/min）YSTEn005，每隔12 h取樣并檢測OD600。

1.2.4形態觀察。取樣品用生理鹽水稀釋，涂片后進行顯微鏡觀察。

1.2.5基因組DNA抽提。離心收集3 mL 過夜培養的菌體，TE溶液洗滌2次后，加入200 μL TE懸浮菌體，沸水浴10 min，收集上清，異丙醇沉淀DNA，并用75%乙醇洗滌1次后，晾干后加入ddH2O溶解。

1.2.618S rDNA 克隆。以真菌基因組DNA為模板，采用真菌引物進行PCR擴增。PCR反應體系：引物（上、下游混合） 1 μL，DNA模板3 μL，Taq酶10 μL，加入6 μL無菌水定容至20 μL。PCR程序： 95 ℃ 5 min， 94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，32個循環。

1.2.7序列分析。序列測定由金斯瑞公司（南京）完成；NCBI在線Blast，DNAMAN序列比對，使用MEGA 6.0 Neighbor-Joining 方法構建系統發育樹。

1.2.8菌-植共培養。培養無菌擬南芥幼苗，置于涂布有YSTEn005（菌液濃度OD600=0.02）的1/4 MS培養基上，培養（22 ℃ 18 h光照、20 ℃ 6 h黑暗）3 d。

2結果與分析

2.1耐鹽能力與菌體形態28 ℃培養3 d，挑取19個能夠在4%～10%鹽生長的單菌落進行二次篩選，其中1株（命名為YSTEn005）能夠在較高鹽濃度下生長。分別在含不同濃度的KCl、NaCl 培養基上進行耐性鑒定，如圖1A所示，該菌可在4%～10% KCl條件下生長，并且菌斑大小無明顯差異，表明YSTEn005可能對K+不敏感；YSTEn005可在10%的鹽濃度下生長，但相較4% NaCl情況下，菌體生長明顯變慢，表明10% NaCl濃度對YSTEn005細胞增殖抑制明顯；使用油鏡觀察發現，該真菌是單細胞形態，菌體呈橢球體形，并且行出芽生殖（圖1B）。注：A.不同KCl和NaCl條件下培養3 d；B.油鏡觀察YSTEn005細胞形態

YSTEn005在28 ℃下細胞增殖最快（圖2A）；在4% NaCl濃度下菌體生長最快， 其次是2% NaCl （圖2B），表明液體培養條件下其最適的鹽濃度為4%；其對pH的耐受范圍較寬，可在pH為4.0～9.0的液體培養基中生長，但是在pH 5.0的條件下細胞增殖最快（圖2C）。

巴利酵母（D.hansenii）[13-16]（如HQ717147）的18S rDNA序列相似性最高；構建系統發育樹，表明該耐鹽菌YSTEn005來源于漢遜德巴利酵母屬（圖3），其很可能是漢遜德巴利酵母的一個變種。

2.4YSTEn005與植物幼苗互作關系采用平板共培養方法研究YSTEn005和植物之間的互作關系，結果表明，在不添加鹽分（NaCl）的平板上，相較于對照組（-N-Y），該菌增殖降低了植物的存活率，表明YSTEn005增殖對植物生長產生影響（圖4，-N-Y，-N+Y）；而在0.8% NaCl的條件下，有YSTEn005增殖的平板中幼苗存活率降低70%左右（圖4，+N-Y，+N+Y）。YSTEn005增殖情況下幼苗存活率銳減，表明該菌增殖顯著加劇，植物在鹽脅迫下死亡。

馬尾松在鄂西恩施地區分布較廣，生長良好。該研究從恩施市龍洞河附近的馬尾松根部土壤中分離出一株耐鹽真菌YSTEn005。顯微觀察、18S rDNA序列分析及條件生長試驗表明，YSTEn005很可能是漢遜德巴利酵母的一個變種。漢遜德巴利酵母對高鹽濃度脅迫具有自然的耐受性能，其耐受機制逐漸受到重視[13-14，17]，成為研究真核微生物細胞耐鹽的重要模式種。另外，漢遜德巴利酵母潛在的生物技術應用能力受到關注，如特殊糖醇的發酵生產、果品保藏、廢水處理等[18-20]。

我國土壤鹽堿化情況不容樂觀，鹽堿土壤的含鹽量在0.6%～10.0%，即對植物生產造成較大危害[21-23]。該試驗條件下，發現YSTEn005與擬南芥幼苗共培養，加劇了鹽脅迫下幼苗的死亡。以上表明，該菌過度繁殖并未改善植物耐鹽性能。可能是植物受到該菌的侵染，誘發植物凋亡。模擬土壤中該菌和植物互作關系，從而進一步研究實際條件下該菌的調節方式，將有助于揭示特殊生境中真菌對土壤生態系統的功能。

參考文獻

[1] HAWKSWORTH D L.Global species numbers of fungi：Are tropical studies and molecular approaches contributing to a more robust estimate？[J].Biodiversity and conservation，2012，21（9）：2425-2433.

[2] OBRIEN H E，PARRENT J L，JACKSON J A，et al.Fungal community analysis by largescale sequencing of environmental samples[J].Appl Env Microbiol，2005，71（9）：5544-5550.

[3] HAWKSWORTH D L.The magnitude of fungal diversity：The 1.5 million species estimate revisited[J].Mycol Res，2001，105（12）：1422-1432.

[4] HAWKSWORTH D L，ROSSMAN A Y.Where are all the undescribed fungi？[J].Phytopathology，1997，87（9）：888-891.

[5] ZEILINGER S，GUPTA V K，DAHMS T E S，et al.Friends or foes？ Emerging insights from fungal interactions with plants[J].FEMS microbiology reviews，2016，40（2）：182-207.

[6] HARDOIM P R，VAN OVERBEEK L S，BERG G，et al.The hidden world within plants：Ecological and evolutionary considerations for defining functioning of microbial endophytes[J].Microbiology and molecular biology reviews，2015，79（3）：293-320.

[7] 梁昌聰，肖艷萍，趙之偉.云南會澤廢棄鉛鋅礦區植物叢枝菌根和深色有隔內生真菌研究[J].應用與環境生物學報，2007，13（6）：811-817.

[8] 張晶，張惠文，李新宇，等.土壤真菌多樣性及分子生態學研究進展[J].應用生態學報.2004，15（10）：1957-1962.

[9] 王芳，圖力古爾.土壤真菌多樣性研究進展[J].菌物研究，2014，12（3）：178-186.

[10] PUSZTAHELYI T，HOLB I J，PCSI I.Secondary metabolites in fungusplant interactions[J].Frontiers in plant science，2015，6：573.

[11] TRESEDER K K，LENNON J T.Fungal traits that drive ecosystem dynamics on land[J].Microbiology and molecular biology reviews，2015，79（2）：243-262.

[12] 李明龍，楊廷安，楊良策，等.湖北恩施州農業地質條件及工作方法探討[J].資源環境與工程，2014，28（6）：915-918.

[13] PRISTA C，LOUREIRODIAS M C，MONTIEL V，et al.Mechanisms underlying the halotolerant way of Debaryomyces hansenii[J].FEMS Yeast Res，2005，5（8）：693-701.

[14] PRISTA C，MICHN C，MIRANDA I M，et al.The halotolerant Debaryomyces hansenii， the Cinderella of nonconventional yeasts[J].Yeast，2016，33（10）：523-533.

[15] BREUER U，HARMS H.Debaryomyces hansenii-An extremophilic yeast with biotechnological potential[J].Yeast，2006，23（6）：415-437.

[16] AGGARWAL M，MONDAL A K.Role of Nterminal hydrophobic region in modulating the subcellular localization and enzyme activity of the bisphosphate nucleotidase from Debaryomyces hansenii[J].Eukaryot Cell，2006，5（2）：262-271.

[17] 付暢，楊傳平，劉桂豐，等.酵母耐鹽機制的研究進展[J].遺傳，2003，25（6）：757-761.

[18] 張麗麗，廖德芳，丁重陽，等.漢遜德巴利酵母發酵葡萄糖生產D-阿拉伯糖醇[J].工業微生物，2010，40（4）：47-52.

[19] SINGH D，SHARMA R R，SAMUEL D V K，et al.Enhancing the bioefficacy of Debaryomyces hansenii with sodium salts for reducing the blue mould rot in apples[J].Indian phytopathology，2011，62（4）：478-483.

[20] 成細瑤，楊波，劉志剛，等.利用氨基酸廢水發酵生產飼料用漢遜德巴利酵母的研究[J].飼料工業，2014（S1）：102-105.

[21] 趙百鎖，楊禮富，宋蕾，等.中度嗜鹽菌在生物技術中的應用[J].微生物學通報，2009，34（2）：359-362.

[22] 周和平，張立新，禹鋒，等.我國鹽堿地改良技術綜述及展望[J].現代農業科技，2007（11）：159-161，164.

[23] 王多兵，任偉，張富春，等.鹽穗木根際土壤中耐鹽菌B6的分離與鑒定[J].安徽農業科學，2013，41（3）：957-960，969.