K-ras原核表達載體的構(gòu)建及生物學功能研究

陳思禹,崔越,洪甜,李玲,晉帥,黃俊,尤文葉,韓笑,葉棋濃,劉陽,王鈺琦

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.首都師范大學，北京 100048；

3.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850；4.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000

K-ras原核表達載體的構(gòu)建及生物學功能研究

陳思禹1,崔越2,洪甜3,李玲3,晉帥1,黃俊3,尤文葉1,韓笑4,葉棋濃2,劉陽1,王鈺琦1

1.解放軍總醫(yī)院，北京 100853；2.首都師范大學，北京 100048；

3.軍事醫(yī)學科學院 生物工程研究所，北京 100850；4.錦州醫(yī)科大學，遼寧 錦州 121000

目的：構(gòu)建帶Myc標簽的K-ras原核表達載體，并初步鑒定其生物學活性。方法：利用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中擴增人K-ras結(jié)構(gòu)域的基因編碼序列，插入載體pXJ-40得到重組質(zhì)粒，經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定后，Western印跡檢測其在人293T細胞中的表達；利用GST pull down實驗檢測與Raf1-RBD的結(jié)合情況，驗證其生物性活性。結(jié)果：用PCR技術(shù)從人乳腺文庫中擴增得到約570 bp的目的片段，插入載體pXJ-40后構(gòu)建了Myc-K-ras重組質(zhì)粒，并經(jīng)酶切鑒定及測序證實無誤；Myc-K-ras能在293T細胞中正確表達，并能與Raf1-RBD結(jié)合，具有生物學活性。結(jié)論：為進一步研究K-ras的生物學功能奠定了重要基礎。

人K-ras基因；Ras/Raf/Mek/Erk；原核表達

［Key words］humanK-rasgene;Ras/Raf/Mek/Erk;eukaryotic expression

RAS通路作為調(diào)節(jié)表皮生長因子受體活化下游效應的主要信號轉(zhuǎn)導通路之一，對細胞的增殖具有非常重要的作用[1]。RAS家族包括K-ras/N-ras/H-ras，它們具有相似的結(jié)構(gòu)與功能。RAS蛋白相對分子質(zhì)量為21×103，因而又稱P21蛋白。RAS蛋白具有GTP酶活性作用，通過將有絲分裂和生長信號從細胞漿傳遞到細胞核內(nèi)而參與調(diào)節(jié)細胞的生長、增殖、分化和調(diào)亡等多種生物學過程[2]。

大量研究顯示肺癌的發(fā)生與K-ras突變密切相關。15%～20%的非小細胞型肺癌（NSCLC）患者存在ras基因突變，其中約90%為K-ras基因突變；約80%的K-ras基因突變發(fā)生于12號密碼子（G12D），其余則主要位于13和61號密碼子上[3]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)約30%的肺腺癌患者有K-ras基因突變，且K-ras基因突變多見于女性患者。在早期和局部晚期NSCLC中，K-ras基因突變與生存期短有密切關系，K-ras基因突變預示預后不良[4～5]。

1 材料和方法

1.1 材料

大腸桿菌DH5α感受態(tài)、原核表達載體pXJ-40、結(jié)合有GST蛋白的GST beads、結(jié)合有GSTRaf1-RBD蛋白的GST beads由本實驗室保存；限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ和KpnⅠ、PCR所需試劑及T4DNA連接酶由TaKaRa公司提供；合成K-ras基因片段的上、下游引物由作者設計，北京賽百盛生物技術(shù)有限公司合成；DNA膠回收試劑盒購自北京天根生物科技有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒為Promega公司產(chǎn)品；DMEM及小牛血清均購自Gibco公司；VigoFect為威格拉斯生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；辣根過氧化物酶（HRP）偶聯(lián)的抗Myc標簽鼠單克隆抗體由Sigma公司提供；已構(gòu)建的基因由北京華大生物技術(shù)有限責任公司測序。

1.2 人K-ras基因編碼區(qū)的擴增

根據(jù)文獻報道的K-ras基因編碼序列設計上、下游引物。擴增模板為人乳腺文庫，擴增目的基因片段過程中使用Prime star酶。PCR條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min，34個循環(huán)；72℃再延長5 min。PCR結(jié)束后檢測PCR產(chǎn)物，在紫外燈下鑒定后切出目的基因片段，用DNA膠回收試劑盒完整地回收目的基因片段。

1.3 Myc-K-ras重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

PCR產(chǎn)物及載體pXJ-40經(jīng)BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，挑單克隆進行菌液PCR鑒定及BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，將陽性單克隆的質(zhì)粒送北京華大公司測序。

1.4 Myc-K-ras在293T細胞系中的表達

將質(zhì)粒Myc、Myc-K-ras各轉(zhuǎn)染2個10 cm皿，每皿轉(zhuǎn)染15μg，24 h后收細胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制劑和DTT的RIPA裂解液混勻細胞，冰浴30 min后加入等量的SDS，用Western印跡檢測其表達情況。

1.5 Myc-K-ras活性檢測

Myc-K-ras轉(zhuǎn)染10 cm皿，15μg質(zhì)粒，24 h后收細胞，用含1∶1000的蛋白酶抑制劑和DTT的低鹽免疫沉淀（IP）緩沖液500μL混勻細胞，冰浴30 min后超聲波裂解細胞（超聲2 s，停2 s，每個樣品超聲2次），之后于4℃、12 000 r/min離心10 min，取離心后的30μL細胞超聲波產(chǎn)物于另一管中做in put，加入等量的SDS于-20℃保存。將與GST-Raf1-RBD結(jié)合的beads、與GST結(jié)合的beads各30μL分別加入上述細胞裂解產(chǎn)物中，于4℃結(jié)合4 h以上，4℃、3000 r/min離心3 min去上清，用IP緩沖液500μL洗3次，混勻，于4℃環(huán)境中搖晃，5 min后，3000 r/min離心2 min重復3次，利用Western印跡檢測觀察活性。

2 結(jié)果

2.1 人K-ras基因編碼序列的克隆

擴增模板為人乳腺文庫，擴增獲得與預期片段大小（約570 bp）一致的PCR產(chǎn)物（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

用BamHⅠ和KpnⅠ同時對目的基因片段及pXJ-40載體進行雙酶切，之后將二者連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，做菌液PCR后挑選陽性克隆（圖2），提取相應的質(zhì)粒，對質(zhì)粒進行BamHⅠ和KpnⅠ雙酶切鑒定，可見約570 bp的目的條帶（圖3），表明人K-ras基因的編碼序列已插入載體pXJ-40相應的酶切位點中。將連接成功的質(zhì)粒送北京華大生物技術(shù)有限責任公司測序，測序后的目的片段與文獻報道相應序列進行比對，結(jié)果表明兩者完全一致（序列略），無任何突變現(xiàn)象發(fā)生。

2.3 Western印跡檢測Myc-K-ras在293T細胞中的表達

為了驗證Myc-K-ras能否在細胞中正確表達，將構(gòu)建初步成功的Myc-K-ras質(zhì)粒和Myc空載體分別轉(zhuǎn)染293T細胞，24 h后收集細胞蛋白進行Western印跡。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染Myc空載體的無條帶，轉(zhuǎn)染Myc-K-ras質(zhì)粒的在相對分子質(zhì)量約21×103處檢出條帶（圖4），說明構(gòu)建的Myc-K-ras能在293T細胞中正確表達。

圖1 目的基因K-ras的PCR擴增

圖2 重組質(zhì)粒Myc-K-ras的菌液PCR鑒定

圖3 重組質(zhì)粒Myc-K-ras的酶切鑒定

2.4 Myc-K-ras活性鑒定

用純化的GST-Raf1-RBD融合蛋白、GST蛋白與轉(zhuǎn)染Myc-K-ras的細胞裂解產(chǎn)物的GST-pull down反應結(jié)果進行Western印跡，結(jié)果顯示Myc-K-ras可與GST-Raf1-RBD蛋白結(jié)合，與文獻報道一致（圖5）[6～7]。

圖4 Western印跡檢測Myc-K-ras的表達

圖5 Myc-K-ras活性鑒定

3 討論

發(fā)現(xiàn)非小細胞肺癌K-ras基因突變已有20多年，其臨床價值最近引起廣泛關注。最近的研究顯示[8-9]，存在K-ras基因突變的非小細胞肺癌患者難以從輔助化療中獲益，而且K-ras基因突變多發(fā)生于應用Gefitinib或Eroltinib治療過程中疾病進展的NSCLC患者[10]。有研究表明，存在K-ras基因突變的NSCLC患者在應用Eroltinib聯(lián)合化療時，其疾病進展時間及中位生存時間均低于單獨應用化療的患者[11]。這些提示K-ras基因突變情況可作為表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑療效的預測指標。此外，關于K-ras基因突變與吸煙史之間的關系眾說紛紜，有研究顯示K-ras基因突變與吸煙史密切相關，而在終生未吸煙患者中幾乎未發(fā)現(xiàn)K-ras基因突變[12]，但亦有研究顯示不吸煙的NSCLC患者同樣可存在K-ras基因突變[13]。可見關于K-ras與肺癌發(fā)生的關系有大量工作亟待解決。因此，Myc-K-ras的構(gòu)建對研究K-ras突變與肺癌發(fā)生之間的關系有重要意義。

參考文獻

[1]Downward J.Targeting RAS signalling pathways in cancer therapy[J].Nat Rev Cancer,2003,3(1):11-22.

[2]Khosravi-Far R,Der C J.The Ras signal transduction pathway[J].Cancer Metastasis Rev,1994,13(1):67-89.

[3]Mascaux C,Iannino N,Martin B,et al.The role of RAS oncogene in survival of patients with lung cancer:a systematic review of the literature with meta analysis[J].Br J Cancer,2005,92(1):131-139.

[4]Nelson H H,Christiani D C,Mark E J,et al.Implications and prognostic value of k-ras mutation for earlystage lung cancer in women[J].J Natl Cancer Inst, 1999,91(23):2032-2038.

[5]Huncharek M,Muscat J,Geschwind J F.K-ras oncogene mutation as a prognosticmarker in non-small cell lung cancer:A combined analysis of 881 cases [J].Carcinogenesis,1999,20(8):1507-1510.

[6]Mclubrey J A,Steelman L S,Chappell W H,et al. Roles of the Raf/MEK/ERK pathway in cell growth, malignant t ransformat ion and drug resistance[J].Biochim Biophys Acta,2007,1773(8):1263-1284.

[7]Sacks D B.The role of scaf fold proteins in MEK/ ERK signaling[J].Biochem Soc Trans,2006,34(5):833-836.

[8]Tsao M S,Aviel-Ronen S,Ding K,et al.Prognostic and predictive importance of p53 and ras for adjuvant chemotherapy in non-small cell lung cancer[J].J Clin Oncol,2007,25(33):5240-5247.

[9]Winton T,Livingston R,Johnson D,et al.Vinorelbine plus cisplatin vs.observation in resected non-smallcell lung cancer[J].N Engl J Med,2005,352(25):2589-2597.

[10]Pao W,Wang T Y,Riely G J,et al.KRAS mutations and primary resistance of lung adenocarcinomas to gefitinib or erlotinib[J].PLoS Med,2005,2(1):e17.

[11]Eberhard D A,Johnson B E,Am ler L C,et al.Mutations in the epidermalgrowth factor receptor and K-ras are predictive and prognostic indicators innonsmall cell lung cancers treated with chemotherapy alone and in combinationwith erlotinib[J].J Clin Oncol,2005,23(25):5900-5909.

[12]Ahrendt S A,Decker P A,Alawi E A,et al.Cigarette smoking is strongly associated with mutation of the K-ras gene in patients with primary adenocarcinoma of the lung[J].Cancer,2001,92(6):1525-1530.

[13]Riely G J,Kris M G,Rosenbaum D,et al.Frequency and distinctive spectrumof KRAS mutations in never smokers with lung adenocarcinoma[J].Clin Cancer Res,2008,14(18):5731-5734.

Construction of Hum an K-ras Eukaryotic Expression Vector and its Biological Function Research

CHEN Si-Yu1,CUI Yue2,HONG Tian3,LI Ling3,JIN Shuai1,HUANG Jun3, YOU Wen-Ye1,HAN Xiao4,YE Qi-Nong2*,LIU Yang1*,WANG Yu-Qi1*

1.PLA General Hospital,Beijing 100853;2.Capital Normal University,Beijing 100048;3.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100850;4.Jinzhou Medical University,Jinzhou 121000;China

*Co-corresponding authors,WANG Yu-Qi,E-mail:wyq301@qq.com;LIU Yang,E-mail:sunny301x@sina.com;YE Qi-Nong,E-mail:yeqn66@yahoo.com

Objective:To construct the eukaryotic expression vector of humanK-raslabeled with Myc tag and preliminary detect the biological function of the expression product Myc-K-ras.Methods:HumanK-rasgene was obtained from human mammary gland cDNA library by PCR and cloned into pXJ-40 vector.After the eukaryotic expression vector mediated expression of Myc-K-ras was observed in the human kidney 293T cells lines.The interactions of the K-ras with Raf1-RBD were identified by GST-pull-down assay.Results:The DNA fragment of about 570 bp was amplified from human mammary gland cDNA library by PCR,K-raseukaryotic expression vector labeled with Myc was constructed and the expression of human K-ras protein was detected by Western blot in the human kidney 293T cells lines.Myc-K-ras fusion protein of about 21 kD was induced and identified by SDSPAGE analysis,its activity was consistent with the report.Conclusion:The results has laid foundation for the further study on the function ofK-ras.

Q78

A

1009-0002（2017）03-0324-04

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.016

2016-12-13

國家自然科學基金（81472589，31100604）

陳思禹（1991-），男，碩士研究生，（E-mail）15608407432@163.com；崔越（1991-），男，本科生，（E-mail）1091279576@qq.com；二者為共同第一作者

王鈺琦，（E-mail）wyq301@qq.com；劉陽，（E-mail）sunny301x@sina.com；葉棋濃，（E-mail）yeqn66@yahoo.com