L-色氨酸發(fā)酵過程偶聯(lián)膜分離提取工藝研究

劉鎮(zhèn)瑜，劉子強(qiáng)，蔡萌萌，陳寧，徐慶陽

代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

L-色氨酸發(fā)酵過程偶聯(lián)膜分離提取工藝研究

劉鎮(zhèn)瑜，劉子強(qiáng)，蔡萌萌，陳寧，徐慶陽

代謝控制發(fā)酵技術(shù)國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室，天津市氨基酸高效綠色制造工程實(shí)驗(yàn)室，天津科技大學(xué) 生物工程學(xué)院，天津 300457

目的：將發(fā)酵過程與膜分離提取過程相偶聯(lián)，解決現(xiàn)有產(chǎn)酸周期短、乙酸積累較為嚴(yán)重等問題，以提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量，降低代謝抑制物質(zhì)的積累量。方法：將發(fā)酵罐與陶瓷膜分離裝置相偶聯(lián)，在發(fā)酵時(shí)長21 h、乙酸積累量達(dá)到5 g/L時(shí)開始膜過濾濃縮菌液，結(jié)束后補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵。結(jié)果：采用膜偶聯(lián)發(fā)酵技術(shù)，與傳統(tǒng)發(fā)酵工藝相比，菌體生物量提高3.4%，谷氨酸積累量下降54.34%，乙酸積累量下降55.36%。整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)酸周期延長了12 h，發(fā)酵過程中糖酸轉(zhuǎn)化率提高6.9%。結(jié)論：采用膜偶聯(lián)發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸，可以顯著提高色氨酸產(chǎn)量，降低代謝副產(chǎn)物的積累量，延長產(chǎn)酸周期，提高糖酸轉(zhuǎn)化率。

L-色氨酸；膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝；乙酸；糖酸轉(zhuǎn)化率

［Key words］L-tryptophan;membrane coupled fermentation technology;acetic acid;glucose conversion rate

L-色氨酸是人體必需的八種氨基酸之一，在人和動物的生長發(fā)育、新陳代謝等方面有重要作用，又被稱為第二必需氨基酸，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和衛(wèi)生行業(yè)[1-4]。迄今，L-色氨酸的生產(chǎn)方法主要有酶法、微生物轉(zhuǎn)化法和微生物發(fā)酵法[5]，其中微生物發(fā)酵法由于具有獨(dú)特的發(fā)展優(yōu)勢而被廣泛采用。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)L-色氨酸的過程中，菌種改造和發(fā)酵過程控制優(yōu)化一直是提高L-色氨酸產(chǎn)量的兩個(gè)主要研究方向。截至目前，通過菌種改造與發(fā)酵過程控制優(yōu)化等手段，L-色氨酸的產(chǎn)量可以達(dá)到54.5 g/L[6]。但是現(xiàn)有發(fā)酵過程中，由于乙酸逐漸積累，產(chǎn)酸周期難以延長，細(xì)胞活力在中后期也逐漸下降。為了進(jìn)一步提高L-色氨酸的產(chǎn)量，可以對發(fā)酵過程中的生物反應(yīng)器進(jìn)行一定的改造。

隨著生物反應(yīng)器技術(shù)的發(fā)展，將發(fā)酵罐與生物分離裝置相偶聯(lián)，發(fā)酵罐內(nèi)的發(fā)酵液經(jīng)過生物分離裝置分離之后，濃縮的細(xì)胞部分再打回發(fā)酵罐內(nèi)，以保持發(fā)酵罐內(nèi)細(xì)胞的高活性狀態(tài)，可以顯著提高發(fā)酵生產(chǎn)率[7]。本實(shí)驗(yàn)是在L-色氨酸的發(fā)酵過程中，將發(fā)酵罐與陶瓷膜相偶聯(lián)，發(fā)酵到一定時(shí)間之后開始進(jìn)行膜過濾分離。分離后的發(fā)酵清液進(jìn)入提取工序，濃縮菌液進(jìn)入發(fā)酵罐后補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵。本研究分析了L-色氨酸發(fā)酵過程偶聯(lián)膜分離提取工藝對發(fā)酵過程中色氨酸的產(chǎn)率、轉(zhuǎn)化率、谷氨酸積累量、乙酸積累量與碳代謝流變化的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

大腸桿菌TRTH株由天津科技大學(xué)工業(yè)微生物菌種保藏室提供；5 L和30 L自動控制發(fā)酵罐購自上海保興生物設(shè)備工程有限公司；陶瓷膜濃縮分離系統(tǒng)購自上海戈瑞環(huán)境生物工程有限公司；78-1電熱恒溫培養(yǎng)箱購自湖北省黃石醫(yī)療器材廠；P200Ⅱ型或P230高壓恒流泵、UV200Ⅱ紫外可見波長監(jiān)測器、氨基酸專用色譜工作站、ZW型色譜柱恒溫箱購自美國Laballiance設(shè)備公司；氨基酸專用色譜柱（C18，5μm，250 mm×4.6 mm）購自大連依利特分析儀器公司。

1.2 培養(yǎng)基

①活化斜面培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖1，蛋白胨10，牛肉膏5，酵母粉5，NaCl 2.5，瓊脂條20，pH7.0～7.2；②種子培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖40，酵母粉1，（NH4）2SO41.2，K2HPO45.6，MgSO4·7H2O 2.0，F(xiàn)eSO4·7H2O 2.8 mg/L，MnSO4·H2O 1.2 mg/L，VB13.9 mg/L，VH0.3 mg/L；③發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖0.75，酵母粉1，檸檬酸鈉2，K2HPO47.5，Mg-SO4·7H2O 2，F(xiàn)eSO4·7H2O 75.6 mg/L，微量元素1 mL，pH7.0～7.2，消泡劑1 mL/L；④透析培養(yǎng)基（g/ L）：KH2PO42，MgSO4·7H2O 0.33，KCl 2，CTT 0.5，微量元素6 mL；⑤微量元素溶液（mg/L）：鉬酸銨0.28，硼酸5，CoCl2·6H2O 1.4，MnSO4·H2O 0.5，CuSO4·7H2O 0.5，ZnSO4·7H2O 0.6。

1.3 培養(yǎng)方法

1.3.1 斜面活化培養(yǎng) 取斜面保藏菌種1環(huán)，劃線接種于活化斜面，37℃恒溫培養(yǎng)20～24 h。

1.3.2 種子培養(yǎng) 用無菌水沖洗活化斜面5支，并以火焰接種方式接入5 L種子罐，初始通氣量1 L/min，攪拌轉(zhuǎn)速200 r/min，溫度36℃，自動流加氨水控制pH為7.0，以泡敵消泡，種子培養(yǎng)12 h。

1.3.3 發(fā)酵培養(yǎng) 以10%的接種量將種子液接種于裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的30 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵。培養(yǎng)溫度36℃，通過調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速、通氣量與葡萄糖流加速率保持溶氧水平為20%～30%。通過自動流加氨水將pH值維持在7.0（0～20 h）、6.7（20～40 h）。

1.3.4 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝可以降低發(fā)酵過程中副產(chǎn)物的濃度，減少抑制作用[8]。發(fā)酵過程中實(shí)時(shí)檢測乙酸濃度，在乙酸產(chǎn)量大于5 g/L時(shí)進(jìn)行膜過濾。整個(gè)分離裝置在開啟前1 h采用0.1 MPa蒸汽滅菌，滅菌后通入無菌空氣保持正壓。分離后的發(fā)酵清液進(jìn)入提取工序，濃縮菌液進(jìn)入發(fā)酵罐后補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)發(fā)酵。分離過程中停止發(fā)酵，維持條件為溫度32℃、pH7.0，不流加葡萄糖，分離時(shí)間1.5 h（該時(shí)間不計(jì)入發(fā)酵時(shí)間）。L-色氨酸發(fā)酵過程偶聯(lián)膜分離提取裝置如圖1所示。

1.4 分析方法

pH值、菌體濃度、L-色氨酸濃度、葡萄糖濃度及谷氨酸濃度測定參見文獻(xiàn)［9］，溶氧水平、乙酸含量測定參見文獻(xiàn)［10］。

1.5 代謝流平衡平衡模型的建立

代謝流平衡模型的建立參見文獻(xiàn)［11］，L-色氨酸的代謝網(wǎng)絡(luò)如圖2所示，反應(yīng)速率方程與各步的反應(yīng)計(jì)量化學(xué)方程式見附錄。

2 結(jié)果

2.1 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對菌體生物量及L-色氨酸產(chǎn)量的影響

色氨酸是細(xì)胞代謝產(chǎn)生的初級代謝產(chǎn)物，其產(chǎn)量與細(xì)胞數(shù)有著密切關(guān)系[12]，增加菌體生物量的濃度可以提高色氨酸的產(chǎn)量。采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，實(shí)時(shí)監(jiān)測乙酸和L-色氨酸的濃度，當(dāng)發(fā)酵時(shí)長達(dá)到21 h、乙酸濃度接近5.0 g/L、色氨酸濃度達(dá)到32.5 g/L時(shí)進(jìn)行過濾，菌體生物量濃度與色氨酸產(chǎn)量如圖3所示。可以看出，采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，可以明顯提高菌體生物量濃度。膜過濾開始后，發(fā)酵罐內(nèi)抑制性底物與副產(chǎn)物濃度都有所下降，低的抑制性物質(zhì)濃度，使得細(xì)胞得以繼續(xù)生長。采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，菌體生物量濃度由52.4 g/L提高到54.2 g/L，相對于普通發(fā)酵而言提高了3.4%。采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，在21 h開始膜過濾后，由于抑制作用解除，細(xì)胞酶活得到恢復(fù)，細(xì)胞的產(chǎn)酸速率幾乎與初始發(fā)酵一致。產(chǎn)酸周期延長至44 h，相比普通發(fā)酵而言，整個(gè)發(fā)酵過程產(chǎn)酸周期延長了12 h。

2.2 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對乙酸及谷氨酸積累的影響

圖1 L-色氨酸發(fā)酵過程偶聯(lián)膜分離提取裝置

圖2 L-色氨酸生物合成代謝網(wǎng)絡(luò)

圖3 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對生物量及L-色氨酸產(chǎn)量的影響

用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝發(fā)酵生產(chǎn)L-色氨酸，乙酸積累量和谷氨酸積累量如圖4所示，在整個(gè)發(fā)酵生產(chǎn)過程中，乙酸積累量與谷氨酸積累量都明顯下降。常規(guī)單一發(fā)酵過程中產(chǎn)生的乙酸很難排出發(fā)酵罐，發(fā)酵21 h左右乙酸積累達(dá)5.6 g/L，嚴(yán)重抑制了色氨酸的繼續(xù)生產(chǎn)，在后續(xù)發(fā)酵過程中乙酸的積累量逐漸加大，最大達(dá)11.2 g/L，并且發(fā)酵液逐漸變黑。而采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，在21 h乙酸積累量達(dá)到5 g/L時(shí)進(jìn)行膜過濾，發(fā)酵液中的乙酸隨透析液逐漸被清除出發(fā)酵罐。隨著發(fā)酵透析培養(yǎng)基的加入，乙酸進(jìn)一步得到稀釋。整個(gè)發(fā)酵過程中，乙酸的積累量都控制在5 g/L以下，為提高色氨酸的轉(zhuǎn)化率提供了一定的條件。由于采用了膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，谷氨酸的積累也得到了一定的抑制。整個(gè)發(fā)酵過程中，谷氨酸的積累量最高達(dá)到2.1 g/L，相比于普通發(fā)酵而言下降了54.34%。

2.3 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，發(fā)酵過程中的糖酸轉(zhuǎn)化率如圖5所示，一直維持在較高水平。在21 h開始透析后，由于抑制物質(zhì)的解除和菌體生物量的增加，細(xì)胞合成色氨酸的速率得到提高，總的色氨酸的量也得到相應(yīng)提高。在整個(gè)發(fā)酵過程中采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，糖酸轉(zhuǎn)化率為18.5%，而普通發(fā)酵的糖酸轉(zhuǎn)化率為17.3%，相比而言糖酸轉(zhuǎn)化率提高了6.9%。

2.4 膜過濾前后的代謝流量變化

圖4 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對乙酸及谷氨酸積累量的影響

分別測定膜過濾前4 h即16～20 h（階段1）與膜過濾后4 h即38～42 h（階段2）內(nèi)的葡萄糖消耗速率，以及胞外色氨酸、乳酸、乙酸、丙氨酸、苯丙氨酸及酪氨酸的濃度，結(jié)果見表1。然后以葡萄糖摩爾消耗速率為100 mmol/（L·h），分別計(jì)算各自的消耗或積累速率。運(yùn)用Metatool軟件線性規(guī)劃計(jì)算得到相應(yīng)的代謝流分布，結(jié)果見表2。

色氨酸生物合成的前體物分別是磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖（E4P），大腸桿菌攝取葡萄糖后經(jīng)糖酵解（EMP）途徑與磷酸戊糖（HMP）途徑生成PEP與E4P。色氨酸的合成有幾個(gè)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)，如Glc6P節(jié)點(diǎn)和PEP節(jié)點(diǎn)。Glc6P節(jié)點(diǎn)主要控制著碳架形成X5P和E4P的多少，而PEP節(jié)點(diǎn)則決定著流向PEP與形成分支酸的代謝流量變化。由表2可知，在膜過濾之前（階段1），有87.42%的碳架進(jìn)入EMP（r2）途徑，28%的碳架由F6P和GAP通過轉(zhuǎn)酮酶催化生成X5P和E4P進(jìn)入HMP途徑（r16）。同時(shí)，流向分支酸的代謝流量為34.1%（r17）。而在膜過濾后（階段2），有86.34%的碳架進(jìn)入EMP（r2）途徑，而27.3%的碳架由F6P和GAP通過轉(zhuǎn)酮酶催化生成X5P和E4P進(jìn)入HMP途徑（r16）。流向分支酸的代謝流量為33.3%（r17）。膜過濾前后L-色氨酸的代謝流量分別為31%、30.2%。這表明采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，膜過濾后與膜過濾前流向色氨酸的代謝流變化不大，細(xì)胞能保持較高的色氨酸生產(chǎn)速率。

圖5 膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝對糖酸轉(zhuǎn)化率的影響

表1 膜過濾前（階段1）與膜過濾后（階段2）物質(zhì)濃度及其變化規(guī)律

表2 L-色氨酸生物合成代謝流分布

3 討論

傳統(tǒng)的發(fā)酵生產(chǎn)色氨酸的技術(shù)，不能解決發(fā)酵中后期乙酸積累的問題。采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，可以解決底物與代謝副產(chǎn)物的抑制問題，提高目的產(chǎn)物的產(chǎn)量。目前，膜偶聯(lián)發(fā)酵技術(shù)已經(jīng)得到廣泛應(yīng)用[13]。例如在琥珀酸發(fā)酵生產(chǎn)過程中，發(fā)酵的同時(shí)采用外部纖維過濾器分離細(xì)胞，解決了產(chǎn)物琥珀酸的反饋抑制作用，得到了高細(xì)胞密度，并且提高了琥珀酸的產(chǎn)量[14]。

本實(shí)驗(yàn)采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，在發(fā)酵罐內(nèi)乙酸積累量達(dá)到抑制水平時(shí)開始透析，之后補(bǔ)加透析培養(yǎng)基繼續(xù)進(jìn)行發(fā)酵，可以顯著降低發(fā)酵罐內(nèi)乙酸與谷氨酸的積累量。采用膜偶聯(lián)發(fā)酵工藝，整個(gè)發(fā)酵過程中流向色氨酸的代謝流一直保持在發(fā)酵中期較高水平，菌體生物量提高了3.4%，產(chǎn)酸周期延長了12 h，糖酸轉(zhuǎn)化率提高了6.9%。本實(shí)驗(yàn)是在單一發(fā)酵罐中進(jìn)行的，實(shí)際上可以連接二級、三級發(fā)酵罐，依次進(jìn)行連續(xù)發(fā)酵，這有待于進(jìn)一步的研究。

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Study on the L-Tryptophan Fermentation Progress Coupled with the Membrance Separation and Extraction Progress Technology

LIU Zhen-Yu,LIU Zi-Qiang,CAI Meng-Meng,CHEN Ning,XU Qing-Yang*
National and Local United Engineering Lab of Metabolic Control Fermentation Technology;Tianjin Engineering Lab of Efficient and Green Amino Acid Manufacture;College of Biotechnology,Tianjin University of Science and Technology;Tianjin 300457,China

Objective:To couple the fermentation process with the membrane separation and extraction process, so as to prolong the the whole L-tryptophan production period and reduce the accumulation of acetic acid and increase the production of target product and reduce the accumulation of the repressor.Methods:The membrane separation and extraction process was started when the amount of acetic acid reached 5 g/L and the fermentation time lastet for 21 h.The fermentation was continued when the dialysis medium was added.Results:With the application of membrane coupled fermentation technology,the biomass increased by 3.4%,and the accumulation of glutamic acid decreased by 54.34%,and the accumulation of acetic acid decreased by 55.36%.The whole acid production period extended 12 h,and the glucose conversion rate improved 6.9%.Conclusion:The application of membrane coupled fermentation technology can significantly increase the production of tryptophan and reduced the accumulation of the repressor.The whole L-tryptophan production period was prolongated,and the glucose conversion rate has improved.

附表1 化學(xué)計(jì)量平衡式

附表2 代謝節(jié)點(diǎn)反應(yīng)速率方程

附表3 縮寫說明表

Q935

A

1009-0002（2017）03-0313-06

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.014

2016-12-19

天津市科技支撐計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（14ZCZDSY00015）；天津市科技特派員項(xiàng)目（15JCTPJC57000）

劉鎮(zhèn)瑜（1990-），男，碩士研究生，（E-mail）1905302718@qq.com

徐慶陽，（E-mail）xuqingyang@tust.edu.cn

*Corresponding author,E-mail:xuqingyang@tust.edu.cn