霍亂O139血清群多糖結合疫苗的生物合成研究

黃競，董巖，潘超，胡顯文，曾明，吳軍，朱力，王恒樑

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.中國食品藥品檢定研究院 衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 100050

霍亂O139血清群多糖結合疫苗的生物合成研究

黃競1，董巖2，潘超1，胡顯文1，曾明2，吳軍1，朱力1，王恒樑1

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.中國食品藥品檢定研究院 衛生部生物技術產品檢定方法及其標準化重點實驗室，北京 100050

目的：霍亂是由霍亂弧菌引起的一種烈性傳染病，其防治已成為一個全球性的公共衛生問題。其中1992年出現的O139血清群是除O1外另一種病原體，發病數日益增多。因此，有必要尋找一種安全有效適用于各種人群的疫苗。方法：敲除霍亂弧菌O139血清群93-3株脂多糖合成途徑中O抗原連接酶基因waaL，在周間質產生游離的多糖，之后轉入包含來自腦膜炎奈瑟球菌的糖基轉移酶和霍亂毒素B亞單位（CTB）編碼序列的共表達載體，經IPTG誘導后制備全菌蛋白樣品，利用抗His抗體檢測糖蛋白的表達，利用Ni柱和離子交換柱對糖蛋白進行純化，并對其進行糖定量和蛋白定量。結果：以未糖基化、相對分子質量約為14×103的底物蛋白CTB為對照，當共表達CTB和糖基轉移酶PglL時，通過Western印跡可檢測到相對分子質量約為20×103的糖基化蛋白，經Ni柱及陽離子交換柱純化，得到純度較高的O139群霍亂O抗原多糖結合蛋白，其純度約為84.2%，并計算得其糖-蛋白比為0.103∶1。結論：通過生物法合成了一種霍亂O139血清群的多糖結合疫苗，為后續進行動物評價打下了基礎。

霍亂弧菌；多糖結合疫苗；O-糖基化；糖蛋白

霍亂是因感染霍亂弧菌而引起的烈性傳染病，臨床主要表現為急性腹瀉，被世界衛生組織（WHO）定為必須國際檢疫的傳染病。在我國，霍亂和鼠疫是僅有的2種甲類傳染病。歷史上，霍亂有過7次世界大流行。根據表面O抗原的不同，霍亂弧菌被分為200多個血清群，WHO腹瀉控制中心認定O1和O139血清群是引起霍亂的病原體。O139血清群霍亂是自1992年從印度半島開始流行的一種新型霍亂，在抗原性方面與O1血清群無交叉[1]。近年來O139群霍亂發病數日益增多，2002年度O139群霍亂的發病例數占同年霍亂發病總例數的36.0%，我國于1993年5月首次在新疆阿克蘇地區發現O139群霍亂病例[2]。

O139群霍亂弧菌產生的O抗原莢膜較薄，莢膜多糖（capsule polysaccharide，CPS）由較長的糖單位聚合而成，其結構與脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）的O糖單位相同，但不連接于LPS的核心結構[3]。當一個O抗原多糖（O-antigen polysaccharide，OPS）單位連接于脂質A核心多糖結構，形成LPS，而未連接于LPS的O139側鏈重復單位則構成莢膜多糖[4]。研究表明，O139血清群中與脂質核心連接的OPS在免疫應答中對于誘導血清抗體具有最重要的作用，而CPS僅具有很微弱的免疫原性[5]。

霍亂弧菌的主要毒力因子是霍亂毒素（cholera toxin，CT），它包括A和B亞單位。其中，霍亂毒素B亞單位（CTB）是無毒的同源五聚體，能與大多數哺乳動物細胞表面都有的神經節苷脂GM1特異性結合,刺激機體產生黏膜IgA。CTB可以誘導強烈的體液免疫，中和體內的霍亂毒素，而且最近的研究表明，CTB可以在體內引起抗炎癥機制[6]。已經證實CTB是一種很好的黏膜佐劑,能夠誘導機體產生黏膜免疫反應，具有加強抗原表位抗原性的特點。因此，CTB常被選作多肽疫苗的佐劑，特別是作為黏膜免疫的佐劑[7]。

腦膜炎奈瑟球菌糖基轉移酶PglL可單獨催化腦膜炎奈瑟球菌Ⅳ型菌毛蛋白PilE發生O糖基化，它有著寬松的底物特異性，并可以轉移多種外源的聚糖，其糖基化過程與細菌LPS合成具有很大的相似性，均是在酶的催化下對糖的轉移：LPS合成中，多糖在O抗原連接酶催化下與脂質A核心相連；而蛋白糖基化則是在糖基轉移酶催化下將多糖轉移至底物蛋白[8]。因此，我們可以通過改造其LPS合成路徑，并轉入蛋白糖基化系統，使OPS轉移到適當的底物蛋白，從而制備多糖結合疫苗。相比于傳統的化學合成方法，生物法能夠一步合成，合成效率高，產品均一性強。

我們通過同源雙交換方法敲除了霍亂弧菌O139血清群93-3株LPS合成途徑中的O抗原連接酶waaL，使其產生游離的OPS，之后轉入含有PglL和底物蛋白CTB編碼序列的融合表達載體，誘導表達合成霍亂糖蛋白，并對其進行初步純化分析，為下一步的動物評價打下了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

霍亂弧菌O139血清群93-3株（CMCC編號，Smr)由中國醫學細菌保藏管理中心提供；大腸桿菌DH5αλpir（含有λpir系統，用于克隆和富集重組自殺質粒）、SM10λpir（含有λpir系統及性菌毛，可作為接合轉移的供體菌，Kmr），自殺質粒pWM91（含有sacB位點，Apr）由中國疾病預防控制中心惠贈；低拷貝質粒pAK（Kmr）、O-糖基轉移酶PglL和底物蛋白CTB的融合表達載體pET28atac-pgIL-tac-CTB4573N（Kmr）、底物蛋白CTB表達載體pET28a-tac-CTB（Kmr）由本實驗室構建；快速DNA產物純化試劑盒、高純度質粒小提試劑盒、純化柱Ni-agarose Resin購自康為世紀公司；2× TransTaqHiFi PCR Super MixⅠ、ProteinRulerⅡ（12～120 kD）、Blue PlusⅡProtein Marker（14～120 kD）購自全式金生物公司；限制性內切酶SpeⅠ、XhoⅠ、BamH I、SalⅠ，10×緩沖液，除鹽柱Zeba Spin Desalting Columns，蛋白定量試劑盒Micro BCA Protein Assay Kit購自Thermo Scientific公司；T4DNA連接酶、10×T4DNA連接酶緩沖液購自TaKaRa公司；氨芐西林、卡那霉素、鏈霉素購自Sigma公司。

1.2 霍亂93-3株waaL基因缺失株與回復株的構建與驗證

以NCBI霍亂弧菌標準菌株El Tor N16961基因組waaL基因及上、下游序列作為模板設計引物，采用Primer 5.0軟件完成（表1）。b和c引物包含10～20 bp互補序列，之后進行融合PCR連接waaL上、下游基因片段，純化片段經SpeⅠ、XhoⅠ雙酶切后連入經相同酶切的pWM91質粒，利用同源雙交換方法構建突變株93-3ΔwaaL。之后利用引物waaLout-P1和waaLout-P2，以93-3基因組DNA為模板擴增waaL基因、自身啟動子和上下游序列，通過BamHⅠ和SalⅠ酶切，連接構建回復質粒pAK-waaL，并電擊轉化93-3ΔwaaL感受態，從而構建回復株93-3waaLH。用waaL基因內部引物（waaLin-P1/waaLin-P2）、外部引物（waaLout-P1/waaLout-P2）、霍亂弧菌毒素協同調節菌毛基因引物（tcpA-P1/tcpA-P2）進行PCR驗證。

1.3 霍亂O-連接糖基化修飾途徑工程菌的構建與IPTG誘導表達及檢測

將質粒pET28a-tac-pgIL-tac-CTB4573N、pET28atac-CTB分別電擊轉化93-3ΔwaaL感受態細胞，用卡那霉素抗性平板篩選陽性克隆，獲得重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N和 93-3ΔwaaL/ pET28a-CTB。將上述重組菌株及缺失株按1∶100接種于LB液體培養基中，37℃搖床培養至D600nm達0.5左右，再加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，30℃搖床培養12 h后收菌。參照《精編分子生物學實驗指南》收集菌液制備SDS-PAGE樣品，各取10 μL上樣，經考馬斯亮藍染色和Western印跡檢測。

表1 引物及序列

1.4 霍亂O-糖蛋白復合物的初步分離純化

將30℃誘導12 h的93-3ΔwaaL/pET28a-tacpgIL-tac-CTB4573N離心收菌，用A1液［20 mmol/L Tris-HCl（pH7.5），0.5 moL/L NaCl，10 mmol/L咪唑］重懸菌體，超聲破菌（超聲4 s暫停5 s，累計超聲2 h），離心收集上清，即為含霍亂弧菌O139血清群OPS修飾的CTB融合蛋白CTB4573N-OPS的粗提液。用Ni-agarose Resin初步純化樣品并除鹽，用陽離子交換柱進一步純化，考馬斯亮藍染色及Western印跡檢測，用Image J軟件對考馬斯亮藍染色圖進行灰度分析，以確定樣品純度。

1.5 霍亂O-糖蛋白復合物的糖定量和蛋白定量

收集純度較好的樣品濃縮，稀釋至1/20后用蒽酮-硫酸法測定樣品中的糖含量，用蛋白定量試劑盒測定蛋白含量，并計算糖-蛋白比。

2 結果

2.1 霍亂93-3株O抗原連接酶缺失株的構建

用waaL基因內部引物、外部引物及霍亂弧菌特有的毒素協同調節菌毛基因引物進行PCR驗證，結果如圖1。用內部引物進行PCR驗證時，僅野生株和回復株可以擴增得到483 bp片段；用外部引物驗證時，野生株93-3的擴增產物為1271 bp，缺失株93-3ΔwaaL由于缺失了waaL基因，其擴增產物為591 bp，而93-3ΔwaaLH由于在缺失株的基礎上導入包含waaL基因及上、下游調控序列的質粒，所以擴增產物含有1271和591 bp片段。用霍亂弧菌毒素協同調節菌毛基因引物驗證時，野生株、缺失株和回復株的擴增產物均為675 bp。PCR結果表明waaL缺失株構建成功。

2.2 霍亂弧菌中建立O-糖基化系統

圖1 93-3野生株、缺失株和回復株的PCR驗證M：DNA marker；1：93-3；2：93-3ΔwaaL；3：93-3ΔwaaLH

經IPTG誘導糖基化途徑表達后，對重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N、93-3ΔwaaL/ pET28a-CTB和缺失株93-3ΔwaaL中的糖蛋白進行檢測，Western印跡結果如圖2。93-3ΔwaaL由于不含糖基化系統，因此在Western印跡中無條帶；而93-3ΔwaaL/pET28a-CTB只表達帶有His標簽的CTB，相對分子質量（Mr）約為14×103；93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N在表達CTB的同時表達糖基轉移酶PglL，使多糖轉移到底物蛋白，93-3的LPS僅含一個多糖重復單位，可看到Mr增大，且幾乎所有底物蛋白均被糖基化。在Mr約20×103處出現2條帶，可能是由于糖基化干擾影響信號肽的切割。此結果表明，在重組菌93-3ΔwaaL/pET28a-pgIL-CTB4573N中，可以由IPTG誘導糖基化途徑表達并生成糖蛋白。

2.3 霍亂O-糖蛋白復合物的初步純化及檢測

鎳柱純化后的糖蛋白再經離子交換，考馬斯亮藍染色及灰度分析結果表明目標蛋白兩峰的純度約為84.2%，說明目標蛋白經Ni純化柱和離子交換柱后分離效果較好，除去了大部分雜蛋白。對所得產物進行Anti-His Western印跡，蛋白純度較高，均一性較好。結果見圖3。

2.4 霍亂O-糖蛋白復合物的糖定量和蛋白定量

圖2 CTB及糖基化修飾的SDS-PAGE與Anti-His Western印跡

對純化濃縮的糖蛋白進行糖定量和蛋白定量，標準曲線見圖4，曲線R2均大于0.99，可用于定量分析。根據標準曲線計算，CTB4573N-OPS樣品中糖濃度約為150μg/mL，蛋白濃度約為1450 μg/mL。由于天然的CTB并沒有O-糖基化位點，因此當融合1個糖基化位點后產生1個糖蛋白，故純化產物中糖和蛋白的摩爾比為1∶1；而93-3株的OPS僅1個單位，因此產物中糖與蛋白的質量比為0.103∶1。

3 討論

目前，國際上已獲批準的霍亂疫苗中，只有Shanchol（包括霍亂O1群埃爾托型和O139群菌株滅活全細胞的口服二價疫苗）對O139群霍亂有保護性，臨床試驗表明，此疫苗對于O1和O139血清群的血清殺弧菌抗體滴度分別為91%和11%[9]，證明O1血清群的免疫原性強于O139血清群。盡管嬰幼兒是霍亂的高發群體，但在印度加爾各答的試驗中發現Shanchol在所有年齡段的受試群體中保護作用為45%，在5歲以下兒童中的保護作用僅為17%[10]。有報道，目前獲得許可的口服霍亂疫苗對兒童的免疫效果和持續時間都明顯低于成年人[11]。因此，有必要研發一種保護時間長、效果好，且能在5歲以下嬰幼兒中產生保護作用的霍亂O139血清群的疫苗。

圖3 CTB4573N-OPS純化結果的SDS-PAGE、灰度分布圖及Anti-His Western印跡

圖4 糖定量和蛋白定量標準曲線

對于霍亂而言，LPS既是毒力因子，又是重要的保護性抗原，霍亂弧菌O1血清群的LPS在人體和實驗動物中被證明可以誘導產生保護性免疫應答，因此將LPS作為保護性免疫原用于霍亂疫苗的思路被廣泛認可。但LPS是Ⅰ類T細胞非依賴性抗原，在高水平時，純化的LPS可以激活B細胞，產生多種抗體；低水平時，僅在霍亂全細胞或外膜囊泡存在的情況下，LPS才會誘導產生LPS特異性的IgM和IgG抗體[12-13]。O抗原多糖是LPS中最重要的免疫原性結構，它可以產生一種基于抑制菌體運動性的保護性機制，以阻止霍亂的成功克隆。霍亂弧菌有一個單極的鞭毛，鞭毛外部包被著包含LPS分子的外膜護鞘。在其他實驗中，有學者證明只有抗O抗原的抗體，而非直接針對主要的鞭毛亞基FlaA和外膜蛋白的抗體，能有效抑制霍亂弧菌的運動性[13]。LPS在動物模型中產生的抗體有明顯的保護作用，在志愿者試驗中也獲得證實，此抗體是主要的殺弧菌抗體[3]。因此我們將O抗原與底物蛋白CTB以生物法連接，其中底物蛋白CTB既是黏膜佐劑，又是抗原。因為在霍亂弧菌的所有血清群中，僅有O1和O139血清群會產生與傳染性霍亂相關的霍亂毒素，所以CTB也能刺激機體產生重要的抗毒抗體。此CTB4573N-OPS糖蛋白作為疫苗可以提供更好的保護性并延長了保護時間，且能在5歲以下的嬰幼兒中產生免疫保護。

綜上，我們介紹了一種O139群霍亂多糖-蛋白結合疫苗的構建思路，并對糖蛋白進行了初步分析和純化，獲得了純度較高的樣品。但目前看來，仍有必要對其進一步改造和探索。O抗原糖鏈能夠影響致病菌的抗原性并不同程度地刺激免疫系統，一般來說，O抗原糖鏈越長，其免疫原性越高[14]。可能正是由于霍亂弧菌O1血清群包含12～18個OPS單糖重復單位，而O139血清群的O抗原僅有1個糖單位，所以O139血清群的免疫原性更弱。本文所介紹的糖蛋白疫苗因為菌株本身原因，糖鏈過于短，糖-蛋白比過低。后續，可以通過導入外源的控制LPS合成中O抗原糖鏈延長的基因，嘗試增加O抗原糖鏈的長度，并通過動物實驗觀察疫苗的效果差異，以提高霍亂弧菌O139血清群疫苗的保護效果。

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Study of Vibrio cholerae O139 Serotype Polysaccharides Bio-Conjugated Vaccine

HUANG Jing1,DONG Yan2,PAN Chao1,HU Xian-Wen1, ZENG Ming2,WU Jun1,ZHU Li1,WANG Heng-Liang1*

1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;
2.Institute for Biological Product Control,National Institutes for Food and Drug Control,Beijing 100050;China

*Corresponding author,E-mail:wanghl@nic.bmi.ac.cn

Objective:Cholera is still a major global health problem,Vibrio choleraeO139 serotype emerged as a second aetiologic agent of cholera in 1992.It is necessary to find a safe and effective vaccine to control it.Methods:We constructedV.choleraeO139 group 93-3 strain containing a delection in O-antigen ligasewaaL, and free polysaccharides were produced in the periplasm.Then introduced the co-expression plasmid ofNeisseria meningitidisO-oligosaccharyltransferase PglL and cholerae toxin B subunit（CTB）to the genetically modified strain. After IPTG induction,the samples were prepared and the expression of glycoprotein was detected by anti His antibody.The target protein was further purified by Ni affinity column and cationic exchange column and quantify polysaccharide and protein content.Results:The substrate protein CTB,which was non glycosylation and relative molecular weight of about 14 kD,was used as control.When the co-expression of CTB and glycosyltransferasePglL,through the Western blot can detect the relative molecular weight of glycosylated protein is about 20 kD.Purified by Ni affinity column and cationic exchange column,we obtained O139 group of cholera O antigen polysaccharide binding protein with purity of 84.2%,and calculate the sugar protein ratio was 0.103∶1.Conclusion:We synthesized a polysaccharide conjugate vaccine by biological method,which laid the foundation for the subsequent animal evaluation.

Vibrio cholerae;polysaccharide conjugate vaccine;O-linked glycosylation;glycoprotein

Q78

A

1009-0002（2017）03-0281-05

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.008

2017-01-03

國家自然科學基金（81373316）；國家重點基礎研究發展計劃（2013CB910804）

黃競（1991-），女，碩士研究生，（E-mail）1041526187@qq.com

王恒樑，（E-mail）wanghl@nic.bmi.ac.cn