MSC與S1P聯用對急性損傷的肺內皮細胞中S1P代謝相關酶的表達調控

劉慧瑩，李文斐，張自麗,2，鄭敬，衡芝芝，李璞媛，苑鑫，牛文凱，柏長青

1.解放軍307醫院 呼吸與危重癥醫學科，北京 100071；2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；

3.第四軍醫大學 航空航天醫學系，陜西 西安 710032

MSC與S1P聯用對急性損傷的肺內皮細胞中S1P代謝相關酶的表達調控

劉慧瑩1，李文斐3，張自麗1,2，鄭敬1，衡芝芝1，李璞媛1，苑鑫1，牛文凱1，柏長青1

1.解放軍307醫院 呼吸與危重癥醫學科，北京 100071；2.安徽醫科大學，安徽 合肥 230032；

3.第四軍醫大學 航空航天醫學系，陜西 西安 710032

目的：探究間充質干細胞（MSC）與鞘氨醇-1-磷酸（S1P）聯用對急性肺損傷發生過程中S1P代謝相關酶的表達調控作用。方法：構建脂多糖（LPS）刺激的急性損傷的肺內皮細胞模型，與MSC及S1P非接觸共培養后，利用細胞實時無標記系統，考察MSC與S1P聯用對損傷細胞微電子阻抗的增強保護作用，利用RT-PCR考察兩者對損傷細胞中S1P代謝相關酶的表達調控作用。結果：MSC與S1P聯用與單獨使用時相比，作用靶點和效果有顯著差別，MSC單獨使用時僅下調鞘氨醇激酶1（SphK1）、S1P裂解酶（S1PL）和鞘磷脂合成酶1（SMS1）的表達，但當將MSC和S1P聯合使用時，其對S1PL的下調作用喪失，而鞘氨醇激酶2（SphK2）和鞘磷脂合成酶2（SMS2）的表達明顯下調。結論：MSC作為一種潛在的治療手段，可以同時作用于多個S1P代謝相關基因，而且其與S1P的聯用對相關基因的表達調控并不是簡單的作用疊加，而是表現出更為顯著的治療結果。本研究為進一步探討MSC與S1P聯用，通過改善內皮屏障的生物學功能對急性肺損傷的治療作用及可能的協同機理奠定了實驗基礎。

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合癥；間充質干細胞；鞘氨醇-1-磷酸

急性肺損傷和急性呼吸窘迫綜合征（acute lung injury and acute respiratory distress syndrome，ALI/ARDS）在20世紀60年代首次被公認為一種臨床綜合征，表現為低氧血癥、雙肺浸潤的嚴重急性呼吸衰竭，常見于肺炎、膿毒血癥、重大創傷，病死率高達30%～40%[1]。在迄今為止的臨床試驗所評價的大批治療藥物中，并沒有哪一種被證實是有效的，也沒有任何一種可以被推薦為ALI/ARDS的標準治療[2]。ALI/ARDS當前的治療方案主要是支持治療，給予肺保護性通氣以及藥物保守治療[3-4]。機械通氣是一種必要的和救命的治療手段，但是有可能會延緩炎癥反應，并最終導致肺內皮屏障功能障礙。內皮屏障功能障礙會導致通透性增加、富含蛋白質的液體外滲和肺水腫，這些都是ALI/ARDS的普遍癥狀[5]。目前尚無旨在改善嚴重肺水腫患者肺內皮屏障功能的臨床治療手段[6]，開發可保護內皮屏障完整、穩定氣體交換的治療手段越來越受到關注。

鞘氨醇-1-磷酸（sphingosine-1-phosphate，S1P）是一種普遍存在的、具有生物活性的神經鞘磷脂。它主要存在于血漿和組織中，并具有增強內皮屏障抵抗能力的功能，在體內是血管內皮細胞通透性和體液平衡的重要調節者。S1P介導的內皮屏障增強需要通過S1P受體、激活Gi，以及Rac1這一信號通路完成[7]。研究發現S1P在呼吸系統過敏性反應中具有重要作用，S1P能夠促進內皮細胞黏附連接組裝，這是內皮屏障保持、避免肺水腫通透性增加的關鍵[8]。2010年美國FDA批準S1P結構類似物FTY720用于治療多發性硬化。FTY720與S1P在受體結合活性上略有差異，但二者在高劑量濃度下均有較強的副作用[9]，表明在肺部疾病治療中S1P受體的選擇性以及濃度的穩態控制應是需要關注的焦點。

越來越多的研究表明，生理濃度的S1P對于維持內皮屏障功能具有重要作用，無論是S1P自身還是其結構的類似物，它們在臨床治療上的局限性都再一次證實了鞘脂生物穩態的概念，即S1P濃度的穩態平衡決定細胞的命運[10]。S1P作為內源性的生物活性分子，是血管內皮細胞通透性和體液平衡的重要調節者，它的合成代謝，以及信號通路中的關鍵分子在ALI/ARDS的治療中依然是潛在的治療靶點和研究熱點。

目前的臨床研究發現，對于急性肺損傷產生的嚴重病理損傷，不太可能有任意單一藥物能逆轉這一過程并迅速起到良好的臨床效果。因此，越來越多的目光將ALI/ARDS的治療手段集中在細胞治療，尤其是間充質干細胞治療方面。

間充質干細胞（mesenchymal stem cells，MSC）是一種多能的，具有自我更新能力的細胞，最早發現自骨髓，可以分化為骨、軟骨、脂肪、肌肉等組織。MSC目前已在肝硬化[11]、系統性紅斑狼瘡[12]等疾病的臨床治療中取得了很好的療效，在克羅恩病[13]、外傷性腦損傷[14]、膿毒血癥[15]、急性腎衰竭[16]等疾病的臨床前研究中也取得了治療效果。近年里，也有很多研究報道了在一些肺部疾病的動物模型中，異體移植MSC治療可以減輕肺部病變[17-19]。

近年MSC應用于ALI/ARDS的研究大多集中于對治療效果的評價，沒有進一步深入討論MSC的免疫調節作用對肺組織細胞，特別是內皮細胞屏障功能的影響，MSC對于S1P代謝的調控也缺乏系統全面的研究。由于S1P在體內的穩態控制是其改善內皮屏障、治療急性肺損傷的前提條件，S1P的合成代謝過程可以受多種細胞因子的調節，而MSC在多種疾病的應用結果顯示其能夠有效分泌多種生長因子和炎癥因子，發揮免疫調節作用。此外也有研究表明，S1P能夠促進MSC在體外的分化[20]，這就提示我們在MSC與S1P治療ALI/ARDS過程中是否存在某種協同作用，一方面發揮S1P增強內皮屏障的生理功能，以及通過MSC的增殖再生及抗炎作用，調節宿主對損傷的免疫應答，治療ALI/ARDS；另一方面發揮S1P對MSC促分化作用，更好地促進MSC的免疫調節能力，通過MSC對S1P相關受體或代謝酶的表達，增強S1P功能，促進體內S1P的穩態平衡，改善內皮屏障，治療ALI/ARDS。

在此，我們通過構建脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）誘導的急性損傷肺內皮細胞模型，考察了MSC在治療急性肺損傷過程中對S1P代謝相關酶的表達調控作用，探討MSC與S1P聯用，通過改善內皮屏障的生物學功能對急性肺損傷的治療作用及可能的協同機理，為急性肺損傷的臨床治療提供理論依據和實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

S1P購自Sigma-Aldrich公司，溶解于甲醇中，-20℃保存；LPS（大腸桿菌O55:B5）購自Sigma-Aldrich公司，溶解于生理鹽水中，-20℃保存。

1.2 細胞培養

無菌條件下取新生兒臍帶，浸入含105U/L青霉素、100 mg/L鏈霉素的D-Hanks液中，沖洗去除臍靜脈及動脈內的殘存血，加入膠原酶Ⅳ消化液，37℃消化2 h，過濾獲得MSC單細胞懸液；細胞計數后按2.5×104～4×104/cm2的密度，用10 mL MSC培養基（Thermo Fisher公司）重懸接種到100 mm的培養皿中，于37℃、5%CO2細胞培養箱中進行原代培養，7～9 d后根據細胞的整體生長情況和局部密度進行第一次傳代；繼續培養待密度達80%以上，重復以上操作，傳代培養至3～5代，用于后續實驗。人肺動脈內皮細胞（human pulmonary artery endothelial cells，HPAEC）購自ScienCell公司，用內皮細胞培養基（ScienCell公司），于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，5～8代用于后續實驗。

1.3 細胞的急性損傷

取5～8代HPAEC，按2×104/孔（100μL/孔）接種至16孔E-Plate培養板（ACEA Biosciences公司），同時加入終濃度分別為0、0.5、1、2、5μmol/ L的LPS，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養12 h，通過實時檢測HPAEC微電子阻抗，考察不同濃度LPS對HPAEC的急性損傷作用效果。

取5～8代HPAEC，按1×105/孔（600μL/孔）接種至24孔細胞培養板（Corning公司），同時加入終濃度為1μmol/L的LPS，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養6～12 h，收集不同時間的細胞，通過檢測α腫瘤壞死因子（TNFα）表達的變化，考察不同時間條件下LPS對HPAEC的急性損傷作用效果。

1.4 細胞共培養

取5～8代HPAEC，按2×104/孔（100μL/孔）接種至16孔E-Plate培養板，加入終濃度為1μmol/ L的LPS，同時在16孔E-Plate Insert（ACEA Biosciences公司）內接種60μL含不同比例（HPAEC∶MSC分別為1∶1、1∶2、1∶4）的MSC，將Insert放入Receiver Plate（含100μL MSC培養基），將EPlate和Receiver Plate置于37℃、5%CO2細胞培養箱中分別培養12 h，棄去E-Plate內的培養基，更換為100μL新鮮的內皮細胞培養基，同時用對應的Receiver Plate中的MSC培養基將每個Insert內培養基補至60μL，將Insert放置于E-Plate內，共培養8～24 h，通過實時檢測HPAEC微電子阻抗，考察MSC對HPAEC急性損傷的治療效果。

取5～8代HPAEC，按1×105/孔（600μL/孔）接種至24孔細胞培養板內，加入終濃度為1μmol/L的LPS，同時在24孔Transwell培養板（0.4μm Polyester Membrane，Corning公司）上室內接種100μL含不同比例（HPAEC∶MSC分別為1∶1、1∶2、1∶4）的MSC，下室內放置600μL的MSC培養基，將24孔細胞培養板和Transwell培養板置于37℃、5%CO2細胞培養箱中分別培養12 h，棄去細胞培養板內的培養基，更換600μL新鮮的內皮細胞培養基，同時用對應的Transwell培養板下室的MSC培養基將每個Transwell上室內培養基補齊至100μL，然后將Transwell上室放置于含造模損傷HPAEC的24孔細胞培養板內，共培養8～24 h，收集HPAEC，通過TNFα表達的變化，考察MSC對HPAEC急性損傷的治療效果。

1.5 細胞微電子阻抗檢測

將16孔E-Plate培養板放置于Xcelligence RTCA DP（ACEA Biosciences公司）系統上，于37℃、5%CO2細胞培養箱中培養，按照制造商說明書進行操作檢測。

1.6 實時定量PCR

收集HPAEC，用RNeasy Mini Kit（Qiagen公司）提取總 RNA，取 1μg RNA為模板，用QuantScript RT Kit（TIANGEN公司）進行反轉錄反應，然后用 SuperReal PreMix SYBR Green（TIANGEN公司）和Bio-Rad iQ 5 Multicolor Real-Time PCR Detection System，以GAPDH為內參進行實時熒光定量檢測，所需引物見表1。mRNA相對表達水平采用2-ΔΔCt方法計算。

1.7 統計學分析

全部實驗數據以x±s表示，多組結果比較采用單因素方差分析 one-way ANOVA（Dunnett tes），應用GraphPad Prism 6.0軟件系統分析。若P＜0.05，則定義為有顯著性差異。

2 結果與討論

2.1 1μmol/L LPS作用于HPAEC后12 h可形成急性損傷

LPS被廣泛用于急性肺損傷模型的制備，但尚無標準方法。已有文獻表明，LPS所致急性損傷會引起明顯的內皮細胞屏障紊亂、通透性增加，同時伴隨多種生長因子和炎癥因子的異常表達，尤其是TNFα的表達會顯著上調[21]。我們以終濃度分別為0、0.5、1、2、5μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h，利用實時無標記細胞檢測（real time cellular analysis，RTCA）系統實時檢測內皮細胞微電子阻抗（microelectrode resistance）的變化，以此來反映內皮細胞屏障功能的變化。結果表明，與其他濃度相比，1μmol/L的LPS作用于HPAEC后，細胞的微電子阻抗明顯下降，說明1 μmol/L的LPS對HPAEC的急性損傷效果更為顯著（圖1）。進一步，我們用終濃度為1μmol/L的LPS刺激HPAEC不同時間后，收集細胞，檢測細胞內TNFα的表達變化。結果表明，1μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h后，TNFα的表達明顯上調（圖2）。上述結果說明1μmol/L的LPS刺激HPAEC 12 h后可形成明顯的急性損傷細胞模型，可用于后續實驗研究。

2.2 不同比例的MSC作用于HPAEC對急性損傷的治療效果不同

在24孔細胞培養板內接種HPAEC，利用LPS造模損傷后，按細胞治療時間不同分為4組，即對照組和8、16、24 h治療組，分別與MSC進行非接觸共培養后收集各組細胞，RT-PCR考察不同條件下HPAEC內TNFα的表達變化。結果表明，MSC治療在內皮細胞模型上對急性損傷的有效治療時間窗為8 h（圖3）。在此基礎上，按照細胞治療劑量不同分為4組，即對照組，HPAEC與MSC接種比例分別為1∶1、1∶2、1∶4治療組，與LPS造模損傷后HPAEC非接觸共培養8 h后收集細胞，RT-PCR考察不同條件下HPAEC內TNFα的表達變化。結果表明，細胞移植劑量并非越多越好，HPAEC與MSC的比例為1∶2時治療效果最佳（圖4）。同時細胞實時無標記檢測結果也表明，HPAEC與不同數量比例的MSC共培養后，與對照組相比，HPAEC的微電子阻抗顯著升高，在10 h左右達到峰值，HPAEC與MSC比例為1∶2治療組的微電子阻抗值最高。但在15 h后對照組細胞的微電子阻抗則明顯高于各治療組（圖5），這一結果也與TNFα的表達變化一致，說明不同劑量的MSC作用于HPAEC對急性損傷的治療效果不同，而且治療時間為8～10 h最佳。

表1 引物序列

圖1 1μmol/L LPS作用于HPAEC不同時間后TNFα的表達變化（*P＜0.05）

圖2 不同濃度LPS作用于HPAEC后細胞微電子阻抗的變化

圖3 MSC與急性損傷的HPAEC共培養不同時間后HPAEC內TNFα的表達變化（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖4 不同比例的MSC與急性損傷的HPAEC共培養不同時間后TNFα的表達變化（*P＜0.05，**P＜0.01）

圖5 不同比例的MSC與急性損傷的HPAEC共培養后微電子阻抗的變化

2.3 0.5μmol/L S1P作用于HPAEC對急性損傷的治療效果最為明顯

S1P生理濃度為0.2～1.1μmol/L時，可有效增強血管內皮屏障功能。我們利用HPAEC為靶細胞建立急性損傷模型，在培養環境中并不存在S1P。為了更好地考察S1P對急性損傷的保護作用，及其與MSC在治療急性損傷過程中可能存在的協同作用，我們將HPAEC接種于16孔E-Plate培養板中，在給予終濃度為1μmol/L LPS刺激的同時，分別給予終濃度為0、0.5、1、2、5μmol/L的S1P，利用RTCA實驗考察LPS對HPAEC的急性損傷效果，結果表明，生理濃度下的S1P（0.5和1 μmol/L）可以有效增強HPAEC的微電子阻抗（圖6）。在此基礎上，我們將HPAEC接種于16孔EPlate培養板中，加入終濃度為1μmol/L的LPS損傷造模，同時在16孔E-Plate Insert內接種2倍數量的MSC，在37℃、5%CO2細胞培養箱中分別培養12 h后棄去含LPS的培養基，上下室內均加入終濃度為0、0.5、1、2、5μmol/L的S1P共培養，利用RTCA實驗考察對HPAEC急性損傷的治療效果。結果表明，生理濃度下的S1P（0.5和1μmol/ L）可以有效增強HPAEC的微電子阻抗，改善LPS對HPAEC的損傷作用（圖7），而且這2組數據都表明，無論是單獨使用還是與MSC聯合使用，0.5 μmol/L的S1P對細胞微電子阻抗的增強作用均優于 1 μmol/L。此外，利用 Transwell實驗，將 1μmol/L LPS損傷12 h后的 HPAEC與2倍數量的MSC，在終濃度為0.5μmol/L S1P的體系中共培養8 h，收集HPAEC，檢測TNFα的表達變化情況，發現與單獨使用MSC相比，MSC與S1P聯用對TNFα表達的下調作用更為明顯（圖8）。

圖6 不同濃度的S1P與LPS共同作用對急性損傷后HPAEC微電子阻抗的影響

圖7 不同濃度的S1P與MSC共同作用對急性損傷后HPAEC微電子阻抗的影響

2.4 MSC與S1P對急性損傷的協同治療與MSC單獨治療的作用靶點不同

為了進一步考察MSC與S1P聯合使用治療HPAEC急性損傷可能存在的協同機制，我們利用RT-PCR探討了MSC與S1P單獨或聯合使用后，急性損傷的HPAEC中S1P合成代謝關鍵酶基因的表達變化。首先收集LPS損傷12 h后的HPAEC，利用RT-PCR考察LPS損傷對HPAEC內鞘氨醇激酶（sphingosine kinase，SphK）SphK1和SphK2，S1P裂解酶（S1P lyase，S1PL），鞘磷脂合成酶（sphingomyelin synthase，SMS）SMS1和SMS2的表達變化，結果表明LPS損傷會明顯上調上述目的基因的表達，但它們的表達上調水平并無顯著差別（圖9）。這一方面提示我們，在急性肺損傷過程中，S1P相關基因的表達變化有可能成為潛在的治療靶點，同時也說明急性肺損傷是一個復雜的病理生理過程，針對單一靶點的治療手段并不能取得最佳治療效果，將MSC的多能作用以及S1P的生理功能聯合使用，有可能成為一種切實有效的治療手段。

圖8 MSC與S1P聯用作用于急性損傷的HPAEC后TNFα的表達變化（**P＜0.01）

進一步，我們將LPS損傷12 h后的HPAEC換液后分組，按照共培養條件區別，分別為對照組、MSC治療組和聯合治療組（其中S1P的終濃度為0.5μmol/L，MSC的數量是HPAEC的2倍），非接觸共培養8 h后收集細胞，提取總RNA，RT-PCR檢測S1P相關基因的表達變化情況，結果表明，與單獨使用MSC相比，MSC與S1P聯用對TNFα表達的下調作用更為明顯，提示MSC與S1P聯用對治療急性損傷可能具有協同作用（圖10A）。

圖9 1μmol/L LPS作用于HPAEC 12 h后,RT-PCR檢測目的基因的表達變化

圖10 1μmol/L LPS作用于HPAEC 12 h后，換液按共培養條件分組，非接觸共培養8 h后RT-PCR檢測S1P相關基因的表達變化

研究表明，S1P在細胞內的水平是通過其合成與降解之間的平衡來緊密調節的，在體內神經鞘磷脂（sphingomyelin，SM）被催化生成神經酰胺，再進一步水解生成鞘氨醇，而鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶（SphK1和SphK2）催化磷酸化生成S1P。此外S1PL可裂解不可逆降解S1P，通過對神經鞘磷脂合成酶、鞘氨醇激酶和S1PL表達的調控，實現S1P濃度的穩態控制，有望成為急性肺損傷的治療靶點。我們的研究表明，LPS損傷后HPAEC中上述神經鞘磷脂合成酶（SMS1、SMS2）、鞘氨醇激酶（SphK1、SphK 2）和S1PL的表達均有不同程度的上調，MSC單獨使用時，其主要作用于SphK1、S1PL和SMS1，能夠明顯下調這3個基因的表達，但當將MSC和S1P聯合使用時，對S1PL的下調作用喪失，而SphK2和SMS2的表達明顯下調（圖10B、C）。通過對上述幾種S1P相關基因表達調控結果的分析，不難發現，當MSC和S1P聯合使用時，對目的基因的表達調控結果并不是簡單的MSC或S1P單獨使用時調控結果的疊加，而是表現出更為明顯的下調結果。這就提示我們，MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協同作用機制，進一步揭示這種協同作用機制有望為急性肺損傷的創新治療提供新的思路。

3 討論

S1P主要存在于血漿和組織中，是一種激動劑，具有增強內皮屏障的功能，在體內是血管內皮細胞通透性和體液平衡的重要調節者。S1P在體內的穩態是通過其合成與降解之間的平衡來緊密調節的，在體內神經鞘磷脂被神經磷脂酶催化生成神經酰胺（ceramide，Cer），Cer很快被神經酰胺酶催化水解生成鞘氨醇，而鞘氨醇可以被鞘氨醇激酶催化磷酸化生成S1P。生理濃度的S1P對于維持內皮屏障功能具有重要作用，研究發現SphK1的活性與S1P濃度的動態平衡，即SphK1/ S1P軸對于炎癥信號的上調是必需的，而且還涉及先天免疫和適應性免疫等各種免疫細胞活性的調節。已有研究表明SphK1與/或S1P的異常變化會導致許多炎癥和自身免疫疾病，如哮喘、類風濕性關節炎、敗血癥和炎癥性腸疾病等。

也有研究發現S1PL能不可逆地降解S1P[22]，急性肺損傷可增強S1PL的表達、降低肺內S1P水平、增強炎癥和導致內皮屏障功能障礙。在人肺微血管內皮細胞（human lung microvascular endothelial cells，HLMVEC）中通過siRNA下調S1PL的表達，可以提高細胞內S1P水平，通過激活Rac1改善急性損傷導致的內皮屏障功能障礙[23]。此外，S1P代謝的上游途徑在肺損傷中的作用尚不明確，可能的作用機制是通過調節SMS1和SMS2的活化及神經鞘磷脂合成途徑來實現的[24]。研究發現SMS2的競爭性抑制劑（D609）可迅速增強肺血管內皮細胞屏障功能，抑制LPS刺激的內皮細胞通透性的增高，并具有一定的量效關系[25]。上述研究表明通過調控S1P代謝相關酶的活性及S1P穩態，能夠有效改善肺內皮細胞屏障。

我們發現LPS誘導HPAEC損傷后，SphKs、S1PL和SMSs的表達顯著上調，當MSC單獨使用時僅下調SphK1的表達，對SphK2的表達并無顯著影響，而當MSC與S1P聯用時會同時下調SphK1和SphK2的表達，這說明MSC能夠通過調控SphKs的表達及其活性，發揮治療急性肺損傷的作用。此外MSC單獨使用時，其主要作用于S1PL和SMS1，能夠明顯下調這2個基因的表達，但當將MSC和S1P聯合使用時，對S1PL的下調作用喪失，而SMS2的表達明顯下調。這些結果提示我們，MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協同作用機制。

臨床研究表明，對于ALI/ARDS產生的嚴重病理損傷，不太可能有單一靶點或藥物可以逆轉這一過程，并迅速起到良好的臨床效果，創新的多靶點協同治療機制可能是解決該難題的有效方案。而干細胞治療從本質上而言，并不是像單一藥物那樣作為一種療法作用于單一靶點，而是作為多種療法一起對來自患病組織的生物遇險信號做出多種反應而發揮作用。我們發現MSC作用于LPS損傷的HPAEC后，可影響多個S1P代謝相關酶基因的表達，改善內皮屏障，治療急性肺損傷。同時S1P作為內源性生物活性分子，是血管內皮細胞通透性和體液平衡的重要調節者。在急性肺損傷過程中，對S1P合成代謝過程中關鍵酶的表達調控，對于改善內皮屏障機制具有重要作用。我們的研究表明MSC與S1P都具有改善急性肺損傷的作用，但MSC與S1P聯用對S1P代謝相關基因表達調控并不是MSC或S1P單獨使用時調控結果的簡單疊加，而是更為明顯的下調結果，這就提示我們MSC和S1P在治療急性損傷的過程中可能存在某種協同作用機制。進一步探討MSC與S1P聯用、通過改善內皮屏障的生物學功能對急性肺損傷的治療作用及可能的協同機理，有望為急性肺損傷的臨床治療提供新思路。

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Expression Regulation of S1P Metabolic Related Enzymes in Acute Injury HPAECs by MSC Combined with S1P

LIU Hui-Ying1,LI Wen-Fei3,ZHANG Zi-Li1,2,ZHENG Jing1,HENG Zhi-Zhi1, LI Pu-Yuan1,YUAN Xin1,NIU Wen-Kai1,BAI Chang-Qing1*
1.Department of Respiratory and Critical Care Diseases,307th Hospital of PLA,Beijing 100071;2.Anhui Medical University,Hefei 230032;3.School of Aerospace Medicine，Fourth Military Medical University,Xi'an 710032; China

Objective:To explore the regulatory effect of mesenchymal stem cells（MSC）combined with sphingosine 1-phosphate（S1P）in regulating the expression of S1P metabolic related enzymes during the pathogenesis of acute lung injury.Methods:LPS-stimulated acute injury model of pulmonary endothelial cells was developed,followed by non-contact co-cultured with MSC and S1P,and then the protective effects and expression regulation roles of MSC and S1P on the microelectronic impedance of injury cells and the S1P metabolic related enzymes were investigated by real-time cellular analysis system and RT-PCR respectively.Results:Compared with theMSC alone,the combination treatment showed significantly impact on regulatory targets.The expression of SphK1, S1PL and SMS1 was downregulated by MSC alone,while the downregulation of S1PL was completely lost and the expression of Sphk2 and SMS2 was markedly reduced during the combined use of MSC and S1P.Conclusion:As a potential treatment of acute lung injury,MSC can act on multiple S1P metabolic related genes simultaneously. S1P combination has a synergistic expression regulation effect on the related genes and hence shows a more promising therapy way.This study laid the experimental foundation for the further investigation of the therapeutic effect and potential synergistic mechanism of MSC and S1P combinatory treatment of acute lung injury by improving the biological function of endothelial barrier.

acute lung injury and acute respiratory distress syndrome;mesenchymal stem cells;sphingosine 1-phosphate

R25;Q78

A

1009-0002（2017）03-0256-09

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.005

2016-11-21

北京市自然科學基金（7164284）

劉慧瑩（1982-），女，博士，主治醫師，（E-mail）liuhuiying1982@sina.com

柏長青，（E-mail）baicq307@163.com

*Corresponding author,E-mail:baicq307@163.com