茯苓多糖PCP-Ⅰ增強抗原特異性體液免疫反應的機制研究

劉坤，殷瑛，張軍，董大勇，劉炬，李汭樺，麻浩，單俊杰，徐俊杰

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.軍事醫學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850

茯苓多糖PCP-Ⅰ增強抗原特異性體液免疫反應的機制研究

劉坤1，殷瑛1，張軍1，董大勇1，劉炬1，李汭樺1，麻浩2，單俊杰2，徐俊杰1

1.軍事醫學科學院 生物工程研究所，北京 100071；

2.軍事醫學科學院 毒物藥物研究所，北京 100850

目的：以炭疽芽孢桿菌保護性抗原（PA）為模式抗原，對茯苓多糖PCP-Ⅰ作為疫苗佐劑增強抗原特異性體液免疫反應的機制進行研究。方法：PCP-Ⅰ混合PA免疫BALB/c小鼠，分別采用ELISA和毒素中和實驗，檢測免疫后小鼠血清中PA特異性（anti-PA）抗體和炭疽毒素中和抗體；采用流式細胞術檢測樹突狀細胞（DC）經PCP-Ⅰ體外刺激后的成熟情況，及二免后7 d小鼠脾臟中生發中心（GC）B細胞和濾泡狀輔助T細胞（Tfh）的頻率。結果：相對于單獨PA免疫組，200μg PCP-Ⅰ能夠顯著提高二免后2周小鼠血清中anti-PA抗體和毒素中和抗體的水平（5.38× 103vs 6.48×101，8.7×101vs 1.54×101）。PCP-Ⅰ與PA混合刺激培養DC，CD80和MHC-Ⅱ分子陽性細胞頻率（82.2%，74.9%）顯著高于PA刺激組（51.7%，46.8%）。二免后7 d，PA+PCP-Ⅰ組小鼠脾臟中Tfh細胞頻率略高于PA組（4.97%vs 4.20%），GC B細胞頻率顯著高于PA組（7.73%vs 6.30%）。結論：PCP-Ⅰ可通過促進DC成熟和增強生發中心反應來增強抗原特異性體液免疫反應。

佐劑；PCP-Ⅰ；多糖；樹突狀細胞；生發中心

疫苗是預防傳染病的有效手段，開發安全高效的疫苗是疫苗學研究的目標。亞單位疫苗和重組蛋白類疫苗的抗原是高純度的蛋白質，疫苗的安全性得到提高，但存在免疫原性弱、激發的抗體反應不強、難以激發T細胞反應等不足[1]。為了提高蛋白類疫苗的效力，研究者們一直在尋找高效的佐劑來增強抗原的免疫原性，誘導更強的免疫反應或改變免疫反應的類型。鋁佐劑是使用時間最長最廣泛的人用疫苗佐劑。近年來，MF59、AS03、AS04和Virosomes等幾種新佐劑逐漸獲批為人用疫苗佐劑[2]。植物多糖因具有免疫調節功能強、生物可降解和毒副作用小等優點，成為新型佐劑研究的一個熱點[3]。目前，國外研究最多的多糖佐劑是從δ-菊粉中分離制備的Advax。δ構象的菊粉能形成半晶體顆粒，具有免疫調節功能，已在流感疫苗、乙肝疫苗和乙型腦炎疫苗等多種疫苗中顯示出良好的佐劑效應[4]。以Advax為佐劑的三價流感疫苗、乙型肝炎疫苗和艾滋疫苗已完成Ⅰ期臨床試驗，安全性良好[5-7]。近年來，傳統中藥逐漸進入佐劑研究者的視野。董娜等以卵清蛋白（OVA）為模式抗原，比較板藍根多糖、茯苓多糖、淫羊藿多糖等7種從傳統中藥中提取得到的多糖的佐劑效應，發現淫羊藿多糖、黃芪多糖、板藍根多糖和茯苓多糖能夠有效增強OVA特異性抗體反應[8]。

茯苓多糖PCP-Ⅰ從中藥茯苓中分離純化獲得，由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖按照1∶1.81∶0.27∶7.27的摩爾比構成[9]。前期研究發現，茯苓粗多糖PCP和茯苓多糖PCP-Ⅰ能夠增強H1N1流感疫苗抗原和乙肝疫苗抗原誘導的免疫反應[9-10]。進一步研究發現，PCP-Ⅰ能夠增強免疫后小鼠脾細胞增殖能力，調節T/B細胞分化，但是其作為疫苗佐劑的具體作用機制有待探討[9]。

我們以炭疽芽孢桿菌保護性抗原（protective antigen，PA）為模式抗原，考察PCP-Ⅰ作為佐劑增強抗原特異性體液免疫反應的能力，從誘導樹突狀細胞（dendritic cells，DC）成熟和促進生發中心（germinal center，GC）反應兩方面對PCP-Ⅰ佐劑的效應機制進行了探討。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級BALB/c小鼠（6～8周齡）購自北京維通利華實驗動物技術有限公司；小鼠巨噬細胞J774A.1購自美國ATCC，由本實驗室保存；炭疽芽孢桿菌PA和致死因子（lethal factor，LF）由本實驗室用基因工程方法表達制備；鋁佐劑購自Brenntag Biosector公司；茯苓多糖PCP-Ⅰ由軍事醫學科學院藥物毒物研究所單俊杰研究員提供。

牛血清白蛋白（BSA）、MTT、紅細胞裂解液和脂多糖（LPS）購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HRP）標記的羊抗鼠IgG購自Santa Cruz公司；TMB單組分顯色液購自Solarbio公司；MEM培養基、1640培養基、胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸和雙抗購自Gibco公司。分別向已加入非必需氨基酸及雙抗的MEM培養基中加入2%和10%FBS作為檢測用培養基和生長培養基；向1640培養基中加入10%FBS和雙抗作為完全培養基。

1.2 動物免疫

用于體液免疫評價的BALB/c小鼠隨機分成6組，每組8只。將0.5μg PA與鋁佐劑吸附過夜，另取相應量的PA分別與50、200、500μg的PCP-Ⅰ于使用前混合，通過肌肉注射免疫小鼠，單獨PA組和PBS組分別作為陰性對照和空白對照，各組免疫2次，間隔2周，二免后2周取血分離血清。

用于生發中心檢測的BALB/c小鼠隨機分為4組，每組3只，將5μg PA單獨或混合佐劑，通過肌肉注射免疫小鼠，注射PBS組作為空白對照，免疫2次，間隔2周，二免后7 d分離小鼠脾細胞。

1.3 ELISA檢測血清中anti-PA抗體

PA用包被緩沖液稀釋至2μg/mL，100μL/孔加入96孔酶標板，4℃過夜包被；次日用PBST洗板3次，加入含2%BSA的封閉液于37℃封閉1 h；洗板，待測小鼠血清按1∶50加入首孔，然后進行1∶2梯度稀釋，37℃孵育1 h；洗板，加入HRP標記的羊抗鼠IgG（1∶10 000），37℃孵育45 min；洗板，加入TMB于室溫避光顯色6 min，之后加入2 mol/L H2SO4終止顯色。用Bio-Rad酶標儀檢測D450nm和D630nm值，以D=D450nm-D630nm作為最終吸光度值，大于2.1倍D（陰性血清）的最大稀釋度為該樣品的抗體滴度。

1.4 毒素中和實驗（TNA）檢測中和抗體

小鼠巨噬細胞J774A.1對炭疽致死毒素（lethal toxin，LT）高度敏感，低濃度的LT就能致其死亡，J774A.1細胞的這一特點可用來檢測血清中和炭疽LT的能力[11]。細胞按3.5×105/mL，100μL/孔加入96孔培養板，放入細胞培養箱中培養24 h；小鼠血清在含50 ng/mL PA和40 ng/mL LF的檢測培養基中以1∶10為起始進行1∶2梯度稀釋，放入37℃細胞培養箱孵育45 min；用毒素血清混合物替代細胞板中的培養基，37℃孵育4 h；每孔加入25μL，5 mg/mL的MTT，于37℃繼續孵育1 h；棄去板內液體，每孔加入100μL MTT溶解液，室溫振蕩溶解10 min；用Bio-Rad酶標儀檢測D570nm和D630nm值，以D=D570nm-D630nm作為最終的吸光度值，用Sigmaplot軟件通過四參數曲線擬合計算半數有效稀釋度（ED50）。

表1 體液免疫評價實驗的小鼠免疫方案

表2 生發中心檢測實驗的小鼠免疫程序

1.5 刺激培養后DC成熟情況檢測

骨髓來源的樹突狀細胞（bone marrow-derived DC，BMDC）從BALB/c小鼠的股骨和脛骨中分離，在含粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（GMCSF）和白細胞介素4（IL-4）的1640完全培養基中培養獲得[12]。PA單獨或分別與鋁佐劑、PCP-Ⅰ混合后加入富集的DC，刺激培養24 h，PBS和LPS分別作為對照。PBS洗滌2次后，加入FITCCD11c、PE-CD80和AF647-MHC-Ⅱ染色。用BD Canto獲取數據，用Diva和FlowJo軟件分析CD11c+細胞中CD80+和MHC-Ⅱ+細胞的比例。

1.6 GC B細胞和濾泡狀輔助T細胞（T follicular helper cells，Tfh）的檢測

二免后7 d處死小鼠，用研磨法獲得單細胞懸液，裂紅后即得到脾細胞懸液。取適量細胞，依次加入FITC-CD4、PE-B220、APC-PD1、BV421-CXCR5、AF647-FasL和BV421-GL7流式抗體進行染色。用BD Canto獲取數據，用Diva和FlowJo軟件分析CD4+細胞中Tfh和B220+細胞中GC B細胞的比例。

1.7 統計分析

流式數據用Diva和FlowJo軟件分析，ED50利用SigmaPlot 12.0進行四參數邏輯曲線擬合得到，其余統計分析和做圖均由Graphd Prism 6.0完成。顯著性分析采用單因素方差分析或t檢驗，以P＜0.05為有統計學差異。

2 結果

2.1 多糖PCP-Ⅰ顯著增強PA特異性體液免疫反應

為考察多糖PCP-Ⅰ增強PA體液免疫反應的能力，用0.5μg PA分別與鋁佐劑和50、200、500μg PCP-Ⅰ混合免疫小鼠，以不加佐劑的PA組和PBS組作為對照，二免后2周取血進行檢測。用ELISA檢測血清中anti-PA抗體滴度，加入PCP-Ⅰ后，小鼠血清中anti-PA抗體滴度升高，50、200和500μg組的anti-PA抗體滴度分別為1.54×102、5.38×103和4.15×103，PCP-Ⅰ為200μg時anti-PA抗體滴度最高，顯著高于PA組（6.48× 101），與鋁佐劑組（2.15×104）無顯著性差異（圖1A）。毒素中和抗體能夠中和炭疽LT，從而保護J774A.1細胞或動物不會受到LT的殺傷。與anti-PA抗體的結果類似，PCP-Ⅰ加入能提高小鼠血清中和抗體的水平，50、200和500μg組中和抗體的ED50分別為2.65×101、8.7×101和6.13×101，200μg組的中和抗體最高，顯著高于PA組（1.54×101），與鋁佐劑組（9.36×101）無顯著性差異（圖1B）。該結果提示200μg PCP-Ⅰ能顯著增強PA特異性體液免疫反應，效應與鋁佐劑相當。

2.2 多糖PCP-Ⅰ促進DC成熟

正常情況下體內大多數DC處于未成熟狀態，MHC-Ⅱ和共刺激分子（如CD80/CD86等）表達水平低；在攝取抗原或受到某些因素（如LPS）刺激后，DC分化成熟，MHC-Ⅱ和共刺激分子的表達水平上調。因此，可以將MHC-Ⅱ和CD80的高表達作為DC成熟的標志。

用PA單獨或分別混合PCP-Ⅰ和鋁佐劑，刺激培養BMDC，以LPS和PBS分別作為陽性對照和空白對照，24 h后收集細胞，用流式細胞儀檢測CD80+和 MHC-Ⅱ+細胞的比例。在圈出 DC（CD11c+）后，檢測CD80+細胞的比例（圖2A）。PA刺激組和PBS刺激組DC的CD80陽性率接近，分別為51.7%和49.7%，說明在體外培養中僅靠PA難以有效誘導DC上調CD80表達；而PA+PCP-Ⅰ能夠誘導DC顯著提高CD80的表達（82.2%），其誘導能力顯著高于PA+Al（65.1%）（圖2C）。DC以抗原肽-MHC-Ⅱ的形式將抗原提呈給T細胞，因此MHC-Ⅱ分子的表達水平與抗原提呈作用存在正相關關系。在圈出DC后，檢測MHC-Ⅱ陽性細胞的頻率（圖2B）。與CD80分子的表達趨勢類似，PA刺激組和PBS刺激組的MHC-Ⅱ陽性細胞的頻率接近，分別為46.8%和46.3%；而PA+PCP-Ⅰ能夠顯著刺激DC提高MHC-Ⅱ的表達水平（74.9%），作用顯著強于PA+Al（56.1%）（圖2D）。以上結果提示，PCP-Ⅰ與PA混合后能刺激DC上調CD80和MHC-Ⅱ分子的表達，誘導DC分化成熟，且作用強于鋁佐劑。

2.3 多糖PCP-Ⅰ促進生發中心反應

GC是機體對T細胞依賴性抗原的主要應答場所，在抗原刺激后約1周形成。活化的B細胞擴增形成生發中心母細胞，進一步分化增殖形成GC B細胞；GC B細胞在Tfh和濾泡狀樹突細胞（follicular DC，FDC）的協同作用下繼續分化，經歷陽性選擇和親和力成熟，最終分化為抗體親和力成熟的漿細胞和記憶B細胞[13]。因此，可將GC B和Tfh細胞的頻率作為衡量GC反應強度的指標。

PA分別混合PCP-Ⅰ和Al佐劑免疫小鼠，免疫2次，間隔2周，在二免后7 d分離小鼠脾細胞進行GC反應的檢測。根據GC B細胞高表達GL7和FasL分子的特性，用流式細胞儀檢測脾臟中GC B細胞占B細胞的百分比（圖3A）。免疫組GC B細胞的比例均高于PBS對照組，且PA+PCP-Ⅰ組小鼠GC B細胞的頻率（7.73%）顯著高于PA組（6.30%），與PA+Al組相當（7.47%）（圖3C）。此結果提示PCP-Ⅰ能夠提高小鼠免疫后脾臟中GC B細胞的頻率。

圖1 PCP-Ⅰ對anti-PA抗體和中和抗體的影響

參與生發中心反應的另一類重要細胞是Tfh細胞，根據Tfh細胞高表達PD1和CXCR5的特征，用流式細胞儀檢測小鼠脾臟中Tfh細胞占CD4+T細胞的比例（圖3B）。免疫組Tfh細胞的頻率均高于PBS對照組，且PA+PCP-Ⅰ組的Tfh細胞頻率略高于PA組（4.97%vs 4.20%，P=0.34），與PA+Al組相當（4.50%）（圖3D）。

3 討論

茯苓多糖PCP-Ⅰ能夠增強抗原特異性免疫反應[9]，但其作為疫苗佐劑的具體作用機制還不清楚。本研究以炭疽保護性抗原為模式抗原，考察PCP-Ⅰ作為佐劑增強抗原特異性體液免疫反應的能力，從誘導樹突狀細胞成熟和促進生發中心反應兩方面，對PCP-Ⅰ佐劑效應的機制進行了探討。

實驗結果顯示PCP-Ⅰ能夠顯著增強免疫后小鼠血清中anti-PA抗體和毒素中和抗體的水平，并且有劑量依賴關系。200μg PCP-Ⅰ即可產生與鋁佐劑相近的佐劑效應。鋁佐劑是目前使用最廣的疫苗佐劑，能顯著增強Th2偏向的體液免疫反應。鋁佐劑的主要成分是氫氧化鋁膠體，以水不溶性膠體顆粒存在，其佐劑效應的作用機制包括抗原緩釋和局部炎性刺激等。而PCP-Ⅰ是由巖藻糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成的可溶性多糖，推測其增強體液免疫的作用機制很可能與鋁佐劑不同。

圖2 刺激培養后各組DC的成熟情況

DC是惟一能夠激活初始T細胞的專職抗原提呈細胞，被認為是抗原特異性T細胞免疫反應的始動者。正常情況下體內DC大多處于未成熟狀態，表面表達高水平的Fc受體（FcR）和病原相關分子的模式識別受體（如甘露糖受體、Toll樣和C型凝集素等），具有極強的抗原攝取、加工和處理能力；但表達共刺激分子和MHC-Ⅱ分子水平低，因此提呈抗原和激活T細胞的能力較弱[14-15]。我們的結果顯示，PCP-Ⅰ的加入能誘導DC表面CD80和MHC-Ⅱ分子表達上調，促進DC分化成熟。推測產生這一現象的原因可能是PCP-Ⅰ與相應的模式識別受體結合，導致MHC-Ⅱ分子和CD40、CD80和CD86等共刺激分子的上調。成熟的DC以抗原肽-MHC-Ⅱ復合物的形式將抗原提呈給T細胞，并通過共刺激信號使T細胞充分活化，增殖分化為輔助性T細胞（Th）和記憶T細胞。

在外周免疫器官中，成熟B細胞接受抗原刺激，在FDC和Tfh細胞的輔助下，完成體細胞高頻突變、抗體親和力成熟和類別轉換，最終分化為漿細胞和記憶B細胞[16]。因此，GC反應是決定體液免疫中抗體反應強度和B細胞免疫記憶質量的重要因素[13]。Tfh細胞主要通過以下3種作用參與GC反應：①誘導并維持GC B細胞的形成和發育；②殺傷未與抗原相互作用或相互作用弱的B細胞（親和力低）；③誘導GC B細胞分化為漿細胞和記憶B細胞[16]。本實驗中二免后7 d檢測小鼠脾細胞中GC B細胞和Tfh細胞的頻率。由于PA的受體TEM8和CMG2在B細胞表面高表達，借助流式細胞術尚難以直接檢測PA特異性的GC B細胞和Tfh細胞，在這里用總的GC B細胞和Tfh細胞的頻率變化來反映免疫后的變化。結果顯示，PA+PCP-Ⅰ組的Tfh細胞頻率略高于PA組，GC B細胞頻率顯著高于PA組。高頻率的GC B細胞代表了更強烈的GC反應，為陽性選擇提供了更多的候選細胞；高頻率的Tfh細胞能夠對GC反應提供更強的輔助調節，從而產生親和力更高的漿細胞和相應的記憶B細胞。

圖3 二免后7 d小鼠GC反應的檢測結果

本研究結果表明，PCP-Ⅰ可通過促進DC成熟和生發中心反應來增強抗原特異性免疫反應，其作為一種潛在疫苗佐劑的作用機制值得進一步探討。

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Mechanism of a Polysaccharides PCP-Ⅰ from Poria cocos on Enhancing Antigen-Specific Humoral Immune Response

LIU Kun1,YIN Ying1*,ZHANG Jun1,DONG Da-Yong1, LIU Ju1,LI Rui-Hua1,MA Hao2,SHAN Jun-Jie2,XU Jun-Jie1*
1.Beijing Institute of Biotechnology,Beijing 100071;2.Institute of Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciences,Beijing 100850;China

Objective:To investigate the mechanism of a polysaccharides PCP-Ⅰ fromPoria cocosas a vaccine adjuvant on enhancing antigen-specific humoral immune response by using anthrax protective antigen（PA）as a model antigen.Methods:BALB/c mice were immunized by PCP-Ⅰ mixed with PA,followed by ELISA for anti-PA antibody,and toxin neutralization assay for anthrax toxin-neutralizing antibody.Flow cytometry was used to detect maturation of dendritic cells（DC）afterin vitrostimulation as well as the frequency of germinal center（GC）B cell and follicular helper T cells（Tfh）in spleen at 7 days after the second immunization.Results:Compared with PA control group,200μg PCP-Ⅰ combination group improved the level of anti-PA antibody and toxin neu-tralizing antibody in serum of mice after immunization（5.38×103vs 6.48×101,8.7×101vs 1.54×101）.The positive rate of CD80 and MHC-Ⅱ in DC were significantly increased by stimulation of PCP-Ⅰ plus PA（82.2%,74.9%）, higher than those of PA group（51.7%,46.8%）.The frequency of Tfh cells in spleen of PA plus PCP-Ⅰ group was slightly higher than that in PA group（4.97%vs 4.20%）,and the frequency of GC B cells was significantly higher than that of PA group（7.73%vs 6.30%）.Conclusion:PCP-Ⅰ may enhance antigen-specific humoral immune responses by promoting DC maturation and enhancing germinal center response.

adjuvant;PCP-Ⅰ;polysaccharide;dendritic cell;germinal center

R392.1

A

1009-0002（2017）03-0249-07

10.3969/j.issn.1009-0002.2017.03.004

2016-04-05

國家傳染病防治科技重大專項（2016ZX10004001）；國家自然科學基金（31300760）

劉坤（1992-），男，碩士研究生，（E-mail）qingfeng92@foxmail.com

徐俊杰，（E-mail）xujunjie@sina.com；殷瑛，（E-mail）yinying1028@sina.com

*Co-corresponding authors:XU Jun-Jie,E-mail:xujunjie@sina.com;YIN Ying,E-mail:yinying1028@sina.com