芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺過敏狀態(tài)下中央杏仁核區(qū)突觸磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶對脊髓場電位變化研究

陳健++賀詩靜++楊定中

摘 要 目的：探究在芬太尼誘發(fā)大鼠痛覺過敏狀態(tài)下給予突觸磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶抑制劑干預(yù)中央杏仁核區(qū)后脊髓場電位的變化。方法：SD雄性大鼠（60～90 g），CeA立體定位置管后隨機(jī)分為三組（n = 6）：對照組：皮下注射生理鹽水，CeA給予DMSO，記錄場電位； OIH組：皮下注射芬太尼建立OIH模型，待模型成功后記錄場電位；U0126組：OIH組記錄場電位后再在CeA給予U0126，并記錄場電位；芬太尼或生理鹽水注射后6.5h檢測機(jī)械痛閾和熱痛閾的變化。結(jié)果：大鼠在芬太尼處理6h后機(jī)械痛閾和熱痛閾降低（P<0.05）；OIH組誘發(fā)場電位的峰面積對照組比較明顯增加（P<0.05），CeA區(qū)給予p-ERK抑制劑U0126可逆轉(zhuǎn)上述變化（P<0.05）；結(jié)論：CeA區(qū)突觸磷酸化細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶可調(diào)制脊髓場電位的變化，在痛覺過敏的維持過程中發(fā)揮了重要作用。

關(guān)鍵詞 場電位 痛覺過敏 杏仁核 芬太尼

杏仁核在疼痛以及疼痛相關(guān)的情緒反應(yīng)中起著重要作用，有研究表明杏仁核CeLC區(qū)注射€%e受體興奮劑內(nèi)嗎啡肽（作用強(qiáng)于嗎啡的一種內(nèi)源性阿片）可產(chǎn)生痛覺過敏，該區(qū)域主要接受從脊髓背角經(jīng)臂旁核（PB）中繼的傷害性信息的傳入。而脊髓P-ERK在調(diào)制痛覺過敏中發(fā)揮重要作用。那么我們推測杏仁核中P-ERK在調(diào)制痛覺過敏中也發(fā)揮了作用，如何去證實(shí)這個猜想呢？Heinl等給大鼠靜脈注射芬太尼，撤藥后觀察到C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元場電位發(fā)生了長時程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP ）現(xiàn)象，而LTP是研究痛覺過敏機(jī)制的重要細(xì)胞模型。因此，本研究選取杏仁核為靶區(qū)，探究用芬太尼誘導(dǎo)大鼠痛覺過敏時，干預(yù)杏仁核中P-ERK后，在脊髓背角淺層記錄場電位的變化情況，旨在探明痛覺過敏狀態(tài)杏仁核中P-ERK是否也發(fā)揮了重要作用，也為研究疼痛上行通路調(diào)制下行通路提供新的線索和思路。

1 材料與方法

動物選擇及分組。由湖北省實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供的SPF級健康雄性SD大鼠18只，體重60～100 g，在室溫條件下自由攝食和飲水，光照與黑暗時間為12 h：12H。實(shí)驗(yàn)前在老鼠中央杏仁核立體定位置管，之后采用隨機(jī)數(shù)字表法分為3組（n=6）：對照組1：皮下注射生理鹽水，CeA給予DMSO，記錄場電位；對照組2：皮下注射生理鹽水，CeA給予U0126 1.5nmol，并記錄場電位；OIH組：頸部皮下注射芬太尼（湖北宜昌人福藥業(yè)有限責(zé)任公司），每次60 €%eg/kg，注射4次，每次間隔時間15 min，總給藥劑量240 €%eg/kg，制備大鼠痛覺過敏模型，待模型成功后記錄場電位；U0126組：OIH組記錄場電位后再在CeA給予U0126 1.5nmol，并記錄場電位；U0126購于美國Cayman chemical公司，臨用前溶于含50% DMSO的生理鹽水中。

杏仁核CeLC區(qū)立體定位置管給藥。大鼠腹腔注射濃度為10%的水合氯醛（3 ml/kg）完全麻醉后將其固定在腦立體定位儀（Stoelting公司，美國）上，腦部皮膚消毒后暴露顱骨前囟和矢狀縫并在右側(cè)杏仁核區(qū)（參考大鼠腦立體定位圖譜坐標(biāo)：前囟后2.0mm，中線旁開4.2 mm，顱骨下7.5 mm）植入帶管芯的套管（中國深圳市瑞沃德生命科技有限公司），迅速用牙膠骨水泥固定套管并縫合皮膚。手術(shù)后至少恢復(fù)一周，測痛確認(rèn)恢復(fù)完全，以排除手術(shù)干擾。將注射內(nèi)管一端用PE管連接微量注射器針頭，另一端插入固定好的導(dǎo)管里，用微量泵緩慢給藥（0.3 €%el，0.1 €%el/min），完成注射后停留5min，使藥物充分彌散后拔出注射內(nèi)管并裝上導(dǎo)管帽。

疼痛行為學(xué)檢測。于OIH模型建立前及芬太尼或生理鹽水注射6.5h后測機(jī)械痛和熱痛。行為學(xué)采用Von Frey絲（North Coast公司，美國）測定大鼠的機(jī)械痛閾。先將大鼠靜置于特制的籠內(nèi)30 min 使其適應(yīng)環(huán)境，再用不同壓力的von Frey絲垂直作用在鼠足掌面上，陽性反應(yīng)（大鼠出現(xiàn)抬足或舐足行為），計(jì)算50%機(jī)械縮足反應(yīng)閾。采用BME-410C型熱痛刺激儀（CAMS公司，中國）測定大鼠熱痛閾。先把大鼠放入有機(jī)玻璃箱內(nèi)適應(yīng)30 min，透過玻璃板底部用熱輻射源照射大鼠左足掌正中間區(qū)域。熱痛閾為自動記錄縮足反應(yīng)的潛伏期，為了免造成輻射損傷截止時間設(shè)為15s。每次照射間隔至少5 min，重復(fù)至少3次，最后取平均值。

場電位記錄。采用10%水合氯醛（3ml/kg）腹腔注射麻醉大鼠，固定于定向儀（江灣Ⅰ型C 第二軍醫(yī)大學(xué) 中國）上。暴露脊髓腰膨大（T13-L1做椎板切除手術(shù)），用玻璃電極游離左側(cè)坐骨神經(jīng)，記錄時用雙極氯化銀電極刺激坐骨神經(jīng)。暴露的多余的神經(jīng)組織用浸潤0.9%生理鹽水的紗布覆蓋。用玻璃電極進(jìn)行細(xì)胞外記錄，電極深度在脊髓表面下0.1-0.5mm。采用ME-100微電極放大器和BL-420E+生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司 中國）處理和存儲數(shù)據(jù)。以C-纖維誘發(fā)場電位的幅值和面積作為參數(shù)。給予單方波（25V，0.5ms，5min-1）刺激坐骨神經(jīng)誘發(fā)脊髓背角場電位。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死大鼠（過量水合氯醛）。

統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。采用Graphpad prism6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料用均數(shù)€北曜疾睿？€？）表示，多組比較采用單因素方差分析，組間比較采用t檢驗(yàn)，同組不同時間比較采用配對t 檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

對照組與OIH組比較，OIH組6h、7h時機(jī)械痛閾和熱痛閾均降低（P<0.05）。見表1。

與對照組相比，OIH組場電位的峰面積增加（P<0.05）；從杏仁核置管裝置給予U0126干預(yù)后記錄到的場電位峰面積與OIH狀態(tài)時相比較顯著降低（P<0.05）。見圖1。

3 討論

臨床鎮(zhèn)痛和麻醉常用阿片類藥物，芬太尼是臨床麻醉常用且鎮(zhèn)痛效果也很顯著的阿片類藥物之一。有研究表明，芬太尼在用于鎮(zhèn)痛和麻醉時會引起痛覺敏感性增強(qiáng)，即芬太尼誘導(dǎo)的痛覺過敏（OIH）。

Chu等的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明外周及脊髓機(jī)制不足以來解釋OIH現(xiàn)象，我們推測OIH與疼痛上行通路有關(guān)，杏仁核作為疼痛上行通路的重要節(jié)點(diǎn)之一，有研究表明杏仁核中P-ERK與痛覺過敏有關(guān)，而OIH狀態(tài)下C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元的場電位發(fā)生了長時程增強(qiáng)（long term potentiation，LTP）現(xiàn)象。本研究采用皮下注射芬太尼（60ug/kg），每隔15min一次，共4次，累積藥量240ug/kg，建立OIH模型。結(jié)果顯示，與對照組比較，OIH組機(jī)械痛閾和熱痛閾均降低，說明OIH模型是成功的。在OIH模型上，通過特制的導(dǎo)管裝置靶向給予P-ERK抑制劑U0126至杏仁核區(qū)干預(yù)后，記錄C纖維突觸投射的脊髓背角神經(jīng)元場電位。結(jié)果顯示，與對照組比較OIH組場電位峰面積增加（P < 0.05）；OIH組給予U0126后場電位峰面積顯著降低（P < 0.05）。

綜上所述， OIH狀態(tài)下杏仁核中P-ERK參與調(diào)制脊髓場電位的變化，即參與調(diào)制OIH，對OIH的維持有一定的作用。但我們相信OIH的發(fā)生絕不是單個因子的作用，在杏仁核以及其它疼痛傳導(dǎo)的節(jié)點(diǎn)如PAG、RVM、PB等還有很多參與疼痛調(diào)節(jié)的因子如NMDA受體系統(tǒng)、Ⅰ型代謝型谷氨酸受體5、PKA等，它們對OIH的作用尚不明確，需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去探究。

*通訊作者：楊定中

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