HPV陽性患者基因分型及病毒負載量分析

翁潔玲， 湯濤， 彭俊玲， 張曉， 張旭， 王芳*

（1廣州醫科大學附屬第二醫院 病理科，廣東 廣州510260；2中山大學腫瘤防治中心 分子診斷科，廣東 廣州510060）

HPV陽性患者基因分型及病毒負載量分析

翁潔玲1， 湯濤2， 彭俊玲2， 張曉2， 張旭2， 王芳2*

（1廣州醫科大學附屬第二醫院 病理科，廣東 廣州510260；2中山大學腫瘤防治中心 分子診斷科，廣東 廣州510060）

目的 研究廣州地區宮頸人乳頭狀瘤病毒 （HPV）的感染狀況及基因型分布，并探討病毒負載量與宮頸鱗狀上皮內病變的關系。方法 收集中山大學腫瘤防治中心2013年7月至2015年10月收治的1 105名女性的宮頸刷取物標本，采用表面等離子體諧振技術 （SPR）檢測HPV型別及負載量，同時行宮頸液基細胞學檢查 （LCT）。細胞學檢查陽性患者加做陰道鏡及病理活檢。結果 共檢測出HPV陽性標本210例，感染率為19.00%。共檢出23個基因型，包括16個高危型 （HR-HPV）和7個低危型 （LR-HPV）。單一高危型169例 （15.29%），平均負載量為 （170.59±85.91）m°；單一低危型20例 （1.81%），平均負載量為 （111.75±37.39）m°；HPV多重感染21例 （1.90%）。單一HR-HPV陽性患者的平均病毒負載量顯著高于陰性患者，差異有統計學意義 （Z＝-3.256，P＝0.001）。結論 SPR和LCT聯合檢測有助于宮頸癌前病變的診斷，對進一步臨床治療有指導意義。

人乳頭狀瘤病毒；基因型；宮頸鱗狀上皮內病變；表面等離子體諧振；液基細胞學檢測

繼乳腺癌和結直腸癌之后，宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤［1］。 流行病學研究［2］已證明， 宮頸癌的發生與高危型人乳頭狀瘤病毒 （HR－HPV）感染和宮頸癌篩查的缺乏有關。與其他癌癥相比，宮頸癌的篩查是最有成效的。目前最常用的兩種篩查方法是宮頸液基細胞學檢查 （LCT）和HPV－DNA檢測。本研究采用表面等離子體諧振法 （SPR）對HPV進行基因分型并對病毒負載量進行檢測，同時對患者行LCT，旨在探討HRHPV病毒負載量與宮頸鱗狀上皮內病變之間的關系，現將結果報道如下。

1 材料和方法

1.1 一般資料

收集中山大學腫瘤防治中心2013年7月至2015年10月期間收治的1 105名女性的宮頸刷取物標本。其中HPV陽性患者210名，年齡20～72歲，平均年齡 （43.42±10.08）歲。

1.2 方法

1.2.1 宮頸脫落細胞采集和處理

采用美國BD公司SUREPATH專用采樣刷收集宮頸鱗柱交界處脫落細胞，用于HPV分型及LCT檢測。

1.2.2 HPV基因分型檢測

使用北京金菩嘉醫療科技有限公司的 SPR技術及配套W2600型生物傳感閱讀儀進行HPV基因分型及負載量檢測。反應體系包括89 μL擴增混合液、1 μL Taq酶及10 μL DNA樣本，PCR反應條件：50℃2 min，94℃4 min；94℃30 s，48℃45 s，72℃20 s，28個循環；94℃30 s，65℃45 s，72℃20 s，25個循環；4℃終止。向每管擴增產物中加入60 μL雜交緩沖液，95℃變性3 min，與SPR生物傳感芯片反應，通過軟件對結果進行分析判讀。該檢測包括24個HPV亞型，其中高危型包括16、18、31、33、35、39、45、51、52、53、56、58、59、66、68、81。低危型包括 6、11、40、42、43、44、54、70。結果檢測值≥40 m°則為陽性。陽性結果提示該樣本的病毒檢測量>1 pg／μL標準品 （相當于>106／mL樣本病毒質粒拷貝數）。

1.2.3 宮頸液基細胞學

LCT結果按照子宮頸細胞學2001版TBS分為無上皮內病變或惡性病變 （NILM）、不能明確意義的非典型鱗狀上皮細胞（ASCUS）、不除外高級別鱗狀上皮內病變的非典型鱗狀上皮細胞 （ASC－H）、低級別鱗狀上皮內病變 （LSIL）、高級別鱗狀上皮內病變 （HSIL）及鱗狀細胞癌 （SCC）。除NILM外，其他病例均屬于LCT陽性患者。

1.3 統計學分析

采用SPSS 22.0統計學軟件對數據進行分析處理，計量資料的比較采用Mann－Whitney U方法，多組計量資料的比較采用Kruskal－Wallis檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 HPV感染陽性率

受檢的1 105例女性標本中，HPV感染陽性共210例，陽性率為19.00% （見表1）。共檢測出23個HPV亞型，包括16個高危型 （HR－HPV）和7個低危型 （LR－HPV）。單一高危型共169例，占全部陽性標本的80.48%，其中前三位為HPV52、16、53，分別為27例、26例、15例。單一低危型20例，占全部陽性標本的9.52%，其中前三位為HPV54、70、6，分別為7例、7例、3例。HPV多重感染共21例，占全部陽性標本的10.00%，其中18例為雙重感染。雙重感染患者中15例為同時感染2種高危型，3例為高危及低?；旌细腥?。

表1 HPV單一及多重感染陽性檢出率比較

2.2 LCT結果及病理活檢結果

210例HPV陽性患者中，有155例經LCT診斷為NILM；LCT陽性共55例，包括16例ASC－US、2例ASC－H、19例LSIL、16例HSIL和2例SCC。LCT陽性患者病理活檢結果顯示有3例為慢性宮頸炎，30例為CINⅠ級，20例為CINⅡ／Ⅲ級，2例為低分化鱗狀細胞癌 （見表2）。30例CINⅠ級共檢出11種高危型 （其中檢出9例HPV66和5例HPV52）和2種低危型。20例CINⅡ／Ⅲ級患者共檢出7種高危型，其中6例為HPV16（5例單一型及1例合并HPV58）。2例SCC患者均為HPV16（1例單一型，另1例合并HPV81）。

表2 LCT陽性患者HPV基因分型及宮頸病理活檢結果

2.3 高危型HPV負載量與LCT及病理活檢結果的相關性

NILM組及 LCT陽性組患者的平均病毒負載量分別為159.64 m°和198.19 m°，差異具有統計學意義 （Z＝－3.118，P＝0.002）。ASC組、LSIL組和HSIL組患者的平均病毒負載量分別為200.27 m°、209.33 m°和184.43 m°，組間比較差異無統計學意義 （χ2＝0.885，P＝0.643）。將經LCT診斷為NILM的155例患者和病理活檢為慢性宮頸炎的3例患者均歸入陰性組。病理陽性組、CINⅠ級組及CINⅡ／Ⅲ級組患者的平均病毒負載量分別為200.41 m°、197.63 m°和204.90 m°，均高于陰性組的

159.77 m°（Z值分別為－3.256、－2.441和－2.337，對應的P值分別為0.001、0.015和0.019）。而CINⅠ級組與CINⅡ／Ⅲ級組的平均病毒負載量比較，差異并無統計學意義 （Z＝－0.178，P＝0.859）。

3 討論

在人類所有的癌癥中，15%的癌癥是由病毒感染引起的，宮頸癌是其中之一［3］。1977年，Harald zur Hausen首次提出HPV與宮頸鱗狀細胞癌有關［2］，并因此榮獲2008年度諾貝爾醫學獎。HPV屬于乳頭狀瘤病毒科，是雙鏈DNA病毒，長約8 000個堿基對，目前已發現并鑒定出100多種亞型，其中40余種與人類生殖器皮膚黏膜病變相關。HPV主要感染皮膚和黏膜，并引起感染部位上皮的增生，增生的上皮或乳頭狀瘤在某些情況下具有癌變的可能。根據致癌風險的高低不同，HPV的型別大致可分為高危型 （HR－HPV）和低危型 （LR－HPV）。HR－HPV是幾乎所有宮頸癌發生發展的必要非充分條件［4］。其中HPV16最具致癌風險，全世界55%～60%的宮頸癌病例［5］為HPV16感染者。HPV感染的類型及各類型所占比例因地域或人種的差異而有所不同。本研究中我院體檢的總體HPV感染陽性率為19.00%，居于中間水平。不同地區感染率的差異，可能與不同地區的經濟水平、開放程度以及不同的研究人群有關。本研究結果顯示，HPV多重感染占HPV陽性例數的10.00%，明顯低于Bachtiary等[6]報道的43.7%，亦低于成都地區 （24.3%）及廈門地區 （19.2%），且多重感染仍以二重感染為主。本研究檢出的210例HPV陽性患者中共有23個亞型，包括16個高危型和11個低危型。其中52型、16型和53型是最常見的三種高危型，與萬敏等［7］的報道具有一致性。本研究中的2例SCC患者均感染HPV16，且20例CINⅡ／Ⅲ級患者中有6例感染HPV16。

浸潤性宮頸癌存在前驅病變［8］，高級別的宮頸上皮內病變一般需要3～7年的時間才發展成浸潤性宮頸癌［9］。學者們試圖找出使宮頸癌前病變發展成為宮頸癌的各種影響因素，其中HPV病毒負載量與宮頸癌發展過程的組織學分級的關系目前仍然存在爭議。楊娟等［10］的研究提出，CINⅠ級組、CINⅡ／Ⅲ級組及SCC組與HPV病毒負載量呈正相關。Shen等［11］采用半定量的方法得出宮頸病變程度與HPV病毒負載量呈正相關。宮頸炎組、宮頸上皮內瘤變 （CIN）組和宮頸癌組的HPV病毒負載量呈上升趨勢。本研究結果顯示，單一HR-HPV陽性患者的平均病毒負載量均顯著高于陰性患者，差異有統計學意義（P＜0.05）。而CINⅠ級組與CINⅡ／Ⅲ級組的平均病毒負載量比較差異無統計學意義 （P＞0.05）。何惠華等［12］對孝感地區的7 780名婦女同時行 TCT及 HPV聯合檢測，結果表明，隨著HPV平均病毒負載量的增大，患者的宮頸病變程度越嚴重。本研究的LCT結果并未發現ASC組、LSIL組和HSIL組的HPV平均病毒負載量存在類似關系。

HPV陽性、LCT陰性的患者大部分為一過性感染，加強隨訪更有利于了解病情的轉歸?；颊吒敢膺x擇觀察隨訪而非做陰道鏡加病理活檢的有創性檢查。本研究均為常規體檢患者，鱗狀細胞癌例數較少，因此不單獨列出一組進行討論。

綜上所述，本研究結果提示，HPV病毒負載量與宮頸鱗狀上皮內病變的發生具有相關性，而對于病變的發展無預測作用。SPR和LCT聯合檢測有助于宮頸癌前病變的診斷，對臨床進一步治療有指導意義。

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[7]萬敏,趙金銀,曲守方,等.基質輔助激光解析、電離飛行時間質譜法和表面等離子諧振法在HPV分型檢測中的應用比較 [J].中國計劃生育學雜志,2014,22(3)：178-181.

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[10]楊娟,肖蘭,楊繼洲.高危型HPV負載量與宮頸癌前病變發展的相關性 [J].實用癌癥雜志,2012,27(6)：656-657.

[11]Shen G,Cheng J,Wang Y,et al.Viral DNA load of high-risk human papilloma virus is closely associated with the grade of cervical lesions [J].Int J Clin Exp Med,2014,7(12)：5826-5831.

[12]何惠華,劉漢忠,李蓓,等.孝感地區7780例TCT與HPV聯合檢測分析 [J].臨床與病理雜志,2015,35(2)：258-262.

（責任編輯：常海慶）

Analysis on Genotypes and Viral Load of Patients with Human Papillomavirus

WENG Jieling1,TANG Tao2,PENG Junling2,ZHANG Xiao2,ZHANG Xu2,WANG Fang2*
(1Department of Pathology,the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University,Guangzhou 510260,China;2Department of Molecular Diagnosis,Sun Yat-sen University Cancer Center,Guangzhou 510060,China;*

WANG Fang,E-mail:wangfang@sysucc.org.cn)

ObjectiveTo study the infection and genotype distribution of uterine cervix human papillomavirus(HPV)in Guangzhou, and to explore the relationship between viral load and cervical squamous intraepithelial lesion.Methods 1 105 cases of women admitted to the Sun Yat-sen university cancer center from July 2013 to October 2015 were selected,and their cervical specimens were collected.The HPV genotypes and viral load were detected by surface plasmon resonance(SPR)and liquid-based cytology test(LCT).Patients with positive cytology test then

colposcope and cervical biopsy.Results 210 cases of positive HPV specimens were detected and the infection rate was 19.00%.23 genotypes were detected,including 16 high-risk HPV(HR-HPV)genotypes and 7 low-risk HPV(LR-HPV) genotypes.Among 1 105 cases,169 cases(15.29%)were single HR-HPV genotypes and the average viral load was(170.59±85.91)m°;20 cases(1.81%)were single LR-HPV genotypes and the average viral load was(111.75±37.39)m°;21 cases(1.90%)had multiple HPV infection.The average viral load of patients with positive single HR-HPV was significantly higher than that of negative patients,with statistical difference(Z=-3.256,P=0.001).Conclusions SPR combined with LCT can help for diagnosis of cervical precancerous lesions, which has guiding significance for further clinical treatment.

Human papillomavirus(HPV);Genotype;Cervical squamous intraepithelial lesion;Surface plasmon resonance(SPR); Liquid-based cytology test(LCT)

R737.33

A

10.3969/j.issn.1674-4659.2017.05.0608

2016－10－21

2017-03-15

翁潔玲 （1981－），女，碩士學位，主治醫師，從事臨床病理診斷工作。

*通訊作者：王芳，病理主治醫師，E-mail：wangfang@sysucc.org.cn。