煙草花葉病毒山西番茄分離物的全基因組序列測(cè)定及分析

龐小靜趙慧琪王德富劉 勇牛顏冰*

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南長(zhǎng)沙410125）

煙草花葉病毒山西番茄分離物的全基因組序列測(cè)定及分析

龐小靜1趙慧琪1王德富1劉 勇2牛顏冰1*

（1山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太谷 030801；2湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，湖南長(zhǎng)沙410125）

為明確山西省晉中市侵染番茄的病毒種類(lèi)，采用雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）技術(shù)和非序列依賴(lài)PCR擴(kuò)增（sequence-independent amplification，SIA）方法對(duì)感病番茄進(jìn)行分子鑒定。序列測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)，具有花葉、卷曲癥狀的番茄為煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）所侵染。進(jìn)一步克隆TMV番茄分離物（TMV-SXFQ）的全基因組序列，得到TMV-SXFQ（GenBank登錄號(hào)為JX993906）全長(zhǎng)為6 394 bp，含4個(gè)開(kāi)放閱讀框（open reading frame，ORF）。序列比對(duì)分析表明，TMV-SXFQ與煙草花葉病毒屬其他分離物的同源性為86.3%～99.6%；系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，TMV-SXFQ與韓國(guó)分離物IM聚為一簇、親緣關(guān)系最近。

番茄；病原鑒定；煙草花葉病毒；序列分析

番茄（Solanum lycopersicumL.）為茄科番茄屬一年生草本植物，具有生津止渴、健胃消食、清熱解毒、補(bǔ)腎利尿等功效。作為廣泛種植的蔬菜作物之一，番茄對(duì)我國(guó)的農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)具有重要影響。據(jù)統(tǒng)計(jì)，近年來(lái)我國(guó)每年番茄產(chǎn)量可達(dá)5 000萬(wàn)t以上，2015年更是達(dá)到了5 594萬(wàn)t，占全國(guó)蔬菜總產(chǎn)量的7.1%；2016年繼續(xù)增加，全國(guó)番茄種植面積約110萬(wàn)hm2（1 648萬(wàn)畝），總產(chǎn)量約5 686萬(wàn)t（馬兆紅，2017）。但從20世紀(jì)60年代起番茄病毒病在我國(guó)廣為傳播，嚴(yán)重影響了番茄的產(chǎn)量和品質(zhì)。病毒病作為威脅番茄生產(chǎn)的主要病害之一（周雪平和錢(qián)秀紅，1996），造成某些地區(qū)春播番茄減產(chǎn)30%左右，而對(duì)夏、秋播番茄影響更大，嚴(yán)重者甚至絕產(chǎn)，經(jīng)濟(jì)損失巨大（馮蘭香 等，1987；周建國(guó) 等，2013）。目前，侵染番茄的病毒主要有煙草花葉病毒（Tobacco mosaic virus，TMV）、黃瓜花葉病毒（Cucumber mosaic virus，CMV）、煙草卷葉病毒（Tobacco leaf curl virus，TLCV）、苜蓿花葉病毒（Alfalfa mosaic virus，AMV）、番茄褪綠病毒（Tomato chlorosis virus，ToCV）、番茄黃化曲葉病毒（Tomato yellow leaf curl virus，TYLCV）等（張桂芝，2011；Zhao et al.，2013；趙黎明 等，2014）。

晉中地區(qū)作為山西省番茄主產(chǎn)區(qū)之一，筆者于2012～2013年在對(duì)番茄種植基地進(jìn)行調(diào)研時(shí)發(fā)現(xiàn)，番茄病毒病在山西省晉中地區(qū)暴發(fā)嚴(yán)重，造成了番茄產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重下降，對(duì)番茄產(chǎn)業(yè)發(fā)展以及當(dāng)?shù)剞r(nóng)民的經(jīng)濟(jì)收入影響頗大。為了明確山西省晉中市感病番茄的主要病毒種類(lèi)，選擇表現(xiàn)花葉、卷曲癥狀較嚴(yán)重的太谷縣番茄種植田塊進(jìn)行深入調(diào)查和分析，利用雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）技術(shù)（Tzanetakis & Martin，2008）和非序列依賴(lài)PCR擴(kuò)增（sequence-independent amplification，SIA）方法（牛顏冰 等，2014）對(duì)采集的番茄疑似病樣進(jìn)行鑒定，經(jīng)序列測(cè)定發(fā)現(xiàn)晉中地區(qū)的番茄被煙草花葉病毒（TMV）所侵染，并將其命名為T(mén)MV-SXFQ；進(jìn)一步對(duì)TMV-SXFQ進(jìn)行全基因組克隆及分析，明確其分類(lèi)地位，以期為防御和控制番茄病毒病提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

番茄疑似病樣于2012年7月采自山西省太谷縣番茄種植田塊，病株葉片表現(xiàn)出褪綠黃化、卷曲等癥狀（圖1），采集后-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

圖1山西省太谷縣番茄植株田間感病癥狀

1.2主要試劑

莫洛尼鼠白血病病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）和RNasin核酸酶抑制劑購(gòu)自Promega公司；克隆載體pMD18-T購(gòu)自TaKaRa公司；Taqplus DNA polymerse、Taq DNA polymerse和DNA回收試劑盒購(gòu)自Sangon Biotech公司，CF-11購(gòu)自Whatman公司。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 生物學(xué)接種試驗(yàn) 取少許疑似番茄病樣葉片，用磷酸緩沖液充分研磨，將其汁液用石英砂摩擦接種于指示植物煙草上，觀察癥狀。

1.3.2 植物病原雙鏈RNA（dsRNA）的提取 選取癥狀明顯的花葉和卷曲葉片，參照牛顏冰等（2011a，2011b）、Tzanetakis和Martin（2008）的方法，采用CF-11纖維素分離病毒dsRNA。首先將10 g病樣用液氮充分研磨，加入10～15 mL提取液，充分混勻，4 ℃、4 800 r·min-1離心5 min，取上清液，加入等體積酚/氯仿去除蛋白；然后用CF-11去分離dsRNA，加入1/10體積3 mol·L-1NaAC和3倍體積的無(wú)水乙醇沉淀dsRNA；最后用75%乙醇洗滌、干燥，溶于ddH2O，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 非序列依賴(lài)性PCR（SIA）和病毒全基因組擴(kuò)增 以提取的病樣dsRNA為模板，利用隨機(jī)引物XTN269反轉(zhuǎn)錄獲得病毒cDNA模板，然后再利用引物XTN177進(jìn)行SIA檢測(cè)，初步確定感染番茄的病毒種類(lèi)，具體反應(yīng)體系和程序參照牛顏冰等（2015）的方法進(jìn)行。

為進(jìn)一步確定侵染番茄的病原種類(lèi)，根據(jù)SIA結(jié)果以及NCBI的GenBank中已收錄的其他TMV分離物保守區(qū)設(shè)計(jì)了6對(duì)特異引物（表1）進(jìn)行病毒全基因組擴(kuò)增，其中引物TMV-F1/TMV-R1、TMV-F2/TMV-R2、TMV-F3/TMV-R3擴(kuò)增病毒5′端非編碼區(qū)及ORF1，引物TMV-F4/TMV-R4、TMV-F5/TMV-R5擴(kuò)增病毒ORF2和ORF3，引物TMV-F6/TMV-R6擴(kuò)增病毒ORF4及3′端非編碼區(qū)；以健康番茄作為陰性對(duì)照。

1.3.4 PCR產(chǎn)物克隆及序列分析 利用瓊脂糖凝膠電泳分離目的條帶，采用DNA純化試劑盒回收后將其與PMD18-T Vector進(jìn)行連接，然后用大腸桿菌DH5α轉(zhuǎn)化，通過(guò)菌落PCR鑒定，隨機(jī)選取3個(gè)陽(yáng)性克隆送至北京華大基因研究中心進(jìn)行測(cè)序。利用GenBank對(duì)所得序列進(jìn)行BLAST檢索，再用DNASTAR中的SeqMan軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接。利用DNAMAN軟件對(duì)所得序列與已報(bào)道的TMV分離物進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列的同源性和相似性比較，并運(yùn)用MEGA 5.2軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

表1 PCR擴(kuò)增所用引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1生物學(xué)接種試驗(yàn)結(jié)果

接種14 d后，在指示植物煙草上觀察到花葉癥狀（圖2），初步證明該番茄病害可能是由病毒引起的。

圖2生物學(xué)接種試驗(yàn)結(jié)果

2.2 dsRNA提取和SIA檢測(cè)

將提取的病樣dsRNA用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，得到大小約6 000 bp的條帶；健康對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。然后再選用隨機(jī)引物XTN269/ XTN177，以提取的dsRNA為模板進(jìn)行SIA檢測(cè)，得到大小為963 bp的條帶；健康對(duì)照仍未擴(kuò)增出任何條帶（圖3）。經(jīng)克隆、測(cè)序和序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)該片段與TMV相似性最高，初步揭示山西省晉中市番茄可能被TMV所侵染，并將該分離物命名為T(mén)MV-SXFQ。

2.3 TMV-SXFQ全基因組克隆及分析

2.3.1 TMV-SXFQ全基因組序列的克隆 為了進(jìn)一步確定山西省晉中市番茄所感染的病毒病病原是否為T(mén)MV，以提取的病樣dsRNA為模板，采用6對(duì)特異引物進(jìn)行全基因組克隆。結(jié)果得到的片段大小與預(yù)期相符，分別為1 062、1 300、1 247、1 409、1 353 bp和923 bp（圖4），而健康對(duì)照未擴(kuò)增出相應(yīng)大小的片段。

圖3 SIA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果

圖4 TMV-SXFQ的PCR檢測(cè)結(jié)果

2.3.2 TMV-SXFQ全基因組序列分析 經(jīng)序列測(cè)定和拼接獲得了TMV-SXFQ全基因組序列（GenBank登錄號(hào)為JX993906），序列分析顯示TMV-SXFQ全長(zhǎng)為6 394 bp，含有4個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF），其中ORF1起始于69位核苷酸，終止于3 419位，編碼1 116個(gè)氨基酸，產(chǎn)生分子量為129 kD的蛋白；ORF2是由ORF1超讀產(chǎn)生，ORF1終止子為T(mén)AG，其后為CAATTA序列，這是煙草花葉病毒屬病毒ORF1通讀的典型特征，該結(jié)構(gòu)增強(qiáng)了終止密碼子的通讀結(jié)構(gòu)而產(chǎn)生較大的閱讀框ORF2，ORF2終止于4 919位，含有4 851個(gè)核苷酸，編碼1 615個(gè)氨基酸，產(chǎn)生分子量為181 kD的通讀蛋白，129 kD及181 kD兩個(gè)蛋白均與病毒的復(fù)制相關(guān)；ORF3由807個(gè)核苷酸組成，編碼268個(gè)氨基酸，得到分子量為29 kD的移動(dòng)蛋白（movement protein，MP）；ORF4含有480個(gè)核苷酸，編碼159個(gè)氨基酸，得到分子量為17 kD的外殼蛋白（coat protein，CP）。TMV-SXFQ基因組5′ 端UTR和3′ 端UTR長(zhǎng)度分別為68、203 bp（圖5）。綜合分析結(jié)果顯示，TMVSXFQ與煙草花葉病毒屬其他分離物的基因組結(jié)構(gòu)基本一致。

圖5 TMV-SXFQ基因組結(jié)構(gòu)示意圖

2.4 TMV-SXFQ序列相似性分析

將TMV-SXFQ全序列與來(lái)自中國(guó)、日本、韓國(guó)、澳大利亞、美國(guó)、西班牙等地區(qū)的17個(gè)煙草花葉病毒屬分離物進(jìn)行核苷酸序列、氨基酸序列同源性和相似性比較分析。結(jié)果表明（表2），TMVSXFQ分離物與其他TMV分離物的核苷酸序列同源性為86.3%～99.6%；其中與來(lái)自韓國(guó)的侵染本氏煙的分離物IM同源性最高，達(dá)99.6%；而與來(lái)自中國(guó)臺(tái)灣的侵染矮牽牛的分離物pet-TW以及來(lái)自美國(guó)的分離物Ohio V同源性最低，為86.3%。對(duì)編碼的129 kD、181 kD、移動(dòng)蛋白（MP）、外殼蛋白（CP）進(jìn)行氨基酸序列同源性分析，發(fā)現(xiàn)129 kD和181 kD復(fù)制相關(guān)蛋白與其他TMV分離物同源性分別為94.5%～99.4%、95.5%～99.6%，其中與來(lái)自中國(guó)山東的侵染本氏煙的分離物Jimo同源性最高，分別為99.4%、99.6%，與來(lái)自美國(guó)的分離物Ohio V同源性最低，分別為94.5%、95.5%；MP與來(lái)自韓國(guó)的分離物IM同源性最高，為99.6%，與TMV其他分離物同源性為88.0%～98.8%；CP與來(lái)自韓國(guó)的分離物IM、中國(guó)山東的分離物Jimo以及西班牙的分離物WT-L2同源性均為100%，與其他TMV分離物同源性為95.6%～99.4%。綜合分析TMV編碼的這4種蛋白中，CP最保守，129 kD和181 kD蛋白次之，MP變異最大；而TMV-SXFQ與Ohio V分離物同源性最低、親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

表2 TMV-SXFQ與Tobamovirus中已報(bào)道的分離物核苷酸及氨基酸同源性比較結(jié)果

為了確定TMV-SXFQ編碼變異最大的MP變異情況，將TMV-SXFQ的MP氨基酸序列與其同源關(guān)系比較高的5個(gè)分離物，即韓國(guó)分離物IM、中國(guó)山東分離物Jimo、中國(guó)貴州分離物Pingtan-2、中國(guó)山西分離物Shanxi以及西班牙分離物WT-L2的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)在MP蛋白的氨基酸序列中存在8個(gè)氨基酸變異，分別位于第18、52、135、225、228、244、248、260位（圖6）。

2.5 TMV-SXFQ系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖6 TMV-SXFQ與其同源關(guān)系比較高的5個(gè)分離物的MP氨基酸序列一致性分析結(jié)果

為了進(jìn)一步研究TMV-SXFQ的起源與進(jìn)化關(guān)系，利用MEGA 5.2軟件與已報(bào)道的其他煙草花葉病毒屬分離物構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。從圖7可以看出，TMV-SXFQ與其他TMV分離物形成一個(gè)大分支，其中與韓國(guó)分離物IM單獨(dú)聚為一簇，親緣關(guān)系最近，與中國(guó)臺(tái)灣分離物pet-TW和美國(guó)分離物Ohio V親緣關(guān)系最遠(yuǎn)；而TMVSXFQ與煙草花葉病毒屬其他分離物如地黃花葉病毒（Rehmannia mosaic virus，ReMV）和番茄花葉病毒（Tomato mosaic virus，ToMV）的進(jìn)化關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，這也進(jìn)一步說(shuō)明TMV-SXFQ為T(mén)MV分離物。

圖7 TMV-SXFQ與已報(bào)道的煙草花葉病毒屬分離物的氨基酸序列系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 結(jié)論與討論

植物病毒是危害作物的主要病原物之一，煙草花葉病毒屬（Tobamovirus）病毒在世界各地均有分布，寄主范圍也特別廣泛，可侵染茄科、十字花科、葫蘆科、豆科、藜科、木犀科、莧科、菊科、商陸科等36科逾300種植物（雷彩燕 等，2005；侯紅琴 等，2008；黃永山和譚海文，2013；王德富等，2016）。根據(jù)國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)（International Committee on Taxonomy of Viruses，ICTV）第八次分類(lèi)報(bào)告，Tobamovirus有22個(gè)種和1個(gè)暫定種（Briddon et al.，2005），煙草花葉病毒作為煙草花葉病毒屬的典型成員，早在1892年就被發(fā)現(xiàn)。目前TMV的株系很多，甚至在同一寄主上都會(huì)有不同的株系。過(guò)去，TMV株系主要依據(jù)其侵染植物的癥狀與寄主范圍來(lái)劃分。但是，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，對(duì)其基因組序列進(jìn)行擴(kuò)增和比較分析，可以發(fā)現(xiàn)不同株系間的微小差異，從而在不同寄主植物上不斷獲得TMV新株系（雷彩燕 等，2005）。

本試驗(yàn)從山西省晉中市太谷縣感病番茄中檢測(cè)到煙草花葉病毒山西番茄分離物（TMV-SXFQ），進(jìn)一步進(jìn)行同源性和系統(tǒng)進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)TMVSXFQ與煙草花葉病毒屬其他分離物的同源性為86.3%～99.6%，其中CP最保守，MP變異最大；系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示TMV-SXFQ與韓國(guó)分離物IM單獨(dú)聚為一簇，親緣關(guān)系最近。通過(guò)對(duì)TMV不同株系進(jìn)行基因組結(jié)構(gòu)及變異分析，可以為抗病毒基因工程提供一定的理論與技術(shù)支持，而TMV-SXFQ新株系全基因組的獲得將為番茄病毒病的有效防治提供一定的參考依據(jù)。

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Complete Whole Genome Sequence Measure and Analysis of Tobacco mosaic virus Infecting Tomato in Shanxi

PANG Xiao-jing1，ZHAO Hui-qi1，WANG De-fu1，LIU Yong2，NIU Yan-bing1*

（1CollegeofLifeSciences，ShanxiAgriculturalUniversity，Taigu030801，Shanxi，China；2PlantProtectionInstitute，HunanAcademyofAgriculturalScience，Changsha410125，Hunan，China）

To identify the virus pathogen inducing tomato（Solanum lycopersicumL.）mosaic and curl disease at Jinzhong City of Shanxi Province，the technology of double-stranded RNA（dsRNA）and sequenceindependent amplification（SIA）were used．Results of SIA and sequencing showed that there wasTobacco mosaic virus（TMV）in affected tomato leaves．Further cloning the whole genome sequence of TMV（TMVSXFQ），the TMV-SXFQ was gained（GenBank No. JX993906），which was 6 394 bp in length and presented a typicalTobamovirusgenome organization with 4 ORFs．Sequence comparative analysis showed that the homology of TMV-SXFQ andTobacco mosaic virusand other isolates was 86.3%-99.6%．Phylogenetic analysis suggested that TMV-SXFQ isolates had closeer ties consanguinity with IM strain from South Korea and these 2 isolates formed an independent branch．

Tomato；Pathogen identification；Tobacco mosaic virus（TMV）；Sequence analysis

龐小靜，女，碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：分子植物病毒學(xué)，E-mail：18235412750@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：牛顏冰，女，教授，碩士生導(dǎo)師，專(zhuān)業(yè)方向：分子植物病毒學(xué)和中藥GAP，E-mail：niuyanbingbest@163.com

2017-02-10；接受日期：2017-04-22

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專(zhuān)項(xiàng)（201303028），國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31540050）