全自動烷基汞分析儀測定飼料中的甲基汞和乙基汞

汪海濱， 唐雪娟， 李浩洋

（1.中山市第一中等職業技術學校，廣東中山 528400；2.中山海關技術中心，廣東中山 528400）

汞在自然界中主要以無機汞和有機汞等形式存在，有機汞的毒性強于無機汞，其中甲基汞是毒性最強的有機汞，乙基汞的毒性次之。甲基汞和乙基汞均具有親脂性、生物累積性和生物放大效應，可通過食物鏈遷移危害人體健康，尤其是甲基汞對中樞神經系統易造成不可逆的傷害 （張蘭等，2009）。因此，自日本水俁病事件發生后，有機汞造成的食源性危害引起了世界的廣泛關注（Elinal等，2007）。飼料是動物養殖過程中獲取營養元素的主要來源，其所含有的有機汞能在動物體內富集進而威脅人們身體健康（陳巖等，2016；丁紅梅等，2013）。因此，對飼料中有機汞檢測方法的研究具有重要意義。

目前，比較成熟的甲基汞和乙基汞分析方法主要為液相色譜-原子熒光光譜法 （LC-AFS）（李浩洋等，2019；孫蕾等，2018）、液相色譜-電感耦合等離子體質譜法 （LC-ICP-MS）（熊文明等，2013；張蘭等，2009）和氣相色譜-原子熒光光譜法 （GC-AFS）（蘇榮等，2017； 崔穎等，2016） 等。LC-AFS可以達到很好的分離效果，但由于流動相的稀釋，其檢出限相對較高，而LC-ICP-MS價格昂貴，限制了其在日常檢測中的應用（顧昱曉，2013）。GC-AFS易與吹掃捕集方法聯用，具有較強的分離能力和更好的靈敏度（崔穎等，2016）。全自動烷基汞分析儀將吹掃捕集模塊、氣相色譜模塊和原子熒光光譜模塊有效整合，具有靈敏度高、準確性好、操作簡單等優點（唐麗嶸等，2017）。因此，本研究擬建立全自動烷基汞分析儀測定飼料中甲基汞和乙基汞的方法，以期為飼料的檢驗監管提供強有力的技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 甲基汞標準品 [（69.5±2.6）μg/g，中國計量科學研究院]；乙基汞標準品[（70.6±2.5）μg/g， 中國計量科學研究院]；ERM-CE464 金槍魚標準物質 （Joint Research Centre，European Reference Materials）；甲醇（色譜純）、氫氧化鉀、鹽酸（優級純）；實驗用水為超純水；醋酸鈉緩沖溶液（pH≈5.8）：稱取27.2 g三水合醋酸鈉溶于80 mL超純水中，加入1.0 mL醋酸，用超純水定容至100 mL；衍生試劑：將 100 mL 2%（m/V）氫氧化鉀溶液置于0℃冰箱中凍至出現冰晶，加入1.0 g四丙基硼化鈉粉末，混勻后分裝到色譜樣品瓶中，冷凍備用；飼料樣品為市售。

MERX-M型全自動烷基汞分析儀 （美國Brooks Rand公司）；DKN612C型烘箱 （日本YAMATO公司）。

1.2 儀器工作條件 原子熒光檢測器電壓為670 V，氣相色譜柱為OV-3填充柱 （340 mm×1.59 mm），溫度為41℃，吹掃捕集氣為氮氣，氮氣流速為344 mL/min，吹掃捕集時間為9 min，Tenex管解析加熱時間為9.9 s，捕集管干燥時間為5 min，干燥氣為氮氣，干燥氣流速為233 mL/min，氣相色譜載氣為氬氣，氬氣流速為27.5 mL/min。

1.3 標準工作溶液配制 采用稱量法，用去離子水配制甲基汞和乙基汞混合標準儲備液，其中甲基汞和乙基汞的濃度均為100 pg/mL。在經過高溫凈化的40 mL棕色進樣瓶內提前加入34~38 mL去離子水， 然后分別加入 0.10、0.50、1.00、2.50、5.00 mL混合標準儲備液，再加入0.5 mL醋酸鈉緩沖溶液和50μL衍生試劑，進行衍生化反應，最后加超純水至40 mL，顛倒混勻，待測；此時，棕色進樣瓶內分別含有 10、50、100、250、500 pg 甲基汞和乙基汞。

1.4 金槍魚對照品制備 在ERM-CE464金槍魚標準物質中添加一定量的乙基汞標準品，得到金槍魚對照品，其中甲基汞的參考值為 （5.50±0.17）mg/kg，乙基汞的參考值為 2.00 mg/kg。

1.5 樣品前處理 準確稱量0.2 g（精確到0.0001 g）飼料樣品至高速離心管中，加10 mL 25%氫氧化鉀/甲醇溶液，在烘箱中60℃加熱5 h，然后以3000 r/min離心15 min。同時做試劑空白。提取過程中，每隔2 h用渦旋振蕩儀渦旋一次，使提取液與樣品充分接觸。在經過高溫凈化的40 mL棕色進樣瓶內提前加入36～38 mL超純水，然后加入0.1 mL處理好的空白溶液或樣品溶液，用10%HCl調節pH到6～8后，再加入0.5 mL醋酸鈉緩沖溶液和50μL衍生試劑，進行衍生化反應，最后加超純水至40 mL，顛倒混勻，得到空白上機溶液和樣品上機溶液。

2 結果與討論

2.1 提取方法的優化 目前，有機汞的提取方式主要有酸法和堿法，其中酸法常與超聲或微波輔助技術相結合（孫蕾等，2018；熊文明等，2013），堿法則可以直接加熱進行提取（蘇榮等，2017）。本研究分別采用鹽酸微波輔助提取、鹽酸超聲輔助提取和堿法直接加熱提取對飼料樣品進行試驗。結果表明，酸法前處理后的部分樣品上機溶液在吹掃捕集過程中，無法通過氣液分離器完全分離，少許溶液被吹掃進Tenax捕集管中，導致儀器無法運行。因此，試驗選擇 10%、15%、20%、25%、30%氫氧化鉀/甲醇溶液60℃加熱5 h，對飼料樣品和金槍魚對照品中的甲基汞和乙基汞進行檢測，結果見表1。結果表明：低濃度的氫氧化鉀/甲醇溶液對飼料中甲基汞和乙基汞的提取效率較低，但隨著氫氧化鉀濃度的增加，飼料中甲基汞和乙基汞的檢測值也不斷升高，當氫氧化鉀/甲醇溶液濃度超過25%后，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值最高且無明顯變化，而金槍魚對照品的檢測值與參考值相符，這說明飼料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取過程中甲基汞和乙基汞的形態未發生轉化。因此，選擇25%氫氧化鉀/甲醇溶液60℃加熱5 h作為本研究的提取方法。

表1 提取液濃度對測定結果的影響

2.2 提取溫度的優化 提取溫度會影響有機汞的回收率以及不同形態汞之間的轉化 （冷庚等，2012）。 本研究在不同提取溫度（40、50、60、70 ℃）下對飼料樣品和金槍魚對照品進行試驗，結果見表2。結果表明：隨著溫度的升高，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值也隨之升高，當提取溫度為60℃時，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值達到最高，且金槍魚對照品的檢測值與參考值相符。而當提取溫度為70℃，甲基汞和乙基汞的檢測值反而降低，這可能是因為甲醇的沸點為64.7℃，當溫度超過64.7℃后，樣品和金槍魚對照品中的甲基汞和乙基汞隨著甲醇的蒸發而逸出，導致檢測值偏低。由此可知，當提取溫度為60℃時，飼料中的甲基汞和乙基汞已被完全提取，且在提取過程中甲基汞和乙基汞的形態未發生轉化。

表2 提取溫度對測定結果的影響

2.3 提取時間的優化 本研究在不同提取時間（1、2、3、4、5、6 h）下對飼料樣品進行試驗。 試驗結果表明：隨著提取時間的延長，飼料樣品中甲基汞和乙基汞的檢測值也隨之升高。當提取時間超過5 h后，增加提取時間，甲基汞和乙基汞的測定結果均無明顯變化，故從節約時間的角度考慮，選擇提取時間為5 h（圖1）。

2.4 色譜條件的選擇 影響Hg0、甲基汞、乙基汞和Hg2+衍生化產物分離程度的主要因素有兩個：一是載氣流速，二是氣相色譜柱溫度。選擇載氣流速為27.5 mL/min，氣相色譜溫度為41℃作為本研究的色譜條件，在此色譜條件下，樣品溶液中Hg0（1）、甲基汞（2）、乙基汞（3）和 Hg2+（4）衍生化產物能實現完全分離，且甲基汞（2）、乙基汞（3）的峰形對稱（圖2）。

2.5 工作曲線和檢出限 將標準工作溶液和空白上機溶液上機測定，分別以甲基汞和乙基汞衍生化產物的峰高響應值對應其含量繪制標準工作曲線，其中，甲基汞的曲線方程為：Y=237.75X+120.67，線性相關系數r=0.9996，方法檢出限為3 μg/kg，方法定量限為8μg/kg；乙基汞曲線方程為：Y=105.18X+152.08，線性相關系數 r=0.999 6，方法檢出限為4μg/kg，方法定量限為13μg/kg，能夠滿足飼料中甲基汞和乙基汞的分析要求。250 pg標準工作溶液色譜圖見圖3。

2.6 方法精密度和回收率實驗 平行稱取飼料樣品7份，進行7次獨立實驗，測定結果的相對標準偏差（RSD）即為方法精密度，甲基汞和乙基汞的RSD分別為4.58%和5.19%。另平行稱取飼料樣品9份，分別進行高、中、低3個濃度水平的加標回收實驗，甲基汞的平均回收率為91.1%～98.2%，乙基汞的平均回收率為88.5%～95.7%（表3）。

表3 方法精密度（n=7）和回收率實驗（n=3）

2.7 樣品分析 應用建立的方法對220批市售飼料樣品進行檢測，包括魚飼料50批、蝦飼料20批、蟹飼料20批、飼料用紅魚粉20批、雞飼料50批、鴨飼料20批、豬飼料30批，其結果見表4。由表4可知，雞、鴨和豬飼料樣品中均未檢出甲基汞和乙基汞，而部分水產飼料樣品（魚、蝦、蟹飼料及飼料用紅魚粉）中檢出了甲基汞和乙基汞，但含量水平較低。

表4 樣品分析結果

3 結論

本試驗建立了堿法提取-全自動烷基汞分析儀測定飼料中甲基汞和乙基汞的方法，該法操作簡單，結果準確，靈敏度高，適用于飼料中甲基汞和乙基汞的測定。