溶劑對石榴渣中黃酮的提取及抗氧化活性影響

祁冰潔, 趙秀紅, 孫 麗

(1. 沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 計(jì)算機(jī)與數(shù)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)部, 沈陽 110034)

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食品與糧食

溶劑對石榴渣中黃酮的提取及抗氧化活性影響

祁冰潔1, 趙秀紅1, 孫 麗2

(1. 沈陽師范大學(xué) 糧食學(xué)院, 沈陽 110034; 2. 沈陽師范大學(xué) 計(jì)算機(jī)與數(shù)學(xué)基礎(chǔ)教學(xué)部, 沈陽 110034)

由于石榴產(chǎn)品的推廣,石榴產(chǎn)品生產(chǎn)過程中生產(chǎn)的廢棄物越來越多。其中石榴渣中的黃酮類物質(zhì)具有抗氧化活性,可用于預(yù)防心腦血管疾病、阿爾茲海默癥、帕金森病、腫瘤發(fā)生和提高免疫力。研究提取石榴渣中黃酮類物質(zhì)的條件,為合理開發(fā)利用石榴渣副產(chǎn)物提供理論依據(jù)。采用改良的菲林法測定石榴渣中總酚含量,DPPH和ABTS方法進(jìn)行抗氧化性測定,比較研究不同提取溶劑:石油醚、乙酸乙酯、100%丙酮、70%丙酮、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水對石榴渣中的黃酮提取物的提取率、總酚、總黃酮和抗氧化活性的影響。結(jié)果得出結(jié)論:利用70%乙醇溶液提取的石榴渣提取物具有最高的提取率、總酚、總黃酮和抗氧化活性。

石榴渣; 酚類; 黃酮類; 抗氧化性

0 引 言

石榴(PunicagranatumL.)屬于石榴科(Pnuicaceae)石榴屬(PunicaL.)植物原名安石榴,原產(chǎn)于伊朗、阿富汗等小亞細(xì)亞國家[1]。隨著市場經(jīng)濟(jì)的發(fā)展,石榴的栽培面積不斷擴(kuò)大,產(chǎn)量呈明顯的上升趨勢。石榴加工的新產(chǎn)品如果汁、果酒層出不窮。但在產(chǎn)品規(guī)模不斷擴(kuò)大的同時(shí),很多加工剩余廢料被大量棄置。關(guān)于加工廢料的利用在我國已不鮮見,例如我國東北地區(qū)的藍(lán)莓,在汁液榨取之后,剩余部分被晾干制成藍(lán)莓干。與其他水果不同的是,石榴渣滓中約有20%～30%為石榴籽,直接食用影響口感。大量研究表明,石榴渣中含有大量的黃酮類物質(zhì),具有顯著的抗氧化活性。可用于預(yù)防心腦血管疾病和提高免疫力[1]。

在黃酮類物質(zhì)的研究中,常采用醇類物質(zhì)作為提取溶劑,根據(jù)研究表明,黃酮在甲醇中具有更好的提取效果[2]。然而在實(shí)際生產(chǎn)中,考慮到綠色環(huán)保安全生產(chǎn)的目的,一般不采用甲醇而采用乙醇作為提取溶劑。不同植物的種子和果實(shí)中,黃酮的種類和含量具有相對特異性。在石榴種子和果實(shí)中的黃酮高達(dá) 33種,含有9種花色苷、6種黃烷醇、1種黃烷酮苷、2種黃酮醇、3種黃酮醇苷、3種黃酮、5種黃酮苷和1種二氫黃酮醇苷[3]。根據(jù)相似相溶原理,不同提取溶劑對極性相同的黃酮具有較好的溶解能力。關(guān)于不同提取溶劑對石榴渣中黃酮類物質(zhì)提取過程的影響還未有報(bào)道。在本研究中,根據(jù)不同極性選擇不同的提取溶劑,對石榴渣中的總酚和總黃酮以及相關(guān)的抗氧化性進(jìn)行了研究,進(jìn)而為合理開發(fā)利用石榴渣副產(chǎn)物提供理論依據(jù)。

1 方法和材料

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

石榴采購品種為新疆皮亞曼石榴,將石榴切開后榨汁,剩余的渣滓冷凍保存。

實(shí)驗(yàn)試劑:Folin-Ciocalteu試劑,DPPH(2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl),ABTS[2,20-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonicacid],trolox(6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid),均購自于Sigma Chemical Co. (Sigma Chemical Co.,St. Louis,American) 。沒食子酸和蘆丁采購自 TCI Co. (TCI Co.,Shanghai,China) 。蒸餾水、40%乙醇、70%乙醇、無水乙醇、70%丙酮、100%丙酮、石油醚、乙酸乙酯等有機(jī)試劑及鹽酸、過硫酸鉀、亞硝酸鈉氯化鋁均購買自中國國藥集團(tuán)Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd (Sinopharm Chemical Reagent Co.,Ltd,Shanghai,China)。

1.2 提取方法

將榨取后的渣滓在50 ℃下24 h烘干,用粉碎機(jī)進(jìn)一步研細(xì)并過篩(孔徑0.25 mm),過篩后-20 ℃保存。稱取20 g樣品,加入200 mL提取溶劑超聲40 min,將提取液以6 000 r/min的速度離心10 min,留取上清液旋蒸濃縮,并在50 ℃條件下完全蒸干得到提取物。

1.3 總酚和總黃酮測定

采用改良的菲林法測定石榴渣中總酚含量[4]。40 μL樣品稀釋溶液和等量25%菲林試劑充分混合,室溫下經(jīng)過5 min反應(yīng),向其中加入140 μL 700 mM碳酸鈉溶液,避光反應(yīng)40 min,在765 nm波長下測量其吸光度。用沒食子酸做為標(biāo)準(zhǔn)品,總酚含量用每100 g樣品中沒食子酸當(dāng)量表示(GAE/100 g樣品)。

采用改良的鹽酸-氯化鋁法測定其中總黃酮的含量[5-7]。140 μL樣品稀釋溶液和8 μL 50 g/L亞硝酸鈉溶液混合反應(yīng)6 min,隨后加入 8 μL 100 g/L 氯化鋁溶液室溫下反應(yīng)5 min。接著向混合物中加入100 μL 40 g/L氫氧化鈉溶液室溫下反應(yīng)30 min。在410 nm波長下測量其吸光度。采用蘆丁做為標(biāo)準(zhǔn)品,總黃酮含量用每100 g樣品中蘆丁當(dāng)量表示(RE/100 g樣品)。

1.4 抗氧化性的測定

樣品提取物的抗氧化性采用DPPH和ABTS方法進(jìn)行測定,對照品為水溶性維生素E(trolox)。

DPPH檢測方法[8-9]:將40 μL 1 mM DPPH甲醇溶液和10 μL提取物水溶液混合,混勻后加入190 μL甲醇避光反應(yīng)30 min。517 nm波長下檢測其吸光度。結(jié)果用樣品濃度的EC50值表示。

ABTS檢測方法[8,10]:室溫下將7 mM ABTS 儲備液和2.4 mM 過硫酸鉀溶液等量混合反應(yīng)12～16 h. 檢測前將ABTS儲備液用48倍甲醇稀釋到吸光度為0.7±0.02,得到ABTS工作液。200 μL ABTS工作液與5 μL 樣品稀釋液混合30 ℃下避光反應(yīng)5 min。734 nm波長下檢測吸光度。結(jié)果用樣品濃度的EC50值表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同提取溶劑的提取率

不同提取溶劑提取率的檢測結(jié)果如圖1所示,按照不同的溶液極性,選取了石油醚、乙酸乙酯、100%丙酮、70%丙酮、100%乙醇、75%乙醇、50%乙醇、水8種不同溶劑。結(jié)果顯示70%和100%的乙醇溶液提取效果最好,分別為81.26%和79.76%。40%的乙醇溶液(74.58%)、70%丙酮溶液(74.17%)和水(67.22%)有所減少。而乙酸乙酯和石油醚的提取物為少量的油狀物,質(zhì)量忽略不計(jì),推測主要是種子中的脂肪酸和油脂。

圖1 不同溶劑的提取率Fig.1 Extracting rates of different solvents

通過比較發(fā)現(xiàn),醇類比丙酮類具有更好的提取效果,根據(jù)Masturah Markom等人的報(bào)道[11],70%的丙酮的極性是6.5,70%的乙醇極性是7.1,50%乙醇的極性是7.9,而丙酮、乙醇和水的極性分別是5.4、5.6和9.0。依據(jù)相似相溶原理判斷,石榴渣中的主要提取物的極性集中在6.5～7.9。通過對70%乙醇、40%乙醇和水溶液的比較發(fā)現(xiàn),隨著水比例的增加,溶劑的提取率在減小。通過比較70%和100%的乙醇發(fā)現(xiàn),提取物中可能存在一定量的黃酮苷類物質(zhì)。作為黃酮類物質(zhì)的2個(gè)組成部分,黃酮和黃酮苷在乙醇中都具有較好的溶解性,但黃酮苷在水中的溶解度比黃酮高,因此推測70%和100%乙醇溶液間的差異是由少量的黃酮苷引起的。

2.2 總酚和總黃酮含量測定

圖2 不同溶劑提取總酚含量Fig.2 Total amount ofphenolic compounds by different solvents

在我們研究的8種提取溶劑的總酚含量如圖2所示,總酚結(jié)果由沒食子當(dāng)量(GAE)表示。70%的乙醇有最高的總酚含量(37.54 g GAE/100 g樣品)。水(33.17 g GAE/100 g樣品)、40%(33.18 g GAE/100 g樣品)和100%乙醇溶液(31.99 g GAE/100 g樣品)相對比70%(12.88 g GAE/100 g)和100%丙酮(23.66 g GAE/100 g樣品)要高,在乙酸乙酯和石油醚中沒有檢測到總酚。

圖3 不同溶劑提取總黃酮含量Fig.3 Total amount of flavonoids by different solvents

該8種溶劑提取總黃酮的結(jié)果如圖3所示。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),總黃酮的結(jié)果比總酚要高,這是因?yàn)榭傸S酮與總酚的使用的標(biāo)準(zhǔn)品蘆丁比沒食子酸在單位質(zhì)量的分子中所含的羥基數(shù)目要多。總黃酮的變化趨勢與總酚相同,都是在70%(129.26 g RE/100 g樣品)處最高,水(110.34 g RE/100 g樣品),40%(113.30 g RE/100 g樣品)和100%(113.68 g RE/100 g樣品)乙醇溶液提取物比70%和100%丙酮提取物(92.19 g RE/100 g樣品、37.63 g RE/100g樣品)黃酮含量高。和總酚一樣,研究發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯和石油醚中也沒有總黃酮的檢測含量。

依據(jù)各個(gè)溶劑極性的變化順序,從純水到石油醚,最高的提取含量都集中在70%的乙醇上,說明在70%乙醇的作用下,能夠獲得最多的提取物,而且該提取物中主要成分是以黃酮類為代表的酚類物質(zhì)。由表1可知,總黃酮/總酚的數(shù)值隨乙醇的濃度增加而減小,說明低濃度乙醇提取物含有更多的非黃酮成分,且隨水的比例增加而增加,進(jìn)而說明非黃酮成分的酚類物質(zhì)是易溶于水且水溶性較脂溶性好。就黃酮成分而言,黃酮類物質(zhì)主要分黃酮苷元和黃酮苷兩類物質(zhì),黃酮苷是在乙醇和水中都能溶解,而對應(yīng)的黃酮苷元只能在乙醇中溶解不能在水中溶解,因此100%乙醇和水的差值近似等于黃酮苷所對應(yīng)的黃酮的質(zhì)量。排除這部分的黃酮就是具有黃酮結(jié)構(gòu)而不具有黃酮苷的聚合物質(zhì)。對于一般植物提取物來說,乙酸乙酯和石油醚主要用于提取其中酯類成分,在本次實(shí)驗(yàn)中乙酸乙酯和石油醚并未得到較高的提取率,說明在石榴種子中并未含有較多的油脂成分。

表1 總黃酮與總酚的相關(guān)性

2.3 抗氧化性測定

根據(jù)之前的研究,檢測DPPH和ABTS自由基清除能力是評價(jià)抗氧化性的重要手段[12]。關(guān)于石榴渣提取物的抗氧化性評價(jià)直觀反映了其相應(yīng)的開發(fā)利用價(jià)值。關(guān)于抗氧化性的結(jié)果如圖4所示。

圖4 不同溶劑提取物對DPPH和ABTS自由基清除能力Fig.4 The ability of DPPH free radical and ABTS free radical clearance by different solvents

DPPH的EC50值變化范圍從最低233.337 mg/L(70%乙醇提取物)到最高805.685 mg/L(100%丙酮提取物),而ABTS的變化范圍從最低203.387 mg/L(70%乙醇提取物)到最高682.107 mg/L(100%丙酮提取物),二者的變化趨勢相同。相對于標(biāo)準(zhǔn)品trolox,除了丙酮提取物之外,石榴渣提取物都具有較強(qiáng)的抗氧化性。與總酚和總黃酮變化相同的是,DPPH和ABTS表明70%乙醇提取物具有最強(qiáng)的抗氧化性。這說明總酚對抗氧化性有直接相關(guān)的作用,總黃酮作為總酚中重要的組成部分,這種作用尤其顯著。這可能是和酚羥基的數(shù)目和位置有關(guān)。根據(jù)Balasundram等人[13]的報(bào)道,抗氧化性隨著酚羥基的數(shù)目增多而增強(qiáng)。然而,在3-C和5-C位置的羥基具有更強(qiáng)的抗氧化作用。對于黃酮來說,由于結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,影響抗氧化性的因素也就更多。例如和B環(huán)和C環(huán)相連的羥基更會影響物質(zhì)的結(jié)構(gòu)特性等。根據(jù)前人的報(bào)道,通常黃酮在種子和果皮中含量較多的物質(zhì)為蘆丁、槲皮素和兒茶素系列[14]。因此70%乙醇提取物具有最強(qiáng)的抗氧化性是因?yàn)槠渲泻械狞S酮最多。另外值得注意的一點(diǎn)就是,在ABTS和DPPH檢測結(jié)果的趨勢變化中,40%乙醇提取物和水提取物之間高低順序發(fā)生了變化。在DPPH檢測中,40%乙醇提取物比水提取物略微高一些,而在ABTS中結(jié)果正好相反。推測這是由于在ABTS檢測中,只有酚類與其發(fā)生反應(yīng)清除自由基,而在DPPH檢測中,依據(jù)其反應(yīng)原理,DPPH自由基離子除了會和酚類反應(yīng)之外,也會和碳水化合物比如多糖進(jìn)行反應(yīng)。而在40%的乙醇提取物中,由于受到乙醇的醇降作用,其多糖含量相對較少一些,因此DPPH結(jié)果顯示水中自由基由于多糖物質(zhì)的存在清除自由基效果更好,EC50值更低[14]。

3 結(jié) 論

研究了不同提取溶劑作用下,石榴渣中的酚類尤其是黃酮類成分的含量及其相應(yīng)的抗氧化性。各組提取物由于其提取溶劑的極性不同,其相應(yīng)的提取率、總酚和總黃酮都略有差異。基于實(shí)驗(yàn)結(jié)果推斷70%乙醇提取物具有最高的提取率和突出的抗氧化性,其70%乙醇可以作為開發(fā)石榴渣的適宜提取溶劑。事實(shí)上,由于植物類天然提取物中多含有復(fù)雜的高聚合體,純化出各個(gè)單體組分似乎具有較大的困難。因此在工業(yè)生產(chǎn)上,擴(kuò)大提取純化加工的規(guī)模的過程,往往涉及到一系列的技術(shù)問題。

本研究主要是為類似廢棄提取物的開發(fā)利用提供了一種借鑒思路,通過總酚、總黃酮和抗氧化性相結(jié)合的方式綜合評述其開發(fā)價(jià)值,這種活性和物質(zhì)含量的相結(jié)合的方式也許更能說明植物總提取物比單一組分具有更強(qiáng)的實(shí)際食品生產(chǎn)價(jià)值。總而言之,這種結(jié)合方式能夠相對合理地評估植物廢棄物潛在的生物活性物質(zhì)。

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Extraction of flavonoids and effects of solvents on flavonoids profiles and antioxidant activities of pomegranate pomace

QI Bingjie1, ZHAO Xiuhong1, SUN Li2

(1. Collegeof Grain Science and Technology, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China; 2. Department of Basic Computer and Math, Shenyang Normal University, Shenyang 110034, China)

This article investigated the potential ability of pomegranate pomace as a resource of phenolic compounds. Due to the pomegranate product extension,an increasing amount of pomace are residual waste in the process of production. The flavonoids from pomegranate pomace with antioxidant activity could be used to prevent cardiocerebrovascular disease,Alzheimer disease,Parkinson’s diseases and tumorigenesis and improve immunity. This article deals with the extraction conditions of flavonoids from pomegranate pomace, and provides the basic data for the exploitation of pomegranate pomace. The total phenols in the pomegranate was determined by modified Folin-Ciocalteu reagent,and the antioxidant capacity was tested by using DPPH and ABTS methods. The extractants which have different affinity with polar solvents were investigated, which was reflected by the extract yield and content of total phenols and flavonoids with antioxidants by different polar solvents such as petroleum ether, ethyl acetate,and 100% acetone, 70% acetone, 100% ethyl alcohol, 75% ethyl alcohol,50% ethyl alcohol with distilled water were also investigated. The results show that the extraction with the 70% ethanol solution gives out the most extraction yield and highs antioxidant activity.

pomegranate pomace; phenols; flavonoids; antioxidants

1673-5862(2017)02-0193-05

2016-12-17。

遼寧省教育廳科學(xué)研究一般項(xiàng)目(L2015499,L2014436)。

祁冰潔(1964-),女(蒙古族),遼寧凌源人,沈陽師范大學(xué)副教授。

TS209

A

10.3969/ j.issn.1673-5862.2017.02.014