線粒體Miro1蛋白對無鎂致癇海馬神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用

王 英 連亞軍△ 謝南昌 高延倫 金 迪

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)河南平頂山第一人民院 平頂山 467000

線粒體Miro1蛋白對無鎂致癇海馬神經(jīng)元氧化應激損傷的保護作用

王 英1)連亞軍1)△謝南昌1)高延倫2)金 迪1)

1)鄭州大學第一附屬醫(yī)院 鄭州 450052 2)河南平頂山第一人民院 平頂山 467000

目的 探討線粒體Miro1蛋白在體外顳葉癲癇模型中氧化應激方面的保護作用及其機制。方法 原代培養(yǎng)新生24 h內的SD大鼠海馬神經(jīng)元，通過無鎂細胞外液誘導體外癲癇模型。培養(yǎng)至14 d的海馬神經(jīng)元隨機分為對照組(CON)、無鎂誘導組(AE)、無鎂誘導+rAd轉染組(AE+rAdv)、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組(AE+rAd-Miro1)，CON組及AE組分別用正常細胞外液和無鎂細胞外液作用3 h后，更換為正常維持液，腺病毒轉染組于無鎂誘導48 h前轉染腺病毒,各組分別于造模后24 h終止細胞培養(yǎng)，采用Western blot法檢測細胞內Miro1、ND6的表達，免疫熒光法檢測細胞內ND6表達，比色法測定MDA、GSH的表達。結果 與CON組比較，AE組Miro1表達升高，ND6表達降低，MDA表達升高，GSH表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組Miro1表達升高，ND6表達降低，MDA表達升高，GSH表達降低，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)；與AE組比較，AE+rAd-Miro1組Miro1、ND6表達升高，MDA表達降低，GSH表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。結論 線粒體蛋白Miro1對無鎂致癇海馬神經(jīng)元有保護作用，其機制可能與降低線粒體氧化應激損傷,提高ND6、GSH蛋白表達，降低MDA蛋白表達有關。

Miro1；癲癇；線粒體移動；氧化應激

癲癇是多種原因導致的腦部神經(jīng)元高度同步化異常放電所致的臨床綜合征，長期、反復的癲癇發(fā)作嚴重降低患者的生活質量，因而明確癲癇的發(fā)病機制及尋求新的治療靶點具有重要的現(xiàn)實意義。大量國內外研究證實，癲癇過程中存在線粒體功能及結構損傷[1-4]。線粒體移動可將受損線粒體逆行運動至胞體被降解和回收，同時將正常線粒體順向運動至神經(jīng)元的作用部位而發(fā)揮功能。正常的線粒體移動能夠保證細胞內線粒體的正確分布，保證病理狀態(tài)下線粒體在細胞中占領正確的位置，以應對病理損傷[5-8]。Miro1為線粒體銜接蛋白，在神經(jīng)細胞中通過免疫沉淀方法證實Miro1與Milton形成復合物并與Kinesin肌球重鏈(KHC)連接，調控線粒體沿微管的移動[9-10]。但到目前為止，線粒體移動異常在癲癇神經(jīng)元線粒體功能結構受損中發(fā)揮何種作用，能否通過調控線粒體銜接蛋白Miro1進而調控線粒體移動而發(fā)揮神經(jīng)保護作用仍然未知。本研究利用體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元癲癇放電，構建腺病毒真核表達質粒干預Miro1表達，研究對線粒體氧化應激損傷的影響，探討能否通過調控線粒體移動，減少線粒體氧化應激損傷發(fā)揮癲癇神經(jīng)保護作用，為臨床癲癇的治療提供新靶點。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物：新生24 h以內的SD大鼠，SPF級[鄭州大學動物實驗中心提供，許可證號SCxK(豫)2010-0002]。

1．1．2 主要試劑：Neurobasal Medium(Gibco)、DMEM/F-12(Gibco)、特級胎牛血清(Gibco)、PBS 液(HyClone)、牛胰島素(Sigma)、L-多聚賴氨酸(Sigma)、胰蛋白酶(Sigma)、B27(Gibco)、 Glutamax-I谷氨酰胺(Gibco)、青鏈霉素混合液(北京索萊寶)；RIPA裂解液(碧云天)；兔抗大鼠NSE多克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)；山羊抗兔 IgG/Cy3 熒光二抗 (北京博奧森生物技術有限公司)；Dylight594標記山羊抗兔熒光二抗(中杉金橋)；Anti- Miro1 antibody 抗體(abcam)；Anti-ND6抗體(santa cruz)；重組腺病毒真核表達質粒及對照腺病毒載體(吉凱基因公司)；丙二醛(MDA)測試盒(南京建成生物工程研究所)，谷胱甘肽(GSH)測試盒(南京建成生物工程研究所)。

1．2 方法

1．2．1 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng)：新生24 h內的SD大鼠，常規(guī)消毒，斷頭取腦，置于加有預冷 PBS的培養(yǎng)皿中，分離雙側海馬，剔除表面血管，并剪成約 1 mm×1 mm×1 mm的組織塊，轉移至15 mL的離心管中，加入0.125% 的胰酶后，置于 37 ℃ 恒溫箱中消化15 min，期間每隔5 min輕微振蕩數(shù)次，消化完畢后，加入PBS洗滌并終止消化，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，加入等量PBS溶液洗滌兩遍后加入種植液，吹打均勻制成細胞懸液。取少量細胞懸液用于臺盼藍染色計數(shù)，調整細胞密度為 5×105/mL，接種于6孔培養(yǎng)板中(預先以0.01% L-多聚賴氨包被)，每孔約 2 mL。置于37.5 ℃恒溫，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，等量換成維持液繼續(xù)培養(yǎng)，以后每3 d半量換維持液1次，并于倒置相差顯微鏡下觀察細胞生長情況，培養(yǎng)至 14 d的海馬神經(jīng)元可用于后續(xù)實驗。

1．2．2 NSE染色鑒定海馬神經(jīng)元：海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24孔板中生長至14 d后，進行NSE鑒定。吸棄培養(yǎng)基，PBS 漂洗1遍，然后用4%多聚甲醛固定20 min，PBS漂遍,每次5 min；0.25%Triton穿孔15 min，吸棄Triton,PBS漂洗3次，每次5 min；1% BSA 室溫下封閉 30 min，加入兔抗大鼠NSE 多克隆抗體(稀釋200 倍)4 ℃過夜，TBST漂洗3次，每次5 min，加入山羊抗兔 IgG/Cy3 熒光二抗，以下操作步驟均需避光進行，37 ℃作用1 h；TBST漂洗3次，每次 5 min，5 μg/mL DAPI 染色2 min，吸棄DAPI，TBST漂洗，抗熒光猝滅封片劑封片，放入濕盒避光保存，擇期在熒光顯微鏡下觀察。400倍熒光顯微鏡下隨機選擇10個視野，以視野中陽性神經(jīng)元數(shù)目占觀察細胞總數(shù)的百分率為神經(jīng)元純度。

1．2．3 造模分組：海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d，隨機分為對照組、無鎂誘導組、無鎂誘導+rAdv轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組,對照組用正常細胞外液培養(yǎng)3 h后，更換為正常維持液繼續(xù)培養(yǎng), 無鎂誘導組以無鎂細胞外液作用3 h后，更換為正常維持液，其中無鎂誘導+rAdv轉染組、無鎂誘導+rAd-Miro1轉染組于無鎂誘導48 h前分別轉染用維持液稀釋好后的不表達任何外源基因的對照腺病毒載體(rAdv)、表達大鼠Miro1基因的重組腺病毒真核表達質粒(rAd-Miro1)并分別于造模后24 h終止細胞培養(yǎng)，用于后續(xù)試驗。

1．2．4 western blot 法檢測：Miro1、ND6蛋白表達變化 提取各組海馬神經(jīng)元蛋白，BCA法測蛋白濃度，調整上樣量，每個泳道保證總蛋白量相等。SDS-PAGE 凝膠電泳(上層膠80V30 min；下層膠120V60 min)，電泳結束后將膠上的蛋白質條帶轉移到PVDF膜上(半干轉)，5% 脫脂奶粉封閉3 h。一抗孵育，兔抗大鼠Miro1(1∶1 000)，兔抗大鼠ND6 (1∶200)，4 ℃ 冰箱過夜。TBST洗膜每次10 min，共3次，洗膜后加入辣根過氧化物酶標記山羊抗兔 IgG(1∶5 000)，室溫搖床緩慢孵育1 h，ECL顯影成像重復3次。采用ImageJ測定條帶光密度，以目的蛋白與相應內參條帶光密度比值作為目的蛋白的相對表達量。

1．2．5 免疫熒光法檢測ND6蛋白表達變化：海馬神經(jīng)元在放置有爬片的24孔板中生長至14 d后，吸棄培養(yǎng)基，PBS漂洗3遍，然后用4%多聚甲醛固定15 min，PBS 漂洗 3 遍，每次3 min；0.5%Triton X-100(PBS配制 )室溫通透20 min，吸棄Triton，PBS浸洗玻片3次，每次3 min，吸水紙吸干PBS，在玻片上滴加正常胎牛血清，室溫封閉30 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的Anti-ND6抗體，并放入濕盒，4 ℃孵育過夜。PBST 浸洗爬片3次，每次3 min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的Dylight594標記山羊抗兔熒光二抗，濕盒中20～37 ℃孵育1 h，PBST浸洗爬片3次，每次3 min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進行)。滴加DAPI避光孵育5 min，對標本進行染核，PBST 5 min×4次洗去多余的DAPI，用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。運用ImageProPlus(IPP)圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD(integrated optical density)作為目的蛋白的相對表達量。

1．2．6 比色法測：MDA、GSH蛋白濃度 提取各組海馬神經(jīng)元蛋白，離心取上清液，分別于532 nm、420 nm處，1 cm光徑，蒸餾水調零比色測各管OD值，計算MDA、GSH蛋白濃度。

2 結果

2．1 原代大鼠海馬神經(jīng)元形態(tài)學特征 倒置差相顯微鏡下觀察到海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d時海馬神經(jīng)元體積變大，樹突及軸突清晰可見，細胞之間聯(lián)系緊密(見圖1)。

2．2 海馬神經(jīng)元純度測定 海馬神經(jīng)元培養(yǎng)至14 d，經(jīng)神經(jīng)元特異性烯醇化酶 NSE 染色鑒定，純度為90%以上(見圖2)。

圖1 倒置相差顯微鏡下觀察到體外培養(yǎng)7 d的海馬神經(jīng)元形態(tài) 圖2 培養(yǎng)至7 d的海馬神經(jīng)元NSE免疫熒光染色

2．3 WesternBlot檢測各組海馬神經(jīng)元中Miro1及ND6蛋白表達的變化

2．3．1 Western Blot檢測至癇后24 h細胞內Miro1蛋白表達情況：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內Miro1表達升高，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內Miro1表達升高，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在致癇后24 h細胞內Miro1表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

2．3．2 Western Blot檢測至癇后24 h細胞內ND6蛋白表達情況：與CON組比較，AE組、AE+rAdv組、AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元細胞內ND6表達降低，差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；與AE組比較，AE+rAdv組大鼠海馬神經(jīng)元在至癇后24 h細胞內ND6表達降低，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，AE+rAd-Miro1組大鼠海馬神經(jīng)元在至癇后24 h細胞內ND6表達升高，差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見圖3。

圖3 4組大鼠海馬神經(jīng)元中Miro1及ND6的表達情況

2．3．3 免疫熒光法檢測ND6蛋白表達變化：培養(yǎng)至14 d海馬神經(jīng)元進行免疫熒光染色，胞質及樹突軸突呈紅色熒光，細胞核呈藍色熒光(見圖4)。運用ImageProPlus(IPP) 圖像處理分析軟件分析，以累積光密度IOD(integrated optical density)作為ND6蛋白的相對表達量，其結果與Western Blot檢測至癇后24 h細胞內ND6蛋白表達情況一致。見表1。

圖4 培養(yǎng)至14 d各組海馬神經(jīng)元免疫熒光染色。A：CON組；B：AE組；C：AE+rAdv組；D：AE+ rAd-Miro1組

組別nND6相對表達量CON組51646976.38±142960.39AE組5364597.40±31805.07AE+rAdv組5286507.90±33900.71AE+rAdMiroshRNA組51065793.88±123058.66F值218.07P值<0.001

注：與CON組比較，*P<0.05；與AE組比較，#P>0.05，##P<0.05

2．3．4 比色法檢測各組海馬神經(jīng)元中MDA及GSH蛋白表達的變化：見表2。

表2 各組海馬神經(jīng)元中MDA及GSH蛋白表達的變化 (±s)

注：與CON組比較，*P<0.05；與AE組比較，#P>0.05，##P<0.05

3 討論

癲癇發(fā)作中腦部神經(jīng)元的高度同步化異常放電，引起呼吸鏈電子漏出活性氧(reactive oxygen species，ROS)產(chǎn)生增加，造成線粒體氧化應激損傷，大量受損線粒體堆積，導致神經(jīng)元對癇性損傷更敏感，形成惡性循環(huán)[11]。Miro1突變會抑制線粒體運輸，導致線粒體聚集成簇，并形成絲狀線粒體[12]。線粒體移動、分布的改變會影響線粒體呼吸功能，且與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病密切相關，因此，及時清除受損線粒體和維持線粒體正常功能至關重要。

前多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的發(fā)病機制都涉及線粒體移動，如帕金森病(Parkinson's disease, PD)相關蛋白PINK1/Parkin通路可以作用于線粒體移動蛋白Miro，受損線粒體的不正常運輸是PD致病原因的可能性之一[13]。結合本實驗結果，無鎂致癇后海馬神經(jīng)元Miro1反應性增高，表明Miro1蛋白介導的線粒體運輸參與海馬神經(jīng)元致癇過程。致癇過程氧化應激產(chǎn)物增加，Miro1介導的線粒體運動在一定程度上保護了神經(jīng)元正常功能，但增加的ROS可導致mtDNA損傷和mtDNA缺失，引起局部線粒體功能受損，最終導致氧化反應與抗氧化反應失衡，神經(jīng)元氧化應激損傷加重。轉染 rAd-Miro1病毒后海馬神經(jīng)元 Miro1蛋白表達顯著增加，致癇海馬神經(jīng)元氧化應激損傷降低，進而說明Miro1對致癇海馬神經(jīng)元發(fā)揮保護作用。

ND6蛋白為線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ亞基， ND6蛋白的損傷破壞NADH氧化，進一步增加自由基產(chǎn)生[14-15]。線粒體呼吸鏈酶復合體Ⅰ活性下降,導致呼吸耗氧量下降,從而引起線粒體呼吸功能的障礙。本研究表明，無鎂致癇后海馬神經(jīng)元ND6蛋白表達降低，其可能的原因是致癇過程產(chǎn)生的ROS損傷線粒體DNA，導致其編碼的ND6蛋白產(chǎn)生減少，ROS也可對線粒體復合體亞基造成直接損傷，導致ND6蛋白表達減少。提高miro1表達后，致癇海馬神經(jīng)元中ND6表達升高，表明Miro1介導的線粒體移動對維持線粒體正常功能，發(fā)揮致癇神經(jīng)元的保護作用至關重要。

線粒體是活性氧ROS產(chǎn)生的主要場所，又是 ROS 作用最敏感的部位。ROS 通過氧化線粒體心磷脂、線粒體DNA 和線粒體重要的蛋白質對線粒體造成氧化損傷[16]。MDA 是脂質過氧化反應的產(chǎn)物，其含量可反映脂質過氧化反應的程度，并間接反映引起脂質過氧化反應的自由基水平。GSH是一種抗氧化劑，清除細胞內氧自由基，抗脂質氧化，保護細胞膜的完整性。結合本實驗，無鎂致癇后海馬神元中MDA表達升高，GSH表達降低，線粒體產(chǎn)生氧化應激損傷。轉染 rAd-Miro1病毒后，MDA蛋白表達降低，GSH蛋白表達升高。表明提高Miro1表達后，致癇海馬神經(jīng)元脂質過氧化物減少，抗氧化物水平增高，氧化應激損傷減輕。線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ和Ⅲ負責產(chǎn)生O2-，本實驗中致癇海馬神經(jīng)元線粒體復合體Ⅰ亞基ND6蛋白受損，產(chǎn)生氧自由基增多可能是加重氧化應激損傷的原因。提高Miro1表達后線粒體功能障礙減輕，表明Miro1介導的線粒體移動可能通過保護線粒體呼吸鏈復合體功能，減少脂質過氧化物生成，增加抗氧化物酶類水平發(fā)揮神經(jīng)保護作用。但此研究僅通過測定神經(jīng)元細胞中Miro1的表達變化來推測其保

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(收稿2017-03-11)

國家自然科學基金(52110754)

R-332

A

1673-5110(2017)09-0039-05

△通訊作者：連亞軍，E-mail:lianyajun369@sina.com