注射用丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注線粒體ATP酶活性的影響

李富強 王 偉 馮 濤 尹曉剛 鄧 倩 劉榮志

1)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473000 2)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室 南陽 473000

注射用丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注線粒體ATP酶活性的影響

李富強1)王 偉2)馮 濤1)尹曉剛1)鄧 倩1)劉榮志2)

1)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 南陽 473000 2)南陽醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校人體解剖學(xué)教研室 南陽 473000

目的 探討注射用丹參多酚酸對大鼠腦缺血再灌注線粒體ATP酶活性的影響。方法 將54只雄性SD大鼠隨機分成3組(n=18)：假手術(shù)組(Sham組)、缺血再灌注組(IR組)、丹參多酚酸組(Salvianolate 組)。HE染色法觀察大腦神經(jīng)元的組織病理學(xué)變化；TTC染色檢測腦梗死體積；分光光度計發(fā)法線粒體丙二醛含量和線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性。結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織紅染，未見梗死灶；丹參多酚酸組神經(jīng)細(xì)胞變性壞死程度、腦梗死面積較缺血再灌注組明顯減輕；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組線粒體丙二醛含量下降(P<0.05)和線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高(P<0.05)。結(jié)論 注射用丹參多酚酸對缺血再灌注損傷有保護(hù)作用，其機制與提高線粒體ATP酶活性有關(guān)。

缺血再灌注；丹參多酚酸；線粒體；ATP酶

能量衰竭在缺血性腦血管病發(fā)病機制中起著關(guān)鍵作用。線粒體是細(xì)胞能量合成中心，線粒體ATP酶調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)Na+、Ca2+、Mg2+離子濃度，維持線粒體功能[1]。線粒體損傷導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙，引起細(xì)胞凋亡或壞死，因此保護(hù)線粒體功能是缺血性腦血管病治療的關(guān)鍵靶點。注射用丹參多酚酸(salvianolate)是從中藥丹參中提取的水溶成分，其主要成分是丹酚酸B，可以通過減少血黏度和機體炎癥反應(yīng)，提高腦梗死患者神經(jīng)功能[2]。本研究通過大鼠缺血再灌注模型探討注射用丹參多酚酸的腦保護(hù)作用是否與線粒體ATP酶相關(guān)，為明確保護(hù)機制提供參考。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 實驗動物與模型制備：健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(300±20)g，由鄭州大學(xué)動物實驗中心提供。將54只雄性SD大鼠隨機分成3組(n=18)：假手術(shù)組、注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組。模型制備：采用改良Zea Longa法制備大鼠右側(cè)中動脈缺血再灌注模型。假手術(shù)組手術(shù)過程中，分離右側(cè)頸總、頸內(nèi)、頸外動脈但不插入線栓。注射用丹參多酚酸組、缺血再灌注組線栓待缺血2 h后，緩慢抽出線栓再灌注24 h。動物蘇醒后出現(xiàn)右側(cè)Horner征、眼裂變小、瞳孔縮小和左側(cè)軀體運動障礙評定為模型成功。丹參多酚酸組于缺血2 h再灌注24 h后連續(xù)7 d給予10 mg/kg尾靜脈注射，1次/d。假手術(shù)組、缺血再灌注組給予等量生理鹽水尾靜脈注射。末次給藥6 h后功能評分后取腦。

1．1．2 主要試劑與儀器：注射用丹參多酚酸(天津天士力之驕藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字Z20110011)，顯微手術(shù)器械(上海手術(shù)器械廠)；氯化三苯基四氮唑(TTC，批號：030227，北京化學(xué)試劑公司)；低溫高速離心機(德國，Kendro Labrotary)；石蠟切片機、倒置顯微鏡(德國Leica公司)；丙二醛試劑盒及ATP酶試劑盒(南京建成科技有限公司)。

1．2 方法

1．2．1 腦梗死體積測定：大鼠腦組織應(yīng)用冰箱—20 ℃冷凍20 min后取出，沿視交叉向前冠狀位平行依次切片2 mm×5片。將切好的腦片放置在2% TTC磷酸緩沖液中，恒溫箱37 ℃避光孵育30 min后，4%多聚甲醛固定。數(shù)碼相機拍照后輸入計算機，應(yīng)用圖像分析軟件計算腦梗死體積百分比。梗死體積百分比=(左側(cè)正常腦組織體積-右側(cè)正常腦組織的體積)/左側(cè)正常腦組織體積×100%，以此作統(tǒng)計分析。

1．2．2 實驗動物取材及HE染色標(biāo)本的制備：4%多聚甲醛(4 ℃)將大鼠灌流固定斷頭取腦后，將腦組織浸入4%多聚甲醛(4 ℃預(yù)冷)中固定24 h，常規(guī)梯度乙醇脫水、石蠟包埋。將包埋好的腦組織在恒溫切片機上沿冠狀面連續(xù)切片，片厚約5 μm，展片、撈片后置于載玻片上放在4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?0 ℃烤箱中烘烤30 min常規(guī)脫蠟，二甲苯及梯度乙醇脫蠟至純水，Harris蘇木素染色15 min，自來水沖洗；1%鹽酸乙醇分化3～5 s，自來水沖洗返藍(lán)；伊紅染色1 min，自來水沖洗。脫水、透明、中性樹膠封片。

1．2．3 腦組織線粒體的提取：麻醉后迅速處死動物取腦，去除腦膜、小腦、嗅球、腦干后，留取右側(cè)大腦半球，冰鹽水沖去血液，應(yīng)用緩沖液(0.1 mol/L Tris-HCl，pH 7.4，0.25 mol/L Sucrose，0.01 mol/L EGTA)制成10%勻漿。低溫高速離心機(溫度4 ℃)以650 g離心力離心20 min后，取上清液再以 7 700 g離心力離心20 min后，取沉淀物加入線粒體保存液充分震蕩，反復(fù)吹打，得到線粒體懸浮液。上述操作均4 ℃下進(jìn)行[3]。Lowry法檢測蛋白濃度。

1．2．4 線粒體丙二醛及ATP酶測定：丙二醛監(jiān)測采用硫代巴比妥酸(TBA)方法。丙二醛(結(jié)構(gòu)OHC-CH2-CHO)與硫代巴比妥酸反應(yīng)后產(chǎn)物，在532 nm處有最大吸收峰。ATP酶即三磷酸腺苷酶，ATP酶分解ATP為ADP和無機磷，無機磷在660 nm處有最大吸收峰。具體檢測步驟按照試劑盒說明書操作。

2 結(jié)果

2．1 腦梗死體積 假手術(shù)組雙側(cè)腦組織均勻紅染，未發(fā)現(xiàn)梗死灶；IR組和丹參多酚酸組可見右側(cè)大腦半球不同范圍的蒼白色梗死灶。丹參多酚酸組腦梗死體積顯著小于IR組(P<0.05)。見表1。

表1 3組腦梗死體積測定、丙二醛及Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶比較 (±s)

注：與假手術(shù)組比較，*P<0.05；與缺血再灌注組比較，*P<0.05

2．2 光鏡下觀察大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化 假手術(shù)組神經(jīng)元胞質(zhì)呈深紅色，胞核呈藍(lán)色。細(xì)胞形態(tài)正常，邊界清楚，核大而圓，核膜、核仁清晰可見。缺血再灌注組神經(jīng)細(xì)胞排列紊亂，呈缺血性改變的錐體細(xì)胞，胞體腫脹變形成多角形、核固縮；丹參多酚酸組干預(yù)后神經(jīng)細(xì)胞缺血性改變程度均較缺血再灌注組輕，間質(zhì)水腫明顯減輕，神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰，可見少量神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)異常、核固縮或消失(見圖1)。

圖1 各組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)學(xué)變化(HE染色 ×200)A：假手術(shù)組；B：缺血再灌注組；C：丹參多酚酸處理組

2．3 丙二醛測定 丹參多酚酸治療組顯著抑制缺血再灌注后線粒體膜損傷。與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸治療組丙二醛含量(0.901±0.472)顯著減少(P<0.05)；與假手術(shù)組相比，缺血再灌注組丙二醛含量(1.501±0.149)顯著增多(P<0.05)。

2．4 線粒體ATP酶的影響 缺血再灌注組Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶與假手術(shù)組相比明顯下降(P<0.05)；與缺血再灌注組相比，丹參多酚酸組能提高線粒體ATP酶活性(P<0.05)。見表1。

3 討論

大腦是高耗能器官，線粒體通過三羧酸循環(huán)，為細(xì)胞合成能量——ATP。能量衰竭是腦缺血神經(jīng)損傷的關(guān)鍵因素，若線粒體損傷持續(xù)不能緩解，能量合成障礙導(dǎo)致線粒體穩(wěn)態(tài)改變，引起細(xì)胞死亡。缺血缺氧發(fā)生時，細(xì)胞內(nèi)ATP合成減少，尤其是再灌注時大量活性氧產(chǎn)生，損害線粒體細(xì)胞膜，線粒體結(jié)構(gòu)性破壞加重線粒體損傷，導(dǎo)致ATP合成減少、ATP降解增加[4]。線粒體能量障礙引起存在于線粒體膜上依靠ATP能量的Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低；Na+/K+ATP酶不能維持線粒體內(nèi)K+梯度優(yōu)勢，引起Na+內(nèi)流，Na+過度引起Na+/Ca2+交換，Ca2+進(jìn)入線粒體，引起鈣超載；Ca2+ATP酶和Mg2+ATP酶依靠ATP能量將Ca2+泵出維持線粒體鈣平衡；線粒體損傷時線粒體膜破壞，ATP衰竭，Ca2+不能泵出，引起線粒體鈣超載[4]。線粒體鈣超載影響三羧酸循環(huán)中依賴Ca2+調(diào)節(jié)的蛋白酶導(dǎo)致ATP合成受阻，而且激活依賴鈣離子降解酶，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，細(xì)胞災(zāi)難性損傷[5]。本研究表明，缺血再灌注后線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低、丙二醛含量升高，受損神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，核固縮，神經(jīng)元細(xì)胞減少。

注射用丹參多酚酸是采用柱層析技術(shù)提取的丹參水溶成分，其主要有效成分是丹酚酸B。實驗研究表明，丹參多酚酸通過上調(diào)高爾基磷酸化蛋白-3表達(dá)，激活A(yù)kt和mTOR磷酸化途徑減少TUNEL細(xì)胞起到腦保護(hù)作用[6]。臨床研究發(fā)現(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)丹參多酚酸治療改善進(jìn)展性能改善神經(jīng)功能評分，提高肢體功能恢復(fù)[7]。本實驗發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注組線粒體丙二醛含量升高，線粒體Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性降低，提示線粒體功能障礙；HE切片上可以看到神經(jīng)細(xì)胞胞體腫脹變形，核固縮，神經(jīng)元細(xì)胞減少，TTC染色可見腦梗死體積明顯增加。丹參多酚酸組丙二醛含量減少，Na+/K+ATP酶、Ca2+ATP酶、Mg2+ATP酶活性升高，與缺血再灌組相比，腦梗死體積明顯較少，HE接片神經(jīng)細(xì)胞及細(xì)胞間質(zhì)水腫明顯減輕，細(xì)胞核基本正常，核仁較清晰。

綜上所述，注射用丹參多酚酸可能通過提高線粒體ATP酶活性，保護(hù)線粒體而發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

[1] Sims NR，Muyderman H．Mitochondria，oxidative metabolism and cell death in stroke[J]．BBA-MOL Basis Dis，2010，1 802(1)：80-91．

[2] 郝彥超，蘇建．丹參多酚酸對腦梗死患者血液流變學(xué)和神經(jīng)功能的影響[J]．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2014， 17(16)：67-68．

[3] 李富強，白宏英，婁季宇，等．腦缺血后處理對缺血再灌注腦組織線粒體通透性轉(zhuǎn)換的影響[J]．中風(fēng)與神經(jīng)疾病雜志，2011，28(9)：796-799．

[4] Walters AM，Porter GA，Brookes PS．Mitochondria as a drug target in ischemic heart disease and cardiomyopa-thy[J]．Circ Res，2012，111(9)：1 222-1 236．

[5] Suvanish Kumar VS，Gopalakrishnan A，Naziroglu M，et al．Calcium Ion-The Key Player in Cerebral Ischemia[J]．Curr Med Chem，2014，21(18)：2 065-2 075．

[6] You H，Li T，Zhang J，et al．Reduction in ischemic cerebral infarction is mediated through golgi phosphoprotein 3 and Akt/mTOR signaling following salvianolate administration[J]．Curr Neurovasc Res，2014，11(2)：107-113．

[7] 王偉芳．注射用丹參多酚酸治療進(jìn)展性腦梗死的療效觀察[J]．中國實用神經(jīng)疾病雜志，2016，19(7)：107-108．

(收稿2017-01-12)

Effect of salvianolate injection on ATPase activity of mitochondria in rats with cerebral ischemia reperfusion

LiFuqiang*，WangWei，F(xiàn)engTao，YinXiaogang，DengQian，LiuRongzhi

*DepartmentofNeurology，theFirstAffiliatedHospitalofNanyangMedicalCollege，Nanyang473000，China

Objective To explore the effect of salvianolate injection on ATPase activity of mitochondria in rats with cerebral ischemia reperfusion．Methods Totally 54 male Sprague Dawley(SD)rats were randomly divided into three groups：sham-operation group，ischemia-reperfusion(I/R)group and salvianolate group，eighteen rats in each group．Histopathological changes of cerebral neurons were observed by HE staining，volume of cerebral infarction were measured by staining with triphenyltetrazolium chloride(TTC)and activities of Na+/K+ATPase，Ca2+ATPase and Mg2+ATPase of mitochondria were measured by spectrophotometer．Results The sham group showed red cerebral tissues，which indicated no infarction．Compared with those in ischemia-reperfusion group，degeneration degree of neurons and volume of cerebral infarction were significantly reduced，malondialdehyde(MDA)content was decreased and the activities of Na+/K+ATPase，Ca2+ATPase and Mg2+ATPase of mitochondria in salvianolate group were increased(allP<0.05)．Conclusion Salvianolate has a neuroprotective effect on focal cerebral ischemia reperfusion in rats，whose mechanism may be associated with increased ATPase activity of mitochondria．

Ischemia reperfusion；Salvianolate；Mitochondria；ATPase

R-332

A

1673-5110(2017)09-0023-04