吡格列酮、高糖對3T3—L1細胞中p—Perilipin 1A蛋白表達的影響

夏文燕++許榮++方向南++秦永章++歐陽龍強

[摘要]目的 探討吡格列酮和高糖對3T3-L1細胞中p-Perilipin 1A蛋白表達的影響。方法 將以3T3-L1前脂肪細胞誘導分化成3T3-L1脂肪細胞，進行分組，設對照組（5 mmol/L葡萄糖）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖）、高糖加吡格列酮組（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮），通過測定培養基中甘油含量作為評價脂肪分解的指標，同時用Western blot檢測p-Perilipin 1A蛋白表達。結果 通過甘油試劑盒監測甘油釋放量，高糖組較對照組明顯增加，差異有統計學意義（P<0.01），而高糖加吡格列酮組的甘油釋放量較高糖組明顯減少，差異有統計學意義（P<0.01）；同時Western blot檢測結果顯示，與對照組比較，高糖組p-Perilipin 1A蛋白明顯上調，差異有統計學意義（P<0.01），高糖組與高糖加吡格列酮組比較，顯著抑制了p-Perilipin 1A蛋白的上調，差異有統計學意義（P<0.01）。結論 吡格列酮可能通過阻止p-Perilipin 1A上調來抑制高糖刺激下的脂肪分解，減少游離脂肪酸，從而改善胰島素抵抗。

[關鍵詞]吡格列酮；高糖；3T3-L1細胞；p-Perilipin 1A

[中圖分類號] R589.2 [文獻標識碼] A [文章編號] 1674-4721（2017）04（c）-0009-04

[Abstract]Objective To investigate the effects of pioglitazone and high glucose on the expression of p-Perilipin 1A protein in 3T3-L1 cells.Methods 3T3-L1 preadipocytes were induced and differentiated into 3T3-L1 adipocytes and then were classified into three groups：control group （5 mmol/L glucose），high glucose group （25 mmol/L glucose）and high glucose plus Pioglitazone group （25 mmol/L glucose + 100 μmol/L Pioglitazone）.The glycerol content of culture medium was determined and taken as the evaluation index of lipolysis；at the same time，Western blot was used to detect the expression of p-Perilipin 1A protein.Results According to the release amount of glycerol monitored by using the glycerol kit，a more obvious increase was seen in high glucose group than in control group，with statistically significant difference （P<0.01）；while，a more obvious decrease of the release amount of glycerol occurred in high glucose plus Pioglitazone group than that in high glucose group，with statistically significant difference （P<0.01）；at the same time，the p-Perilipin 1A proteinof high glucose group detected by Western blot was significantly increased in comparison with control group，with statistically significant difference（P<0.01）；and the expression of p-Perilipin 1A protein was significantly inhibited in high glucose group in contrast with high glucose plus pioglitazone group，with statistically significant difference （P<0.01）.Conclusion Pioglitazone may prevent the up-regulation of p-Perilipin 1A to inhibit glucose-stimulated lipolysis and decrease free fatty acids，thereby improving the insulin resistance.

[Key words]Pioglitazone；High glucose；3T3-L1 cells；p-Perilipin 1A

目前代謝綜合征的發病率正以驚人的速度上升[1]，脂代謝紊亂是代謝綜合征的病理特點，因為在血循環中增加了源自脂肪組織的非酯化游離脂肪酸（free fatty acid，FFA）[2]。這些FFA可以引發肌肉、肝臟處胰島素抵抗[3]。FFA的濃度主要由脂肪細胞的脂肪分解控制。周脂素（PLIN1，Perilipin 1A）能雙重調控脂類代謝[4]，Perilipin 1A表達下降和磷酸化上調都能促進脂解，誘發胰島素抵抗[5]。目前，研究已明確噻唑烷二酮類誘導調節糖、脂代謝的相關蛋白表達而減輕胰島素抵抗[6]，但是如何調節脂代謝的相關蛋白表達以改善胰島素抵抗作用的研究尚不多。而本文旨在研究吡格列酮在3T3-L1細胞是否可通過抑制高糖刺激下的脂滴包被蛋白p-Perilipin1A蛋白的表達上調來減少脂肪分解進一步減少FFA，以助于減輕胰島素抵抗。

1材料與方法

1.1主要試劑

3T3-L1前脂肪細胞株（美國模式培養物集存庫提供）、葡萄糖（北京益利精細化學品有限公司）、地塞米松（D4902）、1-甲基-3-異丁基-黃嘌（I5879）、無酚紅DMEM培養基（美國Sigmag公司）、胰蛋白酶、5 mmol/L無酚紅葡萄糖（DMEM）培養基（美國Gibco公司）、兔抗牛p-Perilipin 1A抗體（北京博奧森生物技術公司）、胰島素（諾和諾德公司）、吡格列酮（原料，純度99.3%，江蘇漣水制藥有限公司）、胎牛血清（美國PAA公司）、甘油檢測試劑盒（上海超研生物科技有限公司）、Western blot試劑盒（上海經科化學科技有限公司）。

1.2實驗方法

1.2.1 3T3-L1前脂肪細胞的培養和誘導分化 3T3-L1前脂肪細胞以含10%胎牛血清（DMEM）培養基，在室溫、體積分數為0.07的CO2的條件下培養。細胞融合率為80%～90%時，行傳代接種。細胞融合后，加含誘導液（地塞米松、胰島素、1-甲基-3-異丁基-黃嘌呤）的DMEM培養液再孵育2 d；然后以含10 μg/ml胰島素的DMEM培養液孵育2 d，隨后以DMEM培養液繼續孵育6 d，3T3-L1細胞在誘導分化約10 d 90%呈脂肪細胞表型[7]。

1.2.2 3T3-L1脂肪細胞分組 將3T3-L1脂肪細胞分為三組：對照組（5 mmol/L葡萄糖）（第1組）、高糖組（25 mmol/L葡萄糖）（第2組）、高糖+吡格列酮組（25 mmol/L葡萄糖+100 μmol/L吡格列酮）（第3組）。每組細胞以5 mmol/L葡萄糖培養基培養同步化12 h后，第3組無血清培液中加入吡格列酮，摸索濃度（0、20、40、60、80、100 μmol/L）達終濃度100 μmol/L，預處理3 h后，第2組和第3組中加入葡萄糖，終濃度25 mmol/L，溫育24 h。

1.2.3 3T3-L1脂肪細胞脂肪分解的測定 將脂肪細胞進行分組，衡量脂肪細胞分解的指標是以孵育后測定培養基中甘油累積量。將細胞孵育一定時間后用GPO-POD酶法直接測定培養基中甘油含量作為累積值。具體在酶標板中每組各設置5個孔，將50 μl無酚紅DMEM培養液中加入150 μl工作液中，室溫靜置15 min，于光密度550波長處比色[8]。繪制曲線計算甘油濃度。

1.2.4 Western blot檢測p-Perilipin 1A蛋白的表達 將總蛋白樣品用SDS-PAGE電泳進行分離，并轉移至PVDF膜，常溫下以5%脫脂奶粉封閉，加入p-Perilipin 1A多克隆抗體孵育12 h以上，洗滌后，加入辣根過氧化酶（HRP）標記的Ⅱ抗室溫孵育1 h，再洗滌，ECL顯影劑顯影，以激光掃描儀進行定量掃描。

1.3統計學方法

采用SPSS 17.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1吡格列酮對高糖誘發的3T3-L1脂肪細胞脂肪分解的影響

第2組的甘油量比第1組高，差異有統計學意義（P<0.01），第3組較第2組甘油釋放量顯著降低，差異有統計學意義（P<0.01），而第1組和第3組比較，差異無統計學意義（P>0.05）（圖1）。

2.2吡格列酮對p-Perilipin 1A蛋白表達的影響

結果顯示，第2組中p-Perilipin 1A蛋白的表達明顯增加，與第1組比較，差異有統計學意義（P<0.01）；第3組與第2組比較，差異有統計學意義（P<0.01），而與第1組比較，差異無統計學意義（P>0.05），光密度掃描圖和分析見圖2。

3討論

代謝綜合征是一組復雜的代謝紊亂群，包括脂代謝紊亂，與心血管疾病的發生發展密切相關[9]，還與其他一系列疾病的發生率和死亡率密切相關。有效地封存脂肪可以防止肌肉和肝臟中脂肪酸過度，而破壞代謝綜合征發生的信號途徑[10]。Perilipin 1A是屬于最早發現的脂滴相關蛋白PAT家族，參與脂肪細胞內三酰甘油的合成與分解，對糖脂代謝平衡起著關鍵作用[11]。在正常生理條件下，由兒茶酚胺通過提高細胞內的cAMP濃度并激活cAMP依賴的蛋白激酶PKA，磷酸化p-Perilipin 1A，引發脂解[12]，且Perilipin的磷酸化是脂解的關鍵[13]，由此產生適量FFA為機體供能，保持脂代謝平衡。代謝綜合征患者的FFA升高，原因之一，Perilipin 1A的表達減少和磷酸化的Perilipin 1A增加，低水平的Perilipin 1A和高水平的p-Perilipin 1A與高脂解率相關[14]。代謝綜合征患者內源性刺激脂解因子的分泌水平增加，如炎癥因子TNF-a、IL-6的分泌等。而最近幾年人們已發現存在多種抑制劑可以對這些內源性刺激脂解的因子及其信號通路進行抑制，逆轉Perilipin 1A的改變，減少脂解。如羅格列酮和橘皮素可以抑制NF-kB的信號通路，柚皮素可以抑制IL-6的轉錄，并能抑制TNF-a和IL-6介導Perilipin 1A的下調[15]。目前高血糖對Perilipin 1A磷酸化的影響研究非常少，而高血糖是代謝綜合征的組成部分，因此本研究選擇了以高糖作為刺激脂肪分解的因子，研究發現，3T3-L1脂肪細胞在高糖刺激下，高糖組的甘油釋放量明顯較對照組升高，根據Western blot法檢測p-Perilipin 1A蛋白表達的數據顯示，同時高糖組的p-Perilipin1A蛋白較對照組增加，并有統計學意義，因此本研究顯示高濃度葡萄糖（25 mmol/L）可以提高Perilipin 1A的磷酸化水平，與Zhang等[16]的研究結果一致，其研究結果顯示，主要信號通路可能包括持續激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）和磷脂酶C（PLC），隨之下游信號蛋白激酶C（PKC）、絲蘇氨酸蛋白激酶（AKT）、絲裂原活化蛋白激酶/胞外調節號1/2（MAPK/ERK1/2）和胞漿型磷脂酶A2（cPLA2）激活而調節。

在降血糖的藥物中，噻唑烷二酮類藥物吡格列酮，對改善胰島素抵抗有著顯著的效能[17]。吡格列酮是PPARγ激動劑。已有研究表明PPARγ這個轉錄因子與代謝紊亂的調節密切相關，吡格列酮可通過PPARγ通路調節多種信號因子，影響3T3-L1細胞脂肪形成[18]，故推測吡格列酮是否可以逆轉Perilipin 1A磷酸化的改變，減少脂解。本研究通過測定甘油釋放量，吡格列酮預處理后，可以抑制高糖引發的脂肪分解，脂肪分解率明顯降低，與高糖組比較，差異有統計學意義。同時根據Western blot法檢測p-Perilipin 1A蛋白表達的數據顯示，發現p-Perilipin1A蛋白表達下調，說明吡格列酮可以抑制高糖刺激的p-Perilipin1A蛋白的上調，進一步闡述了高糖刺激下，吡格列酮仍可以通過減少Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，則最終可以改善胰島素抵抗。

綜上所述，在代謝綜合征患病率急速上升的趨勢下，需要尋找有效的藥物來控制各項代謝危險因素，本研究發現p-Perilipin 1A蛋白可作為一治療靶點，調控細胞的脂肪分解，改善胰島素抵抗，同時發現吡格列酮藥物可以有效抑制Perilipin1A的磷酸化，減少脂肪分解，但具體調控機制還有待進一步研究。

[參考文獻]

[1]Kriksciuniene R，Zilaitiene B，Verkauskiene R.The current management of turner syndrome[J].Minerva Endocrinol，2016， 41（1）：105-121.

[2]Boden G.Does inhibition of β-cell proliferation by free fatty acid in mice explain the progressive failure of insulin secretion in type 2 diabetes？[J].Diabetes，2012，61（3）：560-561.

[3]V■elák J，Vejra■ková D，Vaňková M，et al.T2D risk haplotypes of the TCF7L2 gene in the Czech population sample：the association with free fatty acids composition[J].Physiol Res，2012，61（3）：229.

[4]Kimmel AR，Sztalryd C.The perilipins：major cytosolic lipid droplet-associated proteins and their roles in cellular lipid storage，mobilization，and systemic homeostasis[J].Annual Review of Nutrition，2016，36（1）：471.

[5]Miyoshi H，Souza SC，Zhang HH，et al.Perilipin promotes hormone-sensitive lipase-mediated adipocyte lipolysis via phosphorylation-dependent and-independent mechanisms[J].J Biol Chem，2006，281（23）：15 837.

[6]Chen HH，Horng MH，Yeh SY，et al.Glycemic control with Thiazolidinedione is associated with fracture of T2DM Patients[J].Plos One，2015，10（8）：e0135530.

[7]王麗靜，張尉，劉小鶯，等.地塞米松誘導3T3-L1脂肪細胞胰島素抵抗模型的建立[J].福建醫科大學學報，2007， 41（3）：282-284.

[8]夏文燕，王麗靜，劉小鶯，等.牛黃熊脫氧膽酸抑制TNF-α刺激3T3-L1細胞脂肪分解[J].第三軍醫大學學報，2012， 34（12）：1206-1209.

[9]Bibra HV，Str■hle A，Sutton MSJ，et al.Dietary therapy in heart failure with preserved ejection fraction and/or left ventricular diastolic dysfunction in patients with metabolic syndrome[J].Int J Cardiol，2017，234：7-15.

[10]Adams-Huet B，Devaraj S，Siegel D，et al.Increased adipose tissue insulin resistance in metabolic syndrome：relationship to circulating adipokines[J].Metab Syndr Relat Disord，2014，12（10）：503-507.

[11]Westhoff CC，Mrozinski J，Riedel I，et al.Perilipin 1 is a highly specific marker for adipocytic differentiation in sarcomas with intermediate sensitivity[J].J Cancer Res Clin Oncol，2017，143（2）：225-232.

[12]Mcdonough PM，Maciejewski-Lenoir D，Hartig SM，et al.Differential phosphorylation of perilipin 1A at the initiation of lipolysis revealed by novel monoclonal antibodies and high content analysis[J].PloS One，2013，8（2）：e55511.

[13]Elkins DA，Spurlock DM.Phosphorylation of perilipin is associated with indicators of lipolysis in Holstein cows[J].Horm Metab Res，2009，41（10）：736-740.

[14]Mulumba M，Granata R，Marleau S，et al.QRFP-43 inhibits lipolysis by preventing ligand-induced complex formation between perilipin A，caveolin-1，the catalytic subunit of protein kinase and hormone-sensitive lipase in 3T3-L1 adipocytes[J].Biochim Biophys Acta，2015，1851（5）：657-666.

[15]Yoshida H，Takamura N，Shuto T，et al.The citrus flavonoids hesperetin and naringenin block the lipolytic actions of TNF-α in mouse adipocytes[J].Biochem Biophys Res Commun，2010，394（3）：728-732.

[16]Zhang TT，Xu C，Zu LX，et al.The mechanisms of stimulated lipolysis by high concentration of glucose in primary rat adipocytes][J].Beijing Da Xue Xue Bao，2008，40（3）：273-279.

[17]Gillies PS，Dunn CJ.Pioglitazone[J].Drugs，2000，60（2）：333-343.

[18]Rosen ED，Walkey CJ，Puigserver P，et al.Transcriptional regulation of adipogenesis[J].Genes & Development，2000， 14（11）：1293-307.

（收稿日期：2017-02-16 本文編輯：任 念）