生防枯草芽孢桿菌210發酵工藝優化

鄒高溪，趙春田，裘娟萍

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

生防枯草芽孢桿菌210發酵工藝優化

鄒高溪，趙春田，裘娟萍*

(浙江工業大學 生物工程學院，浙江 杭州 310014)

采用響應面法，優化抗真菌的枯草芽孢桿菌210的發酵工藝，提高芽孢產量。結果顯示，影響芽孢產量最主要的3個因素為玉米粉、蛋白胨和KH2PO4用量，最佳發酵培養基配方為：玉米粉10.75 g·L-1、黃豆粉9.00 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1。基于優化配方通過單因素優化試驗，確定最佳發酵條件為：培養溫度31 ℃、裝液量30 mL·250 mL-1、接種量4%。枯草芽孢桿菌210在上述優化后的條件下培養，芽孢產量達到1.64×1010cfu·mL-1，較優化前提高6.5倍。

枯草芽孢桿菌；發酵工藝；響應面法

植物病害是造成農業損失的主要因素之一，目前生產上主要采用化學農藥防治。化學農藥的不當使用可能引發嚴重環境問題，破壞生態平衡，威脅農產品安全[1]。作為一種替代方案，利用微生物(生防菌)防治植物病害在近年來受到越來越多的關注[2-3]。

枯草芽孢桿菌是一種優良的生防菌，它能夠產生多種抗菌物質，這些抗菌物質對人畜安全，對環境無污染，且不易產生抗藥性，加之枯草芽孢桿菌本身具有生長快、營養簡單、芽孢抗逆性強的特點，十分有利于生防菌的生產、劑型加工及在環境中存活、定殖與繁殖[4]。目前，枯草芽孢桿菌作為生防菌已經在生產中得到應用：含有枯草芽孢桿菌的微生物農藥“百抗”對水稻紋枯病的防效達70%以上；武漢天惠生物工程有限公司開發的枯草芽孢桿菌Bs-208殺菌劑是多種植物病原菌的競爭性抑制劑[5]。研究發現，不同枯草芽孢桿菌菌株在營養需求方面存在顯著差異，通過對培養基和發酵條件的優化能夠快速有效地提高相應菌株的芽孢產量[6]。筆者所在實驗室團隊前期分離篩選得到1株枯草芽孢桿菌210，對常見的植物病源真菌具有良好的拮抗作用。本研究擬應用響應面分析法優化枯草芽孢桿菌210產芽孢發酵培養基，采用單因素試驗法優化發酵條件，旨在提高芽孢產量，為生防菌210的開發應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌種及培養基

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)210，浙江工業大學微生物研究所保藏。

1.1.2 培養基

斜面及平板計數培養基(g·L-1)：葡萄糖10.00，蛋白胨10.00，牛肉膏5.00，NaCl 5.00，瓊脂15.00～20.00，pH值7.0(滅菌前)，115 ℃滅菌30 min。

種子培養基(g·L-1)：葡萄糖5.00，蛋白胨5.00，NaCl 5.00，MgSO4·7H2O 0.20，KH2PO40.20，pH值7.0(滅菌前)，115 ℃滅菌30 min。

發酵培養基(g·L-1)：玉米粉12.00，黃豆粉6.00，蛋白胨4.00，NaCl 4.00，MgSO4·7H2O 0.40，KH2PO40.40，CaCl22.00，MnSO4·H2O 0.60，pH值7.0(滅菌前)，121 ℃滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 培養條件

斜面培養條件：用接種環在甘油管中取枯草芽孢桿菌210在斜面上劃線接種進行活化，37 ℃恒溫培養24 h。

種子培養條件：將活化的枯草芽孢桿菌210接種到種子培養基中，裝液量30 mL·250 mL-1，200 r·min-1，37 ℃培養12 h。

發酵培養條件：按4%接種量將種子液接種到裝液量50 mL·250 mL-1發酵培養基中，200 r·min-1，37 ℃培養72 h。

1.2.2 細胞數及芽孢數測定

發酵液于80 ℃水浴加熱30 min后，采用稀釋平板菌落計數法[7]測定芽孢數，每個稀釋度平行重復3次。

1.3 培養基優化

1.3.1 Plackett-Burman(PB)設計

取玉米粉(A)、黃豆粉(B)、蛋白胨(C)、NaCl(E)、MgSO4·7H2O(F)、KH2PO4(G)、CaCl2(I)、MnSO4·H2O(J)作為PB試驗設計的8個因素，每個因素取高低2個水平，低水平(-1)為初始發酵培養基中的濃度，高水平(+1)取低水平的1.5倍(表1)。選用n=12的Plackett-Burman設計表，以單位體積發酵液芽孢數為響應值。

1.3.2 最陡爬坡試驗設計

取PB設計試驗結果確定的3個因素進行最陡爬坡試驗，以各顯著因素的正負效應確定最陡爬坡試驗的方向，以適當的濃度梯度改變為變化步長，快速逼近最大響應區域。

1.3.3 Box-behnken設計

以PB試驗篩選得到的3個因素為設計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，分別取高(+1)、中(0)、低(-1)3個水平進行Box-behnken設計，以發酵液單位體積芽孢數作為響應值，利用Design Expert 8.05b軟件對試驗數據進行回歸分析。

1.3.4 驗證試驗

取最佳培養基配方進行3次平行試驗，取平均值，驗證模型是否可靠，進而得出最終優化結果。

1.4 發酵條件優化

在優化培養基配方的基礎上，分別對枯草芽孢桿菌210的培養溫度(28、31、34、37、40 ℃)、接種量(30、40、50、60 mL·250 mL-1)、裝液量(2%、3%、4%、5%、6%)等發酵條件進行單因素優化試驗。

2 結果與分析

2.1 發酵培養基主要組分篩選

采用Plackett-Burman法，研究枯草芽孢桿菌210發酵培養基8個組分對芽孢產量的影響，培養72 h后測定發酵液中芽孢產量，結果見表1。應用Minitab 17軟件對試驗結果進行數據分析，各組分所代表的高低水平及其方差分析結果見表2。

由表1和表2可知，培養基組分對芽孢產量影響顯著的3個因素為：A(玉米粉)、C(蛋白胨)和G(KH2PO4)，這3個因素對芽孢產量(Y)的影響可用回歸方程Y=3.62-0.42A+0.53C+0.37G表示，該回歸方程的決定系數R2=0.998 3，大于0.95，說明回歸方程擬合程度良好。

2.2 最陡爬坡試驗結果

依據Plackett-Burman試驗結果，選擇玉米粉、蛋白胨、KH2PO4進行爬坡試驗，以尋找最適的濃度配比。由表2可知，玉米粉對芽孢產量具有負效應，蛋白胨、KH2PO4對芽孢產量具有正效應；因此要提高芽孢產量，應適當降低玉米粉的濃度，提高蛋白胨、KH2PO4的濃度。最陡爬坡試驗的設計方案和結果見表3。可以看出，4號試驗組的芽孢產量最高，說明在玉米粉10.00 g·L-1、蛋白胨7.50 g·L-1、KH2PO40.75 g·L-1條件下，發酵液中芽孢產量最大。

2.3 響應面分析結果

利用Design-Expert 8.05b軟件中的Box-Behnken，選擇玉米粉(X1)、蛋白胨(X2)、KH2PO4(X3)進行3水平試驗設計(表4)：X1，9.00(-1水平)、10.00(0水平)、11.00(+1水平)；X2，6.50(-1水平)、7.50(0水平)、8.50(+1水平)；X3，0.65(-1水平)、0.75(0水平)、0.85(+1水平)。測定各試驗組芽孢產量。

表1 Plackett-Burman試驗設計各變量對芽孢產量的影響

Table 1 Effect of variables (in coded levels) in the Plackett-Burman design on spore yield

序號No．ABCDEFGHIJ芽孢Spores/(109cfu·mL-1)1-1-1+1+1+1-1+1+1-1+15 072+1+1-1+1+1-1+1-1-1-13 603-1+1+1-1+1-1-1-1+1+14 374-1-1-1+1+1+1-1+1+1-12 935+1-1+1+1-1+1-1-1-1+13 176+1-1+1-1-1-1+1+1+1-13 337+1-1-1-1+1+1+1-1+1+12 338-1+1-1-1-1+1+1+1-1+14 009-1-1-1-1-1-1-1-1-1-12 1810+1+1+1-1+1+1-1+1-1-13 3011-1+1+1+1-1+1+1-1+1-15 6012+1+1-1+1-1-1-1+1+1+13 50

D、H為虛擬項。

The term of D and H were virtual items.

表2 Plackett-Burman試驗設計因子、水平及效應

Table 2 Variables， levels and effects in the Plackett-Burman design

編碼Term變量因素Variable水平Level/(g·L-1)(-1)(+1)效應Effect[ (+)- (-)]/6相對置信度RelativeconfidenceT值T?valueP值P?valueA玉米粉Cornflour12 0018 00-0 8352-10 510 060?B黃豆粉Soybeanmeal6 009 000 30954 310 157C蛋白胨Peptone4 006 001 06513 400 047??ENaCl4 006 00-0 0128-0 160 898FMgSO4·7H2O0 400 60-0 1352-1 700 338GKH2PO40 400 600 73159 200 069?ICaCl22 003 000 14251 790 324JMnSO4·7H2O0 600 900 26523 340 185

*和**分別表示P<0.1和P<0.05。

*and**indicatedP<0.1 andP<0.05， respectively.

表3 最陡爬坡試驗設計方案及結果

Table 3 Design and results of steepest ascent experiment

序號No．玉米粉Cornflour/(g·L-1)蛋白胨Peptone/(g·L-1)KH2PO4/(g·L-1)芽孢Spores/(109cfu·mL-1)116 003 000 302 70214 004 500 454 37312 006 000 605 63410 007 500 756 7758 009 000 904 47

表4 Box-Behnken試驗設計及結果

Table 4 Design and results of the Box-Behnken experiment

序號No．X1X2X3芽孢Spores/(109cfu·mL-1)10007 672-1+105 703+1-106 974-1-105 5050+1+14 8060+1-15 177+10+16 4780-1-18 539-10-16 9310-10+15 0711+1-106 53120007 67130007 60140007 5315+10-17 83160-1+15 50170007 67

應用Design-Expert 8.05b軟件對試驗數據進行擬合，得到芽孢產量(Y)的多元回歸模型：

Y=7.63+0.58X1-0.54X2-0.83X3-0.16X1X2+0.12X1X3+0.67X2X3-0.44X12-1.02X22-0.62X3。

對回歸模型進行方差分析，結果見表5。可以看出，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4對芽孢產量均具有顯著(P<0.05)影響，回歸模型P值<0.01，達極顯著水平，失擬項的P值<0.000 1，亦達極顯著水平，說明所構建的回歸模型顯著。決定系數R2=0.914 8，大于0.90，說明回歸模擬程度好。

為進一步研究相關變量因素之間的交互作用以確定最優點，利用Design-Expert 8.05b軟件分析二次回歸模型，繪制3個影響因子之間的響應面分析立體圖和等高線圖(圖1)。圖中的等高線均呈橢圓形，表明各圖中交互作用顯著。將多元回歸模型中的各自變量(X1、X2、X3)分別求一階偏導數并均令其為0，得到1個三元一次線性方程組，解此方程組得到模型預測最佳點，玉米粉、蛋白胨和KH2PO4最佳添加量分別為10.75、6.97、0.66 g·L-1，該條件下，模型預測芽孢產量為8.37×109cfu·mL-1。

表5 芽孢產量回歸模型的方差分析

Table 5 Analysis of variance (ANOVA) as regression model of spore yield

方差來源Source自由度df平方和Sumofsquares均方差MeansquareF值F?valueP值P?value模式Model919 852 218 350 0053??X112 562 6510 020 0158?X212 312 318 750 0211?X315 505 5020 830 0026??X1X210 100 100 380 5568X1X310 060 060 240 6414X2X311 781 786 730 0357?X2110 820 823 110 1210X2214 354 3516 490 00481??X2311 601 606 070 0433?殘差Residual71 850 26失擬項Lackoffit31 840 61275 17<0 0001??純誤差Pureerror48 91E?0032 23E?003所有項Cortotal1621 69

*與**分別表示P<0.05與P<0.01。

*and**indicatedP<0.05 andP<0.01， respectively.

圖1 玉米粉、KH2PO4和蛋白胨對芽孢產量影響的響應面分析立體圖(左)及相應的等高線圖(右)Fig.1 Contour plot analysis (left) and response surface plot analysis (right) into the effects of corn flour， KH2PO4 and peptone on spore yield

2.4 優化結果驗證

為驗證模型預測的準確性，對響應面優化后的發酵培養基進行3個批次的搖瓶發酵試驗，以初始發酵培養基為對照，驗證搖瓶發酵結果。芽孢產量分別為7.8×109、8.2×109、8.5×109cfu·mL-1，平均為8.17×109cfu·mL-1，模型預測的最高芽孢產量為8.37×109cfu·mL-1，兩者比較接近，與優化前芽孢產量2.19×109cfu·mL-1相比提高了2.7倍。

2.5 培養條件優化

2.5.1 不同培養溫度對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響

如圖2所示，31 ℃條件下，枯草芽孢桿菌的芽孢產量最高，達到1.2×1010cfu·mL-1，為枯草芽孢桿菌210產芽孢最適溫度。高于31 ℃的溫度下，細胞數、芽孢數及芽孢形成率都隨著溫度提高而降低。

2.5.2 不同裝液量對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響

如圖3所示，隨著裝液量增加，細胞數、芽孢數及芽孢形成率均減少。30 mL·250 mL-1的裝液量為枯草芽孢桿菌210菌株產芽孢的最佳裝液量，芽孢產量達到1.67×1010cfu·mL-1。這可能是因為該菌株在生長繁殖過程中需要消耗大量的氧，裝液量增加會降低溶氧，抑制細胞的生長，從而降低芽孢的形成。但裝液量太少則會降低發酵規模增加能耗。

2.5.3 不同接種量對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響

菌種生長繁殖的速度取決于接種量大小，接種量過大增加生產成本，過小則會延長培養時間，降低發酵生產率。如圖4所示，接種量為4%時，枯草芽孢村桿菌210菌株在發酵液中芽孢產量達到1.64×1010cfu·mL-1，過高或過低的接種量下芽孢產量都會降低，因此4%的接種量為枯草芽孢桿菌210產芽孢的最佳接種量。

圖2 不同培養溫度對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響Fig.2 Effect of culture temperature on spore yield of Bacillus subtillis 210

圖3 不同裝液量對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響Fig.3 Effect of fluid volume on spore yield of Bacillus subtilis 210

圖4 不同接種量對枯草芽孢桿菌210芽孢產量的影響Fig.4 Effect of inoculum size on spore yield of Bacillus subtilis 210

3 結論

為提高生防枯草芽孢桿菌210的芽孢產量，降低生產成本，本研究通過Plackett-Burman試驗、響應面法對發酵工藝進行優化，優化后的發酵培養基配方為玉米粉10.75 g·L-1、蛋白胨6.97 g·L-1、黃豆粉9.00 g·L-1、KH2PO40.66 g·L-1、NaCl 4.00 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1、CaCl23.00 g·L-1、MnSO4·H2O 0.60 g·L-1。對比優化前培養基配方，該優化配方降低了玉米粉含量，增加了蛋白胨和KH2PO4含量。驗證試驗顯示，芽孢產量較優化前提高了2.7倍，平均達到8.17×109cfu·mL-1。基于優化后的培養基，通過單因素試驗優化發酵條件：培養溫度31 ℃、搖瓶裝液量30 mL·250 mL-1，接種量4%。應用優化配方及工藝，枯草芽孢桿菌210的芽孢產量達到1.64×1010cfu·mL-1，較優化前提高了6.5倍。試驗結果為后續的發酵罐擴大培養提高芽孢產量奠定了基礎。

[1] ZHANG H， SHAN B. Historical distribution of DDT residues in pond sediments in an intensive agricultural watershed in the Yangtze-Huaihe region， China[J].JournalofSoilsandSediments， 2014， 14(5): 980-990.

[2] POSADA-URIBE L F， ROMERO-TABAREZ M， VILLEGAS-ESCOBAR V. Effect of medium components and culture conditions inBacillussubtilis， EA-CB0575 spore production[J].BioprocessandBiosystemsEngineering， 2015， 38(10):1879-1888.

[3] 何紅， 蔡學清， 陳玉森， 等. 辣椒內生枯草芽孢桿菌BS-2和BS-1防治香蕉炭疽病[J]. 福建農林大學學報(自然科學版)， 2002， 31(4): 442-444. HE H， CAI X Q， CHEN Y S， et al. Biological control of banana anthracnose with endophyticBacillussubtilisBS-2 and BS-1 isolated from capsicum[J].JournalofFujianAgricultureandForestryUniversity(NaturalScienceEdition)， 2002， 31(4): 442-444. (in Chinese with English abstract)

[4] CHO S J， LEE S K， CHA B J， et al. Detection and characterization of theGloeosporiumgloeosporioides， growth inhibitory compound iturin A fromBacillussubtilisstrain KS03[J].FEMSMicrobiologyLetters， 2003， 223(1):47-51.

[5] 杜立新， 馮書亮， 曹克強， 等. 枯草芽孢桿菌BS-208和BS-209菌株在番茄葉面及土壤中定殖能力的研究[J]. 河北農業大學學報， 2004， 27(6):78-82. DU L X， FENG S L， CAO K Q， et al. Study on colonization ofBacillussubtilisstrains BS-208 and BS-209 on phylloplane of tomato and soil[J].JournalofAgriculturalUniversityofHebei， 2004， 27(6): 78-82. (in Chinese with English abstract)

[6] PRYOR S W， GIBSON D M， HAY A G， et al. Optimization of spore and antifungal lipopeptide production during the solid-state fermentation ofBacillussubtilis[J].AppliedBiochemistryandBiotechnology， 2007， 143(1):63-79.

[7] 沈萍， 范秀榮， 李廣武. 微生物學實驗[M]. 北京：高等教育出版社， 2007.

(責任編輯 高 峻)

Optimization of fermentation technology of biocontrol bacteriumBacillussubtilis210 by response surface analysis

ZOU Gaoxi， ZHAO Chuntian， QIU Juanping*

(CollegeofBiotechnologyandBioengineering，ZhejiangUniversityofTechnology，Hangzhou310014，China)

In order to increase the spore yield， the fermentation technology ofBacillussubtilis210 with antifungal activity was optimized. It was shown that the main factors influencing spore production were doses of corn flour， peptone and KH2PO4. The optimal fermentation medium was as follows: corn flour 10.75 g·L-1， soybean meal 9.00 g·L-1， peptone 6.97 g·L-1， KH2PO40.66 g·L-1， NaCl 4.00 g·L-1， MgSO4·7H2O 0.60 g·L-1， CaCl23.00 g·L-1and MnSO4·H2O 0.60 g·L-1. Based on the single factor optimization experiment results， the optimal culture conditions were as follows∶culture temperature 31 ℃，fluid volume 30 mL·250 mL-1，inoculum size 4%. With the optimal fermentation condition， the spore yield ofBacillussubtilis210 reached 1.64×1010cfu·mL-1， and was increased by 6.5 fold as compared with the spore yield before fermentation technology optimization.

Bacillussubtilis; fermentation technology; response surface analysis

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.16

2016-12-15

浙江省重中之重學科開放研究基金(20150109)

鄒高溪(1991—)，男，湖南永州人，碩士研究生，研究方向為應用微生物學。E-mall: 1575392595@qq.com

S482.7

A

1004-1524(2017)05-0799-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 799-805

鄒高溪，趙春田，裘娟萍.生防枯草芽孢桿菌210發酵工藝優化[J]. 浙江農業學報，2017，29(5)： 799-805.

*通信作者，裘娟萍，E-mall: qiujping@zjut.edu.cn