復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清抗氧化功能的影響

周金星，靳二輝，劉文舉，張超超，王思飛，金光明，*

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100； 2.安徽科技學院 細胞與分子生物學研究中心，安徽 鳳陽 233100)

復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清抗氧化功能的影響

周金星1，2，靳二輝1，劉文舉2，張超超1，王思飛1，金光明1，*

(1.安徽科技學院 動物科學學院，安徽 鳳陽 233100； 2.安徽科技學院 細胞與分子生物學研究中心，安徽 鳳陽 233100)

由黃芪、板藍根、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、山楂、甘草和山藥等中藥制成的復(fù)方中藥制劑，研究其對大鼠血清總抗氧化能力(T-AOC)、超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性和丙二醛(MDA)含量的影響。選擇150只斷奶SD大鼠(SPF級)分為對照組、1.5 mL·kg-1組、3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組，對照組有15只大鼠，其余試驗組各有45只大鼠。試驗期間3個試驗組大鼠按每千克體質(zhì)量每天分別灌胃1.5、3.0和6.0 mL復(fù)方中藥制劑(含生藥1 g·mL-1)，對照組灌胃3.0 mL蒸餾水。于試驗開始后10、30、60 d，每組分別取5只大鼠禁食禁水10 h后稱重、心臟采血，分離血清，測定樣本血清的T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量。結(jié)果表明，3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組在灌胃后10 、30 和60 d，其血清T-AOC活性與同日期對照組比較有顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)增加；而血清中MDA含量顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)減少。3.0 mL·kg-1組在灌胃30 和60 d，血清T-SOD活性與同日齡對照組比較顯著增加(P<0.05)；6.0 mL·kg-1組在灌胃30 和60 d，血清GSH-Px活性與同日齡對照組比較顯著增加(P<0.05)。說明口服以黃芪、板藍根、炒白術(shù)等藥材組成的復(fù)方中藥制劑可顯著提高SD大鼠的抗氧化功能，其對大鼠的最適灌胃劑量為3.0 mL·kg-1。

復(fù)方中藥制劑；SD大鼠；總抗氧化能力；超氧化物歧化酶；谷胱甘肽過氧化物酶；丙二醛

活性氧自由基(reactive oxygen specie，ROS)，具有很強的生物活性，易與細胞成分反應(yīng)，造成生物膜系統(tǒng)和生物結(jié)構(gòu)的損壞，使蛋白質(zhì)失活，引起細胞DNA、RNA在結(jié)構(gòu)和功能上的損害[1]。而機體抗氧化系統(tǒng)是動物體內(nèi)清除多余活性氧、保護自身免受氧化損傷的重要體系，包括非酶類抗氧化劑和酶類抗氧化劑[2]，衡量機體抗氧化功能常用指標主要有總抗氧化能力(total antioxidative capacity， T-AOC)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase， SOD)、過氧化氫酶(catalase， CAT)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)等。這些抗氧化劑在清除體內(nèi)自由基，減少脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物，防止各種病理變化中發(fā)揮重要作用[3]。而生物體內(nèi)自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的終產(chǎn)物為丙二醛(MDA)，它可引起蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子交聯(lián)聚合且具有細胞毒性。因此，研究血清中酶類抗氧化劑活性及氧化產(chǎn)物對動物機體的代謝具有重要的意義。

中草藥是我國傳統(tǒng)藥材，具有副作用較小的優(yōu)點。研究表明，許多中草藥對機體具有抗氧化作用，可清除體內(nèi)氧自由基，張偉等[4]研究表明，將黃芩、黃芪、紫蘇、山楂、陳皮等配成中藥復(fù)方，可顯著降低豬血清中MDA含量，GSH-Px的活性顯著高于對照組；劉澤靜等[5]研究表明，魚腥草提取物具有較好的抗氧化作用；郝紅偉等[6]研究了以烏梅、馬莧齒為主要成分的復(fù)方中藥制劑可以顯著增強小鼠血清、心、肝、脾、腎組織中SOD和GSH-Px的活性，降低小鼠上述組織中MDA的含量；吳驍?shù)萚7]研究發(fā)現(xiàn)，黃芪注射液可有效地提高機體抗氧化酶活性；Guo等[8]研究表明，以黃柏和白術(shù)等中藥制成的復(fù)方制劑具有一定的抗氧化功能。因此，本研究選擇黃芪、板藍根、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、山楂、甘草和山藥等中藥按一定比例配比經(jīng)水浸泡、水煮、濃縮成1 g·mL-1的藥液，通過對SD大鼠進行灌胃處理，觀察不同時間、不同劑量藥劑對SD大鼠血清T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量的影響，為復(fù)方中藥制劑開發(fā)提供研究基礎(chǔ)和依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物

150只(25±2)日齡健康、體質(zhì)量相似的SPF級雄性斷奶大鼠購自安徽醫(yī)科大學實驗動物中心(許可證號：SCXK皖2011-002)。大鼠飼養(yǎng)于全膜終端獨立通氣籠盒(IVC)內(nèi)，溫度為24～28 ℃，濕度為50%～60%，光照時間為12 h·d-1。SD大鼠的飼養(yǎng)管理及IVC的清洗、消毒、滅菌等均嚴格按照IVC標準化操作規(guī)范進行。

1.1.2 試驗試劑及儀器設(shè)備

總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20160802)、超氧化物歧化酶(T-SOD)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20160915)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20160815)、丙二醛(MDA)測定試劑盒(生產(chǎn)批號：20160815)均購買自南京建成生物工程研究所；主要儀器有：熒光分光光度計(型號：UV-2700，日本島津)、高速冷凍離心機(型號：Thermo Scientific Sorvall Stra，德國賽默飛世爾)。

1.1.3 復(fù)方中草藥配制及制劑的主要成分

試驗所用復(fù)方中草藥主要由黃芪15 g、板藍根10 g、炒白術(shù)10 g、茯苓15 g、陳皮15 g、山楂15 g、甘草10 g和山藥10 g等按一定的配比后，添加4倍于復(fù)方中草藥質(zhì)量的蒸餾水，經(jīng)浸泡過夜、水煮、過濾、濃縮、醇沉后，制成復(fù)方中藥水煎醇沉液，每毫升藥液相當于1 g生藥材。

復(fù)方中藥制劑的水煎醇沉液經(jīng)青島科標檢測研究院對其主要成分含量進行檢測，試驗所用的水煎醇沉制劑中各主要成分的含量為：總多糖6.12 g·L-1，總皂苷0.448 g·L-1，總黃酮0.047 g·L-1，白術(shù)內(nèi)酯3.67 mg·L-1，甘草苷82.44 mg·L-1。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗動物的分組與處理

選擇150只斷奶SD大鼠(SPF級)，分為對照組、1.5 mL·kg-1組、3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組，對照組有15只小鼠，其余試驗組各有45只小鼠，預(yù)飼養(yǎng)1周后，每天定時測定大鼠體質(zhì)量變化，稱重前3 h，禁食禁水，試驗期間三個試驗組大鼠按每千克體質(zhì)量每天分別灌胃1.5、3.0和6.0 mL復(fù)方中藥制劑，每天灌胃1次，對照組灌胃3.0 mL蒸餾水。

1.2.2 血樣采集與檢測

各試驗組和對照組分別在試驗開始后10、30、60 d時間段，每組取5只大鼠禁食10 h以上，稱重后經(jīng)乙醚麻醉，心臟采血，血凝后離心，取血清，經(jīng)UV2700紫外熒光分光光度計測定樣本血清的吸光度，按照試劑盒上公式由吸光度值計算T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和MDA含量。所有計算方法均按試劑盒操作說明進行。

1.2.3 統(tǒng)計分析

用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進行所得數(shù)據(jù)的處理，各組數(shù)據(jù)之間差異性采用單因子方差分析(One-Way ANOVA)和LSD法進行多重比較分析，以P<0.05作為差異顯著性判斷標準。所有數(shù)據(jù)均用平均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清T-AOC的影響

由表1可知，在不同組別的SD大鼠飼養(yǎng)中定時定量灌喂不同劑量復(fù)方中藥制劑，在試驗前期(0～10 d)，除1.5 mL·kg-1組以外，其余各試驗組與對照組比較其T-AOC都顯著增加，其中3.0 mL·kg-1組增加極顯著(P<0.01)；在試驗至30 d時，1.5 mL·kg-1組與對照組比較，其T-AOC增加不顯著，3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組，其血清中T-AOC與對照組比較增加顯著(P<0.05)，但3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組間比較差異不顯著；在試驗至60 d時，與對照組比較，3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組T-AOC增加極顯著(P<0.01)，但1.5 mL·kg-1組T-AOC增加不顯著，3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組間比較差異顯著(P<0.05)。

2.2 復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清T-SOD活性的影響

由表2可知，在灌胃10 d后，與對照組比較，3個試驗組大鼠血清中T-SOD活性雖然較對照組有所增加，但差異不顯著(P>0.05)；試驗至30 d時，1.5 mL·kg-1組和3.0mL·kg-1組大鼠血清的T-SOD活性較對照組增加，其中3.0mL·kg-1組血清的T-SOD活性增加顯著(P<0.05)，6.0 mL·kg-1組大鼠血清的T-SOD活性較對照組下降，但差異不顯著(P>0.05)；試驗至60 d時，3.0 mL·kg-1組大鼠血清的T-SOD活性較對照組增加且差異顯著(P<0.05)，6.0 mL·kg-1組大鼠血清的T-SOD活性較同日齡對照組下降，但差異不顯著(P>0.05)，但與3.0 mL·kg-1組間比較差異顯著(P<0.05)。

表1 不同劑量復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清中T-AOC的影響

Table 1 Effect of different dose compound Chinese medicine preparation on the T-AOC in serum of SD rats U·mL-1

同行數(shù)據(jù)后無相同大小字母分別表示組間差異極顯著(P<0.01)和顯著(P<0.05)。下同。

Data marked without the same uppercase and lowercase letter in each row indicated significant differences atP<0.01 andP<0.05， respectively. The same as bellow.

2.3 復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清GSH-Px活性的影響

由表3可知，在灌胃10 d后，1.5 mL·kg-1組血清中GSH-Px活性減少且與對照組比較差異顯著(P<0.05)，3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組增加，但與對照組比較差異都不顯著(P>0.05)，但與1.5 mL·kg-1組比較差異顯著增加(P<0.05)；在灌胃后30 和60 d，6.0 mL·kg-1組大鼠血清中GSH-Px酶活性與對照組比較呈顯著性增加(P<0.05)，除在灌胃后30 d，3.0 mL·kg-1組與對照組和1.5 mL·kg-1組差異顯著外，其余各試驗組與對照組比較差異不顯著(P>0.05)。

2.4 復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清MDA含量的影響

由表4可知，在灌胃后10 d，3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組血清中MDA含量與對照組比較顯著減少(P<0.05)，但1.5 mL·kg-1組血清中MDA含量與對照組比較差異不顯著(P>0.05)；灌胃30 和60 d時，3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組血清中MDA含量與對照組比較極顯著減少(P<0.01)，1.5 mL·kg-1組血清中MDA含量與對照組比較差異不顯著(P>0.05)，但1.5 mL·kg-1組與3.0 mL·kg-1和6.0 mL·kg-1組間比較差異顯著(P<0.05)。

表2 不同劑量復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清中T-SOD活性的影響

Table 2 Effect of different doses of compound Chinese medicine preparation on the T-SOD activity in serum of SD rats U·mL-1

表3 不同劑量復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清中GSH-Px活性的影響

Table 3 Effect of different doses of compound Chinese medicine preparation on the GSH-Px activity in serum of SD rats U·mL-1

表4 不同劑量復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清中MDA含量的影響

Table 4 Effect of different doses of compound Chinese medicine preparation on the MDA contents in serum of SD rats nmol·mL-1

3 討論

3.1 中草藥復(fù)方制劑對SD大鼠血清中T-AOC、T-SOD和GSH-Px的作用

抗氧化劑的主要作用是清除體內(nèi)較高的氧自由基與機體代謝產(chǎn)物，維持機體代謝的平衡和穩(wěn)定，當T-AOC降低后，可導(dǎo)致機體活性氧水平升高，產(chǎn)生炎性介質(zhì)，造成機體組織的損傷。T-SOD可對抗與阻斷氧自由基對細胞造成的損害，并及時修復(fù)受損細胞，復(fù)原因自由基造成的對細胞的傷害。GSH-Px活性體現(xiàn)了機體清除體內(nèi)氧自由基能力，可以保護組織細胞免受損傷和細胞膜結(jié)構(gòu)功能的完整性[9]。本研究結(jié)果表明，隨著復(fù)方中藥制劑灌胃劑量和時間的增加，與對照組相比，SD大鼠血清中T-AOC逐漸增加，其中3.0 mL·kg-1組T-SOD活性在灌胃后30 和60 d極顯著增加；GSH-Px活性在6.0 mL·kg-1組灌胃后30 和60 d增加顯著，說明本復(fù)方中藥制劑可一定程度上提高血清中T-AOC、T-SOD和GSH-Px活性，增加機體抵抗氧自由基損傷組織細胞的功能。本復(fù)方中藥制劑中，經(jīng)青島科標檢測研究院對其主要成分含量進行檢測，其中有效成分甘草苷的含量高達82.44 mg·L-1，有學者研究結(jié)果表明，甘草苷30 mg·kg-1·d-1組和60 mg·kg-1·d-1組可顯著提高小鼠皮膚中SOD的活性[10]，增強腦組織中SOD、GSH-Px活性[11]，因此，本研究中，經(jīng)灌胃后30 和60 d，其3.0 mL·kg-1組的T-SOD活性的增加可能與復(fù)方中藥制劑中甘草苷的大量存在相關(guān)。

本復(fù)方中藥制劑中，選取“清熱解毒、扶正固本”類中藥黃芪、板藍根、茯苓、陳皮、山楂、甘草及山藥為主要組成成分，研究表明，這些中藥中含有的多糖成分也具有較好的體內(nèi)抗氧化作用。日糧中添加不同水平的黃芪多糖，可顯著或極顯著提高各黃芪多糖處理組雛雞血清中SOD、GSH-Px和GR的活性，不同程度地提高蛋雞血清和蛋黃SOD、血清GSH-Px和T-AOC活性[12-14]；陳紅梅[15]研究表明，在質(zhì)量濃度達到0.4 mg·mL-1時，茯苓皮多糖對羥基自由基的清除能力高于Vc，具備天然抗氧化劑的作用；盧華杰等[16]研究結(jié)果表明，茯苓多糖具有較好的抗氧化作用。山楂多糖具有較好的抗氧化功能，可以清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基能力[17]；山楂蜂花粉多糖及山藥多糖對DPPH自由基的清除作用和羥基自由基的抑制作用明顯[18-19]。上述研究都注重單一的中草藥成分如多糖的抗氧化作用，但中草藥藥物成分復(fù)雜，許多成分如皂苷、黃酮及苷類等都具有抗氧化功能，通過復(fù)方組配，可以取長補短，均衡中藥制劑中各有效成分的含量，提高復(fù)方制劑的抗氧化功能。經(jīng)對本復(fù)方中藥制劑檢測發(fā)現(xiàn)，其總多糖成分高達6.12 g·L-1，總皂苷0.448 g·L-1，總黃酮0.047 g·L-1，白術(shù)內(nèi)酯3.67 mg·L-1，甘草苷82.44 mg·L-1，說明本復(fù)方中藥制劑中含量較高的多糖、甘草苷、總黃酮等藥物成分協(xié)同增加了抗氧化功能，可有效地提高SD大鼠血清中抗氧化酶的活性，增強機體的抗氧化能力。值得注意的是，在不同日期，1.5 mL·kg-1組與對照組比較往往差異不顯著(P>0.05)，而3.0 mL·kg-1組與對照組比較差異顯著或極顯著(P<0.05或P<0.01)，說明本復(fù)方中藥制劑在發(fā)揮抗氧化作用時其用量需達到一定的閾值后才能發(fā)揮作用，以3.0 mL·kg-1組抗氧化能力最強，6.0 mL·kg-1組有些抗氧化指標反而不如3.0 mL·kg-1組，說明抗氧化能力與復(fù)方中藥制劑的用量并不呈正相關(guān)。

3.2 中草藥復(fù)方制劑對SD大鼠血清中MDA含量的影響

生物體內(nèi)，自由基作用于脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)，氧化的終產(chǎn)物為丙二醛(MDA)，能引起蛋白質(zhì)、核酸等生命大分子的交聯(lián)聚合，且具有細胞毒性。MDA是氧自由基過量形成或抗氧化系統(tǒng)削弱時引起細胞的損傷，其原理是觸發(fā)細胞膜上的不飽和脂肪酸發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生MDA，使細胞膜通透性增加和細胞膜流動性降低，Ca+流入細胞內(nèi)，使Ca+負荷增加，從而導(dǎo)致細胞的死亡[20]。研究結(jié)果表明，飼料中MDA含量增加可導(dǎo)致草魚生長性能下降，損傷草魚肝胰腺增加脂肪性肝炎的發(fā)生率，以及損傷草魚腸道絨毛和微絨毛，降低其消化吸收能力[21-22]。對于中藥制劑對動物血清及器官組織中MDA水平的影響研究較多，如李姿慧等[23]研究結(jié)果表明，參苓白術(shù)散能顯著改善脾虛濕困型UC大鼠血清EGF、SOD、MDA的水平；于蓮等[20]研究了納米山藥多糖可明顯降低大鼠結(jié)腸中MDA含量。山楂葉總黃酮可抑制高脂飲食所升高的MDA水平[24]，腹腔注射板藍根多糖可顯著降低中華鱉肝臟中MDA含量[25]。因此，通過減少器官或血清中MDA的含量或抑制MDA的產(chǎn)生，將對細胞損傷起重要的保護作用。本研究結(jié)果表明，復(fù)方中藥制劑在3.0 mL·kg-1組和6.0 mL·kg-1組時，與對照組比較其血清中MDA含量呈現(xiàn)顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)減少，說明本復(fù)方制劑可有效減少血清中MDA的含量，減少其對細胞產(chǎn)生的損傷。

綜上所述，由黃芪、板藍根、炒白術(shù)、茯苓、陳皮、山楂、甘草和山藥按一定配比制成的復(fù)方中藥制劑對提高大鼠血清中T-AOC、T-SOD、GSH-Px活性和降低血清中MDA含量具有較好的效果，其中以3.0 mL·kg-1灌胃組對大鼠抗氧化功能提高最為顯著。

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(責任編輯 盧福莊)

Effect of compound Chinese medicine preparation on the antioxidant function in serum of SD rats

ZHOU Jinxing1，2， JIN Erhui1， LIU Wenju2， ZHANG Chaochao1， WANG Sifei1， JIN Guangming1，*

(1.CollegeofAnimalScience，UniversityofScienceandTechnologyofAnhui，F(xiàn)engyang233100，China; 2.CellandMolecularBiologyResearchCenter，UniversityofScienceandTechnologyofAnhui，F(xiàn)engyang233100，China)

To study the effects of compound traditional Chinese medicine preparation， which consists ofRadixastragali，Radixisatidis，F(xiàn)riedatractylodes，Poriacocos， orange peel， hawthorn， liquorice and yam on the T-AOC， T-SOD， GSH-Px activity and MDA content in serum of SD rats. 150 SD rats (SPF animal) were randomly divided into control group， 1.5， 3.0 and 6.0 mL·kg-1treatment group with 15， 45， 45， 45 SD rats， respectively. The rats of different treatment groups were administered using gavage methods according to dosage 3.0 mL·kg-1distilled water for control group， and 1.5， 3.0 and 6.0 mL·kg-1compound traditional Chinese medicine preparation (containing raw herbs 1 g·mL-1) for treatment groups， respectively. Rats were regularly weighed and given medicine or distilled water by gavage every day. On the 10th， 30thand 60thday of the experiment， 5 rats fasted and banned water for 10 h were selected in every experiment group to be weighed and picked blood from the heart， for isolating serum sample to measure T-AOC， T-SOD， GSH-Px activities and MDA content. The results showed that on the experimental 10th， 30thand 60thday， the T-AOC activity in 3.0 mL·kg-1and 6.0 mL·kg-1group significantly (P<0.05) or extremely significantly increased (P<0.01)， and the MDA contents in 3.0 mL·kg-1and 6.0 mL·kg-1group significantly (P<0.05) or extremely significantly decreased (P<0.01)， compared with the control group on the same day. On the 30thand 60thday， the T-SOD activity in 3.0 mL·kg-1group significantly increased (P<0.05)， and the GSH-Px activity in 6.0 mL·kg-1group significantly increased (P<0.05)， compared with the control group. Compound traditional Chinese medicine preparation could significantly improve the SD rats’ antioxidant function. The optimum dosage of compound traditional Chinese medicine preparation to rats was 3.0 mL·kg-1by gavage methods.

compound traditional Chinese medicine preparation; SD rat; T-AOC; T-SOD; GSH-Px; MDA

http://www.zjnyxb.cn周金星，靳二輝，劉文舉，等. 復(fù)方中藥制劑對SD大鼠血清抗氧化功能的影響[J].浙江農(nóng)業(yè)學報，2017，29(5): 737-743.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.08

2016-12-13

安徽省農(nóng)業(yè)科技成果轉(zhuǎn)化項目(1504032001)；安徽省科技攻關(guān)項目(1301042102)；安徽省高等學校自然科學研究重點項目(KJ2016A823)；安徽省第七批“115”產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團隊項目(皖人才[2014]4號)；安徽科技學院重點建設(shè)學科項目(AKZDXK2015A04)；北京農(nóng)學院獸醫(yī)學(中獸醫(yī))北京市重點實驗室開放課題(kf2016035)

周金星(1976—)，男，安徽五河人，博士，副教授，主要從事動物組織病理與中草藥藥理學研究。E-mail: zhoujx@ahstu.edu.cn

*通信作者，金光明，E-mail: jingm@ahstu.edu.cn

S853.1

A

1004-1524(2017)05-0737-07

浙江農(nóng)業(yè)學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 737-743