靶向雞Stra8基因的miRNA預測及鑒定

王穎潔，左其生，張良良，張文慧，金 晶，王 飛，紀艷芹，靳 鍇，何娜娜，李碧春，張亞妮

(揚州大學 動物科學技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

靶向雞Stra8基因的miRNA預測及鑒定

王穎潔，左其生，張良良，張文慧，金 晶，王 飛，紀艷芹，靳 鍇，何娜娜，李碧春*，張亞妮*

(揚州大學 動物科學技術學院 江蘇省動物遺傳繁育與分子設計重點實驗室，江蘇 揚州 225009)

為克隆如皋黃雞Stra8基因的3’UTR，尋找靶向Stra8基因的microRNA(miRNA)，以雞精原干細胞的cDNA為模板，根據NCBI數據庫Stra8的CDS序列設計引物，通過3’RACE技術克隆Stra8基因的3’UTR，并構建相應的熒光素酶表達載體和突變載體；利用生物學預測軟件對靶向Stra8 3’UTR的miRNA進行預測，選擇評分最高的miRNA進行慢病毒載體構建；以pRL-TK為內參，分別將miRNA與Stra8 3’UTR熒光素酶表達載體和突變載體共轉染DF-1細胞，利用雙熒光素酶基因報告系統對miRNA進行活性檢測。結果表明，采用3’RACE技術成功克隆Stra8 基因的3’UTR；Targetscan生物在線軟件預測到靶向Stra8基因的4個特異性較高的miRNA，并成功構建其相應的慢病毒載體；雙熒光素酶活性檢測結果顯示，gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218均可通過3’UTR序列抑制Stra8基因的表達，其中gga-miR-31抑制效果最佳。該結果可為后續深入探討gga-miR-31介導調控的Stra8基因在雄性生殖細胞分化中的調控網絡提供依據。

雞；miRNA；Stra8；gga-miR-31；雙熒光素酶活性檢測系統

Stra8(stimulated by retinoic acid gene 8)基因是Bouillet等[1]從小鼠全能的P19 胚胎癌細胞中篩選出的視黃酸反應基因之一。隨著高通量測序技術在生物研究中的大量應用，眾多的miRNA被發現參與調控精子的發生過程。miRNA的調節機制主要是通過堿基互補配對原則與目標mRNA分子的3’端非編碼區域(3-untranslated region，3’UTR)結合從而誘導目標mRNA降解或者抑制其翻譯過程[2]。研究表明，miR-124a與Scp3作用，通過與粗線期精母細胞或精子細胞的H1t/GC-box 結合，進而激活 H1t 組蛋白啟動子[3]；miR-29b[4]通過與Dnmt3a、Dnmt3b作用調控PGC向雌性生殖細胞分化；miR-18通過下調熱休克蛋白2(HSP2)的表達而在小鼠精子發生過程中起到一定的調控作用[5]；miR-34c通過靶向Nanos2以促進小鼠鼠精原干細胞的分化[6]。眾多研究結果提示，miRNA在雄性生殖細胞的分化中起關鍵性的調控作用。

在哺乳動物中，Stra8是生殖細胞由有絲分裂轉變減數分裂前特異表達的基因[7-10]。研究表明，RA (retinoic acid) 可調控Stra8基因的表達，在RA的激活下生殖細胞表達Stra8促使細胞從有絲分裂進入減數分裂前期，產生有性生殖生物配子[11-13]；Mark等[12]在小鼠上對Stra8基因進行敲除后，發現敲除鼠除生殖功能發生變化外，其他表型均未發生變化；王丹[14]發現過表達Stra8能夠促進雞胚胎干細胞分化成精原干細胞；劉志永等[15]用Am80和TSA聯合誘導下Stra8啟動子啟動活性增強。但是目前關于家禽Stra8基因的表達是否受到miRNA調控尚屬未知。

本試驗旨在利用3’RACE技術克隆如皋黃雞Stra8基因的3’UTR序列，預測直接靶向Stra8基因的miRNA；采用雙熒光素酶報告基因系統尋找活性最佳的miRNA，以期進一步研究miRNA介導調控的Stra8基因在家禽雄性生殖細胞分化中的作用，為揭示生殖細胞形成機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

如皋黃雞來自中國農業科學院家禽研究所；DF-1細胞為本實驗室保存；Trizol、大腸埃希菌DH5α感受態、膠回收試劑盒及小提質粒試劑盒均購自北京天根公司(北京)；雙熒光素酶檢測試劑盒 Dual-Luciferase?Reporter Assay System 購自Promega 公司(美國)；LipofectamineTM2000 購自 Invitrogen公司(美國)；Taqpolymerase購自NEB(美國)；瓊脂糖購自Bio-Rad(美國)；T4 DNA ligase、T4 DNA ligase buffer、DNA ladder、BamHⅠ、EcoRⅠ、XbaⅠ、XhoⅠ、3’Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase購自TaKaRa(大連)；胎牛血清、DMEM、胰酶購自GIBICO(美國)；其余試劑均為進口或國產分析純。PGL3-CMV-LUC-MCS載體、pGMLV-MA2載體、pRL-TK載體購自吉滿生物，引物合成及測序由生工生物工程(上海)有限公司完成。

1.2 克隆Stra8基因的3’UTR

通過NCBI提供的CDS序列(JX204292.1)，設計3’RACE 引物F1、F2(表1)。首先利用Trizol法提取精原干細胞總RNA，再使用TaKaRa 3’Full RACE Core Set with PrimeScriptTMRtase 進行3’RACE試驗獲取Stra8基因的3’UTR。

1.3 生物信息學預測與雞Stra8 基因3’UTR作用的miRNA

使用 Targetscan (http://www.targetscan.org/)在線生物軟件預測在Stra8基因3’UTR處存在潛在靶標關系的雞源miRNAs，選出可能性最大的4條miRNAs作為候選miRNA進行后續試驗。

表1Stra8 3’RACE引物

Table 1 Primers ofStra8 3’RACE

引物名稱Name引物序列Sequenceofprimer(5′→3′)Stra83’RACE?F1CTGGGTCCTACGGATGCTTGStra83’RACE?F2CGTTTGATGTTGCTGCTGGTT

1.4 報告基因載體及miRNA mimic構建

利用3’RACE得到的Stra8基因的3’UTR序列，加上XhoⅠ和XbaⅠ酶切位點(表2)，克隆至 PGL3-CMV-LUC-MCS載體中，命名為PGL3-Stra8-3’UTR(野生型，簡寫為WT)。依據篩選的miRNA序列合成的引物(表2)，進行PCR擴增，克隆至pGMLV-MA2載體中命名為miR-1a、miR-1b、miR-31、miR-218。

靶基因雙熒光素酶突變載體的構建主要是通過PCR的方法替換掉靶基因上的 miRNA結合位點。以PGL3-Stra8-3’UTR載體為模板，設計靶位點區突變引物(表2)，分別與Stra8基因3’UTR引物擴增，得到靶基因3’UTR序列結合位點上下游片段，以上下游片段混合物作為模板，PCR擴增無結合位點的靶基因3’UTR突變序列，然后通過連接至PGL3-CMV-LUC-MCS載體中，構建Stra8靶位點突變報告載體PGL3-Stra8-3’UTR-MT(簡寫為MT)。

1.5 細胞轉染與雙熒光素酶檢測

DF-1細胞用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養液，于37 ℃、5% CO2條件下培養。細胞瞬時轉染按照LipofectamineTM2000轉染操作說明書進行。轉染前1 d接種24孔板，每孔細胞量約1×105個，培養過夜后對每孔細胞分別轉染5組質粒，并設空白對照，具體試驗分組：(1)miR-NC、PGL3-Stra8-3’UTR和 pRL-TK；(2)gga-miR-1a mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和 pRL-TK；(3)gga-miR-1b mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(4)gga-miR-31 mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(5)gga-miR-218 mimic、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK。

轉染完成后棄去細胞培養板中的培養液，按照雙熒光素酶檢測試劑盒說明，檢測螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性，計算每個轉染3個平行樣的相對發光比率(relative light unit，RLU)，并計算標準差，根據得到的比值來比較不同樣品間報告基因的激活程度。同樣的方法對點突變試驗進行分組：(1) miR-NC、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(2) miR-31、PGL3-Stra8-3’UTR和pRL-TK；(3) miR-31、PGL3-Stra8-3’UTR-MT和pRL-TK。

1.6 統計學處理

所有數據以均數±標準誤(Mean±SEM) 表示，應用GraphPad Prism 6.0統計學軟件，采用兩樣本均數間t檢驗的方法，P<0.05表示差異顯著；P<0.01表示差異極顯著。

2 結果與分析

2.1 雞Stra8 基因3’UTR獲取

以精原干細胞的cDNA為模板，根據NCBI數據庫Stra8的CDS序列設計引物進行3’RACE擴增，克隆出大小約為500 bp和1 000 bp的條帶(圖1-A)，經連接T載體測序后得到包含多聚ploy A的Stra8的3’UTR序列(圖1-B)。

表2 引物序列

Table 2 Sequence of primers

引物名稱Name引物序列Sequenceofprimer(5′→3′)Stra8?3’UTR?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GTAGTTTCCCTGTTTGTCAATGTTTTGCStra8?3’UTR?R(XbaⅠ)GGCTCTAGA AATTTCAAGACACCATCTGAGCAGTACTACTCMT?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GTAGTTTCCCTGgTgtTaccTGgTggtaaAAGCATCACMT?R(XbaⅠ)CCGCTCTAGA AATTTCAAGACACCATCgga?miR?1a?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG ACTGCCTCTTCCCAGCCCTAAgga?miR?1a?R(BamⅢ)CCGGGATCC ATGCCGCAGTCAGCATATTGAAgga?miR?1b?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG ATTGGCTGCAGCTGAGTGCCgga?miR?1b?R(BamⅠ)CCGGGATCC TCCTGTCATCTCGTGTCACCTCGgga?miR?31?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG AGCACAGAAGTCAAAACAGCCCTTTgga?miR?31?R(BamⅢ)CCGGGATCC AAGGGCTGGAAACAGCTCAGTGgga?miR?218?F(XhoⅠ)CCGCTCGAG GGTGGAGGAAACTTTCAATGTGGTTgga?miR?218?R(BamⅢ)CCGGGATCC GCAGCAAGAATAAATAGATCCTGAATGCC

標有下劃線的為酶切位點。

The underlined expresses restriction site.

2.2 生物信息學預測雞Stra8基因靶向miRNAs

本研究利用生物信息學在線軟件Targetscan反向預測了雞Stra8基因靶向的miRNAs。根據預測結果選擇評分較高的4個miRNAs: gga-miR-1a、gga-miR-1b、gga-miR-31、gga-miR-218均與Stra8基因的3’UTR存在互補結合位點(表3)，因此以此4個miRNAs作為調控雞Stra8基因的候選miRNA進行下一步篩選。

2.3 miRNA模擬物及雞Stra8基因3’UTR雙熒光素酶靶標載體與突變載體構建

經測序驗證后，構建含有雞Stra8基因3’UTR序列的PGL3-Stra8-3’UTR載體，利用XhoⅠ和XbaⅠ進行雙酶切鑒定得到679 bp的3’UTR片段及5.4 kb PGL3的骨架載體(圖2-A、D、E)。同樣的方法驗證構建好的Stra8基因的3’UTR雙熒光素酶靶標突變載體(圖2-C)。

gga-miR-1a、gga-miR-1b、gga-miR-31、gga-miR-218克隆至pGMLV-MA2載體中，分別構建其模擬物miR-1a、miR-1b、miR-31、miR-218，經測序顯示克隆成功(圖3)。

2.4 miRNA對雞Stra8基因3’UTR的調控

重組載體PGL3-Stra8-3’UTR分別與4種gga-miRNA mimics轉染DF-1細胞系，同時設置miR-NC為陰性對照，24 h后用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測，結果如圖4-A所示。經t檢驗，miR-1a、miR-31、miR-218對雞Stra8基因3’UTR抑制效果差異顯著，其中miR-31+PGL3-Stra8-3’UTR共轉染組的相對熒光素酶活性較miR-NC+PGL3-Stra8-3’UTR共轉染組降低了32%(P<0.01)，miR-1a組降低了20.3%(P<0.01)，miR-218組降低了19.3%(P<0.01)；而PGL3-Stra8-3’UTR與miR-1b共轉染時，其熒光比率較對照組沒有顯著差異(P>0.05)，說明gga-miR-1b對Stra8基因3’UTR無抑制作用。從最開始預測的4種miRNAs中初步篩選出3種miRNAs(gga-miR-1a、gga-miR-31、gga-miR-218)，可通過Stra8-3’UTR靶位點降低PGL3-Stra8-3’UTR的表達，其中gga-miR-31的抑制效果最佳。

A， 3’RACE擴增Stra8基因3’UTR；B， Stra8基因3’UTR序列A， Amplification of Stra8 3’UTR by 3’RACE；B， Sequence of Stra8 3’UTR圖1 Stra8基因3’UTR克隆Fig.1 Cloning of Stra8 3’UTR

表3 與雞Stra8基因3’UTR有互補結合位點的可能miRNAs

Table 3 Potential miRNAs targeting 3’UTR ofGallusStra8 gene

miRNAmiRNAmiRNA比對序列miRNA?align比對模式Alignment基因比對序列Gene?aligngga?miR?1a3’AUGUAUGAAGAAAUGUAAGGU5’|∶||||||：| ||：|||||5’TTTATACTTTTAAACGTTCCA3’gga?miR?1b3’AUGUAUGAAGAAUUGUAAGGU5’|∶||||||∶| ||∶|||||5’TTTATACTTTTAAACGTTCCA3’gga?miR?313’AUACGGUUGUAGAACGG5’|||∶|||∶∶|∶|||||5’TTTGTCAATGTTTTGCC3’gga?miR?2183’UGUACCAAUCUA?GUUCGUGUU5’∶|||| ||||||||∶||||5’GCTTGGAGAGATGCAAGTACAA3’

A，PGL3-CMV-LUC-MCS；B，miR-31靶向Stra8-3’UTR結合位點；C，PGL3-Stra8-3’UTR測序結果；D，PGL3-Stra8-3’UTR-MT測序結果；E，雙酶切鑒定PGL3-Stra8-3’UTR及PGL3-Stra8-3’UTR-MT(1，WT；2，MT；M，DL5000 Marker)A， PGL3-CMV-LUC-MCS；B， Binding site of miR-31 to Stra8-3’UTR；C， Sequencing results of PGL3-Stra8-3’UTR；D， Sequencing results of PGL3-Stra8-3’UTR-MT ；E， Dual digestion of PGL3-Stra8-3’UTR and PGL3-Stra8-3’UTR-MT(1， WT；2， MT；M， DL5000 Marker)圖2 PGL3-Stra8-3’UTR及PGL3-Stra8-3’UTR-MT構建Fig.2 Construction of PGL3-Stra8-3’UTR and PGL3-Stra8-3’UTR-MT

A， miR-1a；B， miR-1b；C， miR-31；D， miR-218圖3 四個miRNA模擬物測序峰圖Fig.3 Sequencing peak map of 4 miRNA mimics

為了進一步驗證gga-miR-31與Stra8-3’UTR結合的靶位點，本試驗將gga-miR-31與Stra8-3’UTR的靶位點進行了反義突變(圖2-B)，設計構建針對gga-miR-31的Stra8-3’UTR突變載體并命名為PGL3-Stra8-3’UTR-MT(MT)(圖2-C)。并將miR-31與PGL3-Stra8-3’UTR(WT)或PGL3-Stra8-3’UTR-MT(MT)共轉染的雙熒光素酶活性差異比較見圖4-B。與miR-NC對照組相比，miR-31能顯著下調PGL3-Stra8-3’UTR的熒光素酶活性，驗證了miR-31能靶向結合雞Stra8基因3’UTR，并對其表達進行調控。

3 討論

在生物演變過程中，miRNA扮演著重要的角色，miRNA是一種大小約21～23個堿基的單鏈小分子RNA，是由具有發夾結構的約70～90個堿基大小的單鏈RNA前體經過Dicer酶加工后生成，成熟miRNA 引導 RISC 以堿基互補配對的方式與靶 mRNA 3’端非翻譯區(3’UTR)進行完全配對或非完全配對結合，從而引起靶mRNA 的降解或抑制其翻譯。因此本研究通過3’RACE技術克隆出雞Stra8基因的3’UTR序列，利用Targetscan對靶向其3’UTR的miRNA進行了預測，發現存在靶向Stra8基因的miRNA，并篩選出能抑制Stra8表達的最佳miRNA。

Stra8基因是減數分裂的起始標志基因，研究表明，Stra8的表達不僅受到RA等一些小分子化合物的調控，還受到一些轉錄因子的調控，但是關于是否存在miRNA調控Stra8表達尚未有研究。本試驗通過Stra8 3’UTR預測能靶向的miRNA，雙熒光素酶檢測結果顯示，4個miRNA均能靶向Stra8，即初步說明存在參與雄性生殖分化的miRNA。現有研究表明，miRNA在哺乳動物的精子發生過程中扮演著重要的角色[16-20]。miR-544能直接下調 PLZF 的表達[21]，從而影響雄性生殖干細胞的自我更新與分化的平衡；miR-146 在精子發生分化過程中調節RA的影響[22]，從而調節減數分裂及精子形成；miR-122可能通過抑制TNP2的表達以及與精子發育相關蛋白的表達以影響精樣細胞的生成[23]；PTEN可以負向調控PGCs的增殖，因此靶向PTEN基因的miR-19a和miR-19b可以通過調節PTEN的表達從而調控PGCs的生成[24]。這些均揭示了miRNA在生物發育過程中扮演著重要的角色，尤其是miRNA對基因的調控直接影響到雄性生殖細胞分化。

本試驗篩選出miR-31靶向Stra8的活性最佳，因此初步判斷，在生殖細胞發育過程中miR-31可通過影響Stra8基因的表達，從而調控減數分裂。目前關于miR-31的研究較少，且大部分是關于miR-31的研究與癌癥相關：miR-31過表達會使人肺腺癌細胞周期阻滯在S期[25]；miR-31 通過抑制eNOS表達參與高糖誘導的內皮細胞功能障礙發生發展過程[26]；miR-31通過下調結直腸癌中抑癌基因FIH-1的表達從而增加轉錄因子HIF-1a的活性，最終間接上調HIF-1a所調控的下游腫瘤相關癌基因的表達[27]。miR-31在生殖細胞分化方面并沒有過多的研究，因此本研究后續將對miR-31在生殖細胞分化上的功能進行進一步的研究。

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(責任編輯 張 韻)

Prediction and validation of miRNA targeting chickenStra8 gene

WANG Yingjie， ZUO Qisheng， ZHANG Liangliang， ZHANG Wenhui， JIN Jing， WANG Fei， JI Yanqin， JIN Kai， HE Nana， LI Bichun*， ZHANG Yani*

(CollegeofAnimalScienceandTechnology，YangzhouUniversity，KeyLaboratoryofAnimalBreedingReproductionandMolecularDesignforJiangsuProvince，Yangzhou225009，China)

This paper was aimed to clone 3’UTR ofStra8 gene of Rugao yellow chicken， and predicted the microRNAs (miRNA) targeting the gene to provide theoretical basis for further function study of Stra8 in the process of embryonic stem cells differentiation into the male germ cell mediated by miRNAs. 3′UTR ofStra8 was cloned by 3′RACE based on primers designed from cDNA ofGallusgallusin NCBI， then the vectors of Luciferase expression and mutation was constructed. Targetscan bioinformatics database was used to predict the prospective miRNAs targeting toStra8 and synthesize miRNA mimics. The candidate miRNA mimics and the vectors of Stra8-3’UTR were transiently co-transfected with into DF-1 cells， and pRL-TK vector was used as an internal control reporter. The dual-luciferase reporter assay system was used to evaluate the activity of luciferase. The results showed that 3′UTR ofStra8 was cloned. Four miRNAs has been predicted that targeting toStra8 by using the online bioinformatics database and their lentiviral vectors were constructed successfully. Dual luciferase activity test results showed that gga-miR-1a，gga-miR-31，gga-miR-218 can inhibit gene expression ofStra8， but inhibitor of gga-miR-31 was the best. The gga-miR-31 could significantly inhibit expression ofStra8， the results will provide references for the investigation onStra8 gene regulatory networks in male germ cell differentiation.

Gallusgallus; miRNA;Stra8; gga-miR-31; dual luciferase activity detection

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.07

2016-12-08

國家自然科學基金(31301959)；江蘇省自然科學基金(BK20161331)；校大學生學術科技創新基金資助項目(x20160665)；江蘇高校優勢學科建設工程資助項目

王穎潔(1992—)，女，江蘇鎮江人，博士研究生，主要從事動物胚胎工程與遺傳工程研究。E-mail: maggieyingjie@foxmail.com

*通信作者，張亞妮，E-mail: ynzhang@yzu.edu.cn；李碧春，E-mail: yubcli@yzu.edu.cn

S831.2

A

1004-1524(2017)05-0729-08

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 729-736

王穎潔，左其生，張良良，等. 靶向雞Stra8基因的miRNA預測及鑒定[J].浙江農業學報，2017，29(5)： 729-736.