性成熟前豬睪丸組織中印記基因DNA甲基化狀態分析

陳 曦，楊 芳，李 捷，白利鵬，李丹婷，曹隨忠，沈留紅，余樹民

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

性成熟前豬睪丸組織中印記基因DNA甲基化狀態分析

陳 曦，楊 芳，李 捷，白利鵬，李丹婷，曹隨忠，沈留紅，余樹民*

(四川農業大學 動物醫學院，四川 成都 611130)

為探求性成熟前豬睪丸中印記基因DNA甲基化狀態，以1、2、3月齡三元雜交豬睪丸實質組織為材料，在利用MeDIP-seq(甲基化DNA免疫沉淀測序技術)建立性成熟前豬睪丸全基因組DNA甲基化圖譜的基礎上，比對得到了8個已證實的豬印記基因甲基化狀態。結果顯示，8個印記基因DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10、PLAGL1，在性成熟前豬睪丸組織中的甲基化水平均不高，表現為“非甲基化”或“部分甲基化”；NNAT、PLAGL1啟動子甲基化水平在1～3月齡間保持增長，NAP1L5、IGF2R啟動子甲基化水平在1～2月齡下降，2～3月齡增長，DIRAS3、IGF2、MEST、PEG10 promoter甲基化水平在1～2月齡增長，2～3月齡下降；圖譜中僅比對到4個基因的gene body甲基化狀態，IGF2R、MESTgene body甲基化水平在1～3月齡保持下降，PLAGL1、PEG10 gene body甲基化水平在1～2月齡增長，2～3月齡下降。推測這8個印記基因在性成熟前豬睪丸發育過程中均具有一定活性，且DNA甲基化對印記基因發揮一定的調控作用。

DNA甲基化；印記基因；睪丸；豬；性成熟前

睪丸是雄性哺乳動物產生精子和雄激素的器官，在雄性生殖系統中扮演著重要的角色。豬不僅是畜牧業的重要經濟動物，還是人類疾病研究的重要模型動物。在性成熟前豬睪丸組織中，精子發生尚未完全啟動，生精細胞數量很少，各類睪丸功能體細胞是該階段的主要細胞類型。睪丸體細胞增殖分化最終形成性成熟后精子發生所必需的微環境，是睪丸結構塑造和雄性生殖力維持的基礎。DNA甲基化 (DNA methylation) 作為一種重要的表觀遺傳修飾，在睪丸發育過程中基因組DNA甲基化也發揮著不可忽視的作用。Liang等[1]在小鼠睪丸中發現大量發育階段特異性甲基化的位點，并且這些位點在胚胎及新生期甲基化，而在成年后呈現非甲基化，提示基因組DNA的階段性去甲基化在睪丸發育中發揮作用。另外，Takashima等[2]證實，任意一種DNA甲基轉移酶在小鼠中異常表達均會引起精子發生缺陷而導致雄性不育。由此可知，正確的DNA甲基化模式對于睪丸正常發育是必須的，而異常的甲基化狀態則可導致睪丸功能異常和精子發生阻滯。

在哺乳動物配子或合子發生期間，等位基因受到不對稱的表觀遺傳修飾，導致基因表達具有親本選擇性，這一現象被稱作基因組印記 (genomic imprinting)，這類基因即為印記基因[3]。目前關于印記基因的研究多圍繞人和小鼠展開，且著重于探究印記基因與胚胎發育的關系，而DNA甲基化是控制基因印記的重要機制之一[4]，因此，研究印記基因甲基化狀態可為研究發育調控機制提供依據，但豬性成熟前睪丸中印記基因的甲基化狀態的相關研究還未見報道。

結合高通量測序的甲基化DNA免疫沉淀技術 (MeDIP-seq) 是檢測全基因組DNA甲基化簡單高效的方法之一[5]。本試驗在利用MeDIP-seq對性成熟前 (1月齡、2月齡、3月齡) 豬睪丸甲基化狀態進行全基因組檢測的基礎上，挑選出8個已證實的豬印記基因：DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10、PLAGL1，分析這些印記基因的甲基化狀態，旨在揭示豬性成熟前睪丸中印記基因的甲基化模式，為深入研究DNA甲基化和印記基因對睪丸發育的調控機制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

所有試驗動物均來自四川省崇州市某規模化豬場，為三元雜交豬(皮特蘭×長白豬×大白豬)，接受正常免疫程序及良好飼喂。試驗動物基本情況如表1。

1.2 樣品采集與DNA的抽提

本試驗嚴格按照全國《實驗動物管理條例》規定，采集睪丸組織樣品，-80 ℃保存備用。按照Universal Genomic DNA Extraction Kit Ver.3.0 (Takara Co. Ltd)說明書，從睪丸實質組織樣品中提取基因組DNA。

1.3 MeDIP-seq

基因組DNA使用Bioruptor超聲破碎儀打斷成200～800 bp的片段，取800 ng DNA按照Genomic DNA Sample Prep Kit (Illumina) 說明書，進行末端修復、加A尾、連接測序接頭，經瓊脂糖凝膠電泳篩選出連接成功的DNA片段用于后續實驗。

經上述處理后的DNA樣品參考Down等[6]方法進行MeDIP操作。甲基化DNA免疫沉淀抗體為BioMagTM磁珠 (QIAGEN) 耦合的小鼠抗5′-甲基胞嘧啶單抗，非特異性的小鼠IgG抗體作為陰性對照。使用MinElute PCR Purification Kit(QIAGEN)對免疫沉淀的DNA進行洗脫和純化，進行14個循環的PCR擴增 (使用Genomic DNA Sample Prep Kit中的單端PCR引物)，最后由2%瓊脂糖凝膠電泳篩選300～900 bp的DNA片段，并利用MinElute柱純化。

表1 試驗動物基本信息

Table 1 Basic information of experimental animals

分組Group年齡(性別)Age(Sex)數量Number父本來源Maleparent母本來源MaternalparentT11月齡Onemonthofage(♂)3皮特蘭Pietrain二元雜交母豬aTwo?waycrosssowaT22月齡Twomonthsofage(♂)3皮特蘭Pietrain二元雜交母豬bTwo?waycrosssowbT33月齡Threemonthsofage(♂)3皮特蘭Pietrain二元雜交母豬cTwo?waycrosssowc

甲基化免疫沉淀后的DNA使用熒光定量PCR (qPCR) 進行質控，檢測甲基化區域的富集情況。DNA用洗脫液等份稀釋至5 ng·μL-1，取1 μL用于qPCR。H19啟動子區域的特異性甲基化位點作為陽性對照，GAPDH啟動子區域的非甲基化位點作為陰性對照，引物序列見表2。質控合格的DNA測序文庫送至上海康成測序，使用Illumina HiSeq 2000測序平臺。

1.4 數據處理

測序reads由Illumina HiSeq 2000生成收集，采用Off-Line Basecaller軟件 (OLB V1.8) 進行測序圖像分析以及堿基檢出和轉換。通過Solexa CHASTITY質量過濾后，使用Bowtie軟件[7](V2.1.0) 將clean reads與豬基因組 (UCSC susScr3) 進行比對。豬印記基因信息從Geneimprint印記基因數據庫 (www.geneimprint.com) 下載得到，與測序數據比對。豬基因組CpG島位置及RefSeq基因位置信息從UCSC Genome Browser下載得到，轉錄起始位點上游700 bp到其下游200 bp的區域被定義為啟動子 (promoter)，轉錄起始位點下游2 000 bp到轉錄終止位點的區域被定義為gene body。比對后reads由HTSeq軟件[8]收集并計算甲基化得分，基因組某一特定區域甲基化水平的計算公式及判定規則[9]：甲基化得分=(CpG length/1000) × (mapped reads/kb)，得分低于15.15 reads·kb-1的定義為“非甲基化(unmethylated)”；15.15～152.27 reads·kb-1的定義為“部分甲基化 (partially methylated)”；高于152.27 reads·kb-1則定義為“高甲基化(highlymethylated)”。

表2 qPCR引物序列

Table 2 Primers for qPCR

引物Primer大小Size/bp序列SequenceH1979F：5’TGAATGCTGCGATAGGAGG3’R：5’CCGTAATCCACGGTAAACACT3’GAPDH71F：5’CTCTGCTCCCTCCCCGTT3’R：5’TCCACTCCGCCAGGCTTTA3’

2 結果與分析

2.1 MeDIP質控結果

使用qPCR對甲基化區域的富集情況進行質控。H19是豬的印記基因，其promoter區域表現特異性甲基化，作為陽性對照；看家基因GAPDH的promoter區域表現非甲基化，作為陰性對照。從圖1可看出，MeDIP特異地富集甲基化的DNA區域 (H19 promoter)，而非甲基化區域 (GAPDHpromoter) 富集極少，說明本試驗MeDIP抗體富集效率高、特異性好，得到的甲基化數據真實可靠。

2.2 印記基因的比對

MeDIP-seq共獲得19.04 Gb原始數據，經過濾約有超過190 M的clean reads可用于后續分析。為了得到全基因組DNA甲基化圖譜，我們將MeDIP-seq所獲clean reads比對到豬基因組上 (UCSC susScr3)，9個樣品的平均比對率為82.94%。以上結果表明，本試驗MeDIP-seq的測序數據質量理想。通過對豬性成熟前3個發育時間點 (1、2、3月齡，即T1、T2、T3) 睪丸全基因組CpG島甲基化水平的檢測，本試驗成功構建了性成熟前豬睪丸全基因組DNA甲基化圖譜。

將Geneimprint印記基因數據庫 (www.geneimprint.com) 上收錄的共計30個已證實的豬印記基因比對到甲基化圖譜上，成功比對到8個印記基因，分別為DIRAS3 (DIRAS family， GTP-binding RAS-like 3)、IGF2 (insulin-like growth factor 2)、IGF2R(insulin-like growth factor type II receptor)、MEST(mesoderm-specific transcript)、NAP1L5 (nudeosome assembly protein l-like 5)、NNAT(neuronatin)、PEG10 (patemal expression gene 10)以及PLAGL1 (pleiomorphic adenoma gene-like 1)。

T1、T2、T3分別代表1、2、3月齡三個組別的睪丸樣品；Rep1、Rep2、Rep3代表每組的3個生物學重復T1， T2 and T3 represent the testis tissue samples of 1， 2 and 3 months old pigs， respectively; Rep1， Rep2 and Rep3 represent the three biological replicates of each group圖1 MeDIP質控結果Fig.1 Quality assessment of MeDIP

2.3 性成熟前豬睪丸中印記基因甲基化狀態

本研究檢測了這8個印記基因的promoter和gene body兩種基因元件在性成熟前豬睪丸組織中的甲基化狀態，并分析了其甲基化水平在性成熟前的3個發育時間點 (T1、T2、T3) 之間的變化特征，本次MeDIP-seq只檢測到了其中4個基因gene body區域的甲基化狀態。如表3所示，在性成熟前豬睪丸組織中，8個印記基因均處于較低的甲基化水平，即“非甲基化”和“部分甲基化”的狀態。DIRAS3、NAP1L5、NNAT的promoter甲基化狀態在3個時間點上均為“部分甲基化”，甲基化水平相較于其他5個基因的promoter較高。在檢測到gene body區域甲基化的4個印記基因中，IGR2R、PEG10、PLAGL1的gene body甲基化狀態在3個時間點上均為“部分甲基化”，而MEST的gene body甲基化狀態在3個時間點上均為“非甲基化”。其中，IGR2Rgene body的甲基化水平高于其promoter的甲基化水平。

表3 八個豬印記基因在性成熟前豬睪丸中的甲基化狀態

Table 3 The DNA methylation status of 8 imprinted genes in prepubertal porcine testis

GenenamePromoterT1T2T3GenebodyT1T2T3DIRAS3+++///IGF2—++///IGF2R——++++MEST—++———NAP1L5+++///NNAT+++///PEG10++—+++PLAGL1—+++++

“—”表示甲基化狀態為“非甲基化”；“+”表示甲基化狀態為“部分甲基化”；“++”表示甲基化狀態為“高甲基化”；“/”表示未從全基因組甲基化圖譜中未比對到該基因gene body的甲基化狀態。

“—” represents “Unmethylated”， “+” represents “Partially methylated”， and “++” represents “Highly methylated” for the methylation status; “/” represents that the gene body methylation status of this gene had not been mapped in this profile.

觀察8個印記基因promoter甲基化水平在T1、T2、T3之間的變化發現 (圖2)，NNAT、PLAGL1 promoter甲基化水平在T1到T3之間表現出持續的增長；NAP1L5、IGF2Rpromoter甲基化水平在T1到T2之間增長，而在T2到T3之間下降；DIRAS3、IGF2、MEST、PEG10 promoter甲基化水平在T1到T2之間下降，在T2到T3之間增長。觀察4個印記基因gene body甲基化水平在T1、T2、T3之間的變化發現 (圖3)，IGF2R、MESTgene body甲基化水平在T1到T3之表現出持續的降低；PLAGL1、PEG10 gene body甲基化水平在T1到T2之間增長，在T2到T3之間下降。

圖2 八個豬印記基因Promoter的甲基化水平在性成熟前3個時間點間的變化Fig.2 The change of methylation levels of 8 porcine imprinted gene promoters during the three time points of prepuberty

圖3 4個豬印記基因Gene body的甲基化水平在性成熟前3個時間點間的變化Fig.3 The change of methylation levels of 4 porcine imprinted gene bodies during the three time points of prepuberty

3 討論

DNA甲基化是建立和維持基因組表觀遺傳狀態的基礎，也是基因組印記的關鍵機制[4]，被形象地比喻為基因表達的開關[10]。在哺乳動物中，通常認為promoter區域的甲基化抑制基因表達[11]，而發生在gene body區域的甲基化作用則較為復雜，但有研究認為其對基因表達有一定的正向作用[12]。印記基因在哺乳動物胚胎發育以及細胞增殖過程中發揮著重要的作用，研究顯示印記基因表達具有一定的時空特異性[13-14]，進而調控器官發育。盡管目前已有大量文獻報道印記基因方面的研究[15]，但多圍繞人和小鼠，著重印記基因與胚胎發育的關系，而對豬已知的印記基因與睪丸發育之間的關系鮮有報道，在性成熟前豬睪丸中的研究則更是空白。本試驗在通過MeDIP-seq建立性成熟前豬睪丸全基因組DNA甲基化圖譜的基礎上，從中分析得到了已知的8個豬印記基因，DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10、PLAGL1的甲基化狀態，這8個基因在性成熟前豬睪丸組織中的甲基化水平均不高，呈現“非甲基化”或“部分甲基化”，提示這8個印記基因在睪丸發育過程中均具有一定活性。此外，根據“營養沖突學說”，父源表達的印記基因促進生長，而母源表達的基因抑制生長[16]，這8個印記基因除DIRAS3和IGF2R外，均為母系印記、父源表達，這也提示上述印記基因在性成熟前豬睪丸的發育過程中可能發揮一定的調控作用。此外，在本研究構建的全基因組DNA甲基化圖譜中只比對到了IGF2R、MEST、PEG10及PLAGL14這4個基因的gene body甲基化狀態，比較這4個基因promoter和gene body區域甲基化狀態的差異，我們發現除MEST基因gene body甲基化水平略低于promoter，其他3個基因gene body甲基化水平均高于promoter (表3、圖2、圖3)。上述結果印證了功能基因的promoter區域大多維持在較低的甲基化水平[11]；而gene body相較于promoter具有更高的甲基化水平，則可能表明gene body較高的甲基化狀態更支持基因的表達。

NNAT、PLAGL1 promoter的甲基化水平在1～3月齡間增長 (圖2)。NNAT編碼的蛋白在腦發育及神經系統結構的形成和維持中發揮重要作用[17]，但它與睪丸發育之間的關系未見報道，在本研究中同其他基因相比，其promoter甲基化水平相對較高。PLAGL1可以誘導細胞周期阻滯和細胞凋亡，是腫瘤抑制基因[18]。在小鼠中，PLAGL1上游有一個差異甲基化CpG島，可能是該基因的印記控制中心 (ICR)，該ICR在精子中處于非甲基化狀態而在卵子中甲基化[19]。在本研究中發現PLAGL1 promoter甲基化在1月齡“非甲基化”，在2、3月齡“部分甲基化”，但總的來看甲基化水平低；此外還發現PLAGL1 gene body表現“部分甲基化”狀態，其甲基化水平略高于promoter甲基化水平，以上結果提示在豬中，PLAGL1的ICR可能也位于該基因上游。

NAP1L5、IGF2Rpromoter甲基化水平在1～2月齡下降，在2～3月齡增長 (圖2)。NAP1L5的具體功能尚不明確，但其編碼蛋白與核小體組裝蛋白具有同源性，且可能含有組蛋白結合位點[20]。研究顯示IGF2R在豬中為父系印記、母源表達[21]，但根據印記基因數據庫收錄信息來看，IGF2R在豬中表現為逃脫印記。IGF2R是腫瘤抑制基因，編碼清道夫受體，調控IGF2的生物活性，并對IGF起負反饋調節[21]。在小鼠中，IGF2R也為父系印記，其可能的印記機制是IGF2R第二個內含子中的CpG島在卵子上甲基化而在精子上無甲基化[22]。在本研究中，IGR2Rgene body表現“部分甲基化”狀態，且其甲基化水平高于promoter的甲基化水平，其可能產生的具體影響有待進一步的探究。

DIRAS3、IGF2、MEST、PEG10 promoter甲基化水平在1～2月齡增長，在2～3月齡下降 (圖2)。DIRAS3在印記基因數據庫中收錄為表達兩個親源等位基因，但有研究表明其在豬中為母系印記[23]。DIRAS3是腫瘤抑制基因，不僅抑制生長，而且降低繁殖功能[24]。盡管DIRAS3 promoter甲基化為“部分甲基化”狀態，但整體來看其甲基化水平是8個基因中最高的，提示該基因的功能在性成熟前豬睪丸發育中可能受到抑制。此外，有研究發現DIRAS3基因在成年豬睪丸組織中表現為非甲基化[25]，而在本研究中DIRAS3在性成熟前豬睪丸組織中甲基化水平較高，這就表明DIRAS3在豬睪丸發育中過程中可能呈現去甲基化的趨勢，且在性成熟后的豬睪丸中發揮一定的生理功能。MEST與腦的發育以及母性行為有關，且在雄激素豐富的組織中表達量非常高[26]。睪丸是產生雄激素的主要器官，MESTpromoter甲基化水平在1到2月齡間上升，到3月齡時又下降，這可能與睪丸間質細胞的增殖階段有關。睪丸間質細胞負責合成并分泌睪酮，其增殖高峰分別在1月齡和3月齡左右出現[27]，這就與MESTpromoter甲基化水平的變化相吻合。1～2月齡間質細胞增殖速度降低，產生的睪酮減少，MEST表達可能降低，其promoter甲基化水平相對增長；同理，到3月齡間質細胞又進入增殖高峰，MESTpromoter甲基化水平也就相對下降。此外，MESTgene body為“非甲基化”狀態，且甲基化水平呈下降趨勢，提示其gene body的“非甲基化”可能與該基因的表達相關。IGF2在豬中具有部分印記效應，是調控豬脂肪沉積的主要因子之一，PEG10主要調控胎盤的發育，但它們與睪丸發育之間的關系尚不明確[28]。

綜上所述，本研究對性成熟前豬睪丸組織中DIRAS3、IGF2、IGF2R、MEST、NAP1L5、NNAT、PEG10、PLAGL1這8個印記基因的甲基化狀態及在該發育階段甲基化水平的變化特征進行了檢測和分析。結果顯示，8個印記基因甲基化水平均不高，且在1、2、3月齡之間甲基化水平均有一定的變化，提示印記基因甲基化狀態可能對性成熟前豬睪丸發育有一定的調控作用，但其調控的具體機制以及DNA甲基化在該發育階段對印記基因表達產生的具體影響仍有待進一步的研究。

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(責任編輯 張 韻)

DNA methylation status of imprinted genes in prepubertal porcine testis

CHEN Xi， YANG Fang， LI Jie， BAI Lipeng， LI Danting， CAO Suizhong， SHEN Liuhong， YU Shumin*

(CollegeofVeterinaryMedicine，SichuanAgriculturalUniversity，Chengdu611130，China)

To determine the DNA methylation status of imprinted genes in the prepubertal porcine testis， we chose the testis tissues of 1， 2 and 3 months old pigs， and detected the methylation levels of eight imprinted porcine genes on the basis of the genome-wide DNA methylation profile of prepubertal porcine testis， using the method of MeDIP-seq. The results demonstrated thatDIRAS3，IGF2，IGF2R，MEST，NAP1L5，NNAT，PEG10 andPLAGL1， all these eight imprinted genes showed low methylation levels with “unmethylated” or “partially methylated” status. The methylation levels ofNNATandPLAGL1 promoters increased from one month old (T1) to three months old (T3); the methylation levels ofNAP1L5 andIGF2Rpromoters decreased from T1 to two months old (T2) but increased from T2 to T3; while the methylation levels ofDIRAS3，IGF2，MESTandPEG10 promoters increased from T1 to T2 but decreased from T2 to T3. Besides， we only aligned 4 gene bodies from the methylation profile， and the methylation levels ofIGF2RandMESTgene bodies decreased from T1 to T3， while the methylation levels ofPLAGL1 andPEG10 gene bodies increased from T1 to T2 but decreased from T2 to T3. It can be postulated from the results that these eight imprinted genes may be active during the development of prepubertal porcine testis， and DNA methylation may play a role in regulation of imprinted genes.

DNA methylation; imprinted genes; testis; pigs; prepuberty

http://www.zjnyxb.cn陳曦，楊芳，李捷，等. 性成熟前豬睪丸組織中印記基因DNA甲基化狀態分析[J].浙江農業學報，2017，29(5): 722-728.

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.06

2017-01-21

國家自然科學基金 (31172379)

陳曦(1993—)，女，四川遂寧人，碩士，研究方向為動物生殖內分泌與細胞工程。E-mail: chenxi1313@foxmail.com

*通信作者，余樹民，E-mail: yayushumin@163.com

S828.3

A

1004-1524(2017)05-0722-07

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 722-728