利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯水稻基因

原文霞，王栩鳴，李冬月，3，周 潔，嚴成其，*，陳劍平，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江省有害生物防控國家重點實驗室培育基地，農業部植保生物技術重點實驗室，浙江省植物病毒重點實驗室，浙江 杭州310021； 3.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201)

利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯水稻基因

原文霞1，2，王栩鳴2，李冬月2，3，周 潔2，嚴成其1，2，*，陳劍平1，2，*

(1.浙江師范大學 化學與生命科學學院，浙江 金華321004； 2.浙江省農業科學院 病毒學與生物技術研究所，浙江省有害生物防控國家重點實驗室培育基地，農業部植保生物技術重點實驗室，浙江省植物病毒重點實驗室，浙江 杭州310021； 3.云南農業大學 植物保護學院，云南 昆明 650201)

以現有水稻CRISPR/Cas9載體系統為起點，優化改造了相應的載體及其構建方法，實現了兩步法構建基因敲除載體。利用新的載體和方法，針對水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)D3基因的3個靶向位點分別構建了相應的CRISPR/Cas9載體，并通過農桿菌介導的遺傳轉化成功獲得一系列轉基因植株。T0代轉基因植株靶位點測序結果顯示，靶位點DDRC1包括5種突變類型，植株的突變率為35.48%；靶位點DDRC2包括5種突變類型，植株的突變率為25.00%；靶位點DDRC3包括1種突變類型，植株的突變率為20.00%。利用T1代純合突變植株，進一步研究了所得純合突變體的株高、分蘗數表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關系，探討了CRISPR/Cas9系統的基因編輯效率、位置效應和突變類型等特點，為進一步利用CRISPR/Cas9系統發展具有不同農藝性狀的水稻種質材料提供了參考。

水稻；CRISPR/Cas9；D3基因；基因編輯

對于植物基因功能特征和農作物的遺傳改良研究來講，基因編輯技術(genome editing)是一項具有非常誘人前景的技術[1]。為提高動植物基因編輯的效率，研究人員開發了人工核酸內切酶(engineered endonuclease，EEN)，EEN可以在DNA靶位點處產生DNA雙鏈斷裂(double strand breaks，DSBs)，它通過控制DNA的修復途徑實現對基因組的定點編輯，DNA 損傷后產生的DSBs能夠激活細胞內固有的修復機制非同源末端連接(non-homologous ending-joining，NHEJ)或同源重組(homologous recombination，HR)，該修復機制可以對損傷的DNA 進行修復[2]，從而實現對基因組的定點編輯。兩種最常見的人工核酸內切酶是鋅指核酸內切酶(zinc finger endonuclease，ZFN)和類轉錄激活因子效應物核酸酶(transcription activator-like effector nucleases，TALEN)，二者都成功地在多個物種上實現了打靶。無論是ZFN還是TALEN，都能夠精確地調控靶基因的表達，但是，這些技術實驗周期長，并且對實驗室的技術有較高要求[3-4]。2013年初，出現了一種新型的人工核酸內切酶clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated(Cas)9系統，該系統主要依據細菌的一種獲得性免疫系統改造而成[5]。CRISPR/Cas系統因其操作技術要求簡單、專一性好、基因定點突變效率高，目前已經獲得了廣泛的研究，并被成功運用于如擬南芥、煙草、番茄、小麥和玉米等多種物種的基因編輯中[6-9]。

依據其結構特點，CRISPR/Cas系統可以分為3大類型(Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型系統)。三者的共同特點是，由RNA介導的核酸酶可以特異性地切割外源入侵的DNA，包括噬菌體和質粒DNA[10]。其中，Ⅱ型CRISPR/Cas系統由于結構簡單，目前被廣泛應用于真核細胞的基因組編輯研究中。在該系統中，由單一的蛋白Cas9、crRNA、tracrRNA形成RNA-蛋白復合物，該復合物執行對外源DNA進行有效識別和切割特定位點的功能[11]。CRISPR/Cas9的剪切位點位于crRNA互補序列下游鄰近的PAM區(protospacer-adjacent motif，PAM)的5′-G-N19-NGG-3′特征區域的NGG位點，這種特征的序列在每128 bp的隨機DNA序列中就重復出現一次[12]。

近幾年，CRISPR/Cas9技術在水稻基因功能研究方面也有長足的發展，目前在全球范圍內，CRISPR/Cas9技術在水稻中的運用主要聚焦于基因功能研究。雖然從技術上講，采用CRISPR/Cas9技術編輯水稻基因組改變水稻各種農藝性狀已不再具有不可逾越的障礙，但是目前對CRISPR/Cas9系統在水稻育種中的實用化研究還處于起步階段，相關的研究也比較少。為實現從基礎研究到生產應用的銜接，為水稻育種實踐提供更直接的助力，充分了解CRISPR/Cas9基因編輯技術的特性顯然已成為當前亟待解決的重要課題。本研究以現有CRISPR/Cas9載體系統[13]為起點，優化改造了CRISPR/Cas9載體的構建方法，并采用改造后的載體對水稻日本晴(OryzasativaL.spp.Japonicacv. Nipponbare)的D3基因[14-18]進行了基因編輯研究。通過分析所得突變體的株高、分蘗數表型與CRISPR/Cas9編輯后基因型之間的關系，探討了CRISPR/Cas9系統的基因編輯效率、位置效應和突變類型等特點，為進一步利用CRISPR/Cas9系統發展具有不同農藝性狀的水稻種質材料奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

大腸埃希菌菌株(Escherichiacoli， DH5α)，根瘤農桿菌菌株(Agrobacteriumtumefaciens， EHA105)，水稻品種日本晴(OryzasativaL. ssp.Japonicacv. Nipponbare)均由本實驗室保存。本研究中所用的pOsU6-SK和p35s-Cas9-SK基礎載體由美國加州大學朱健康教授提供。雙元載體骨架為pCAMBIA1300，由澳大利亞CAMBIA實驗室惠贈。其他市售試劑包括Klenow fragment (NEB，Beverly，MA)、Phusion DNA polymerase (NEB，Beverly，MA)、TRIzol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA)、質粒提取試劑盒(Promega，Madison，USA)、ccdBr2感受態細胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)。研究所用其他限制性內切酶均采用NEB(北京)公司產品。研究中所用引物由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成，相關測序工作由鉑尚生物技術(杭州)有限公司完成。

1.2 實驗方法

1.2.1 大腸埃希菌感受態的制備與轉化

本研究所用大腸埃希菌DH5α熱擊感受態細胞的制備，轉化均按Innova法操作[19]。

1.2.2 農桿菌感受態的制備

本研究所用農桿菌感受態細胞由實驗室自行制備，步驟如下：取25 μL農桿菌菌液接種于5 mL YEP/Str+液體培養基中(含鏈霉素50 μg·mL-1)，28 ℃，230 r·min-1培養過夜；取1 mL新鮮菌液接種至200 mL YEP/Str+液體培養基中，28 ℃，230 r·min-1培養至D600≈0.6；然后于4 ℃ 4 000 r·min-1條件下離心10 min；棄去上清，沉淀采用20 mL新鮮配制并經冰浴的HEPES(1 mmol·L-1，pH 7.0)重懸；重復以上離心重懸清洗步驟2～3次后，用8 mL冰浴的10%甘油重懸；最后將其分裝到1.5 mL離心管中，每管分裝100 μL，置于液氮中速凍，-80 ℃凍存備用。

1.2.3 CRISPR/Cas9載體優化

為了提高載體構建效率，實現兩步法構建CRISPR/Cas9載體，我們對朱健康教授實驗室提供的載體進行了優化。首先以pX2E載體(基于Gateway技術的低成本植物雙分子熒光互補分析系統)為模板，采用FastCas-F1、FastCas-R1擴增了包含氯霉素抗性基因和ccdB自殺基因的片段；然后，以此PCR產物為模板，再用FastCas-F2、FastCas-R2擴增引入了BaeⅠ酶切位點。在片段擴增的同時，我們采用BbsⅠ內切酶對pOsU6-SK載體進行酶切，并用Klenow fragment對酶切后的產物進行補平，獲得的線性化平末端載體與包含氯霉素抗性基因和ccdB自殺基因片段的PCR產物相連接。此后，按文獻[13]步驟，采用KpnⅠ-Hind Ⅲ對獲得的質粒進行酶切，得到的產物與Hind Ⅲ-EcoR Ⅰ酶切的p35-Cas9-SK載體及KpnⅠ-EcoRⅠ雙酶切后的pCAMBIA1300載體進行三片段連接。連接產物采用熱擊轉化的方法轉入ccdBr2感受態細胞，轉化流程按Invitrogen公司手冊進行。整體改造流程如圖1-A所示，相關引物見表1，最終獲得CRISPR/Cas9載體命名為pOsFastCas9，其T-DNA邊界內功能區結構如圖1-B所示。

1.2.4 靶位點選擇及引物設計

從網站NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上獲得水稻日本晴D3(Os06g0154200)基因序列，并在序列中尋找Cas9潛在靶向位點，即符合5′-GN19NGG-3′的序列，根據靶位點的位置及GC含量，篩選D3基因序列12、1 445、2 068 bp處的NGG前20 bp作為3個靶向序列，分別命名為DDRC1、DDRC2、DDRC3。以篩選到的靶向核苷酸序列5′-GN19NGG-3′中NGG前的20 bp為基礎，按照5′-GN19GTTTT-3′，3′-ACACACN19-5′的模板編輯正向和反向引物，使引物經退火后能夠形成如圖2所示的結構，具體引物信息如表2。

1.2.5 CRISPR/Cas9基因編輯載體構建

靶序列正反向引物經退火(95 ℃，3 min；22 ℃，1 min，降溫速率，0.1 ℃·s-1；22 ℃，∞)生成接頭；將接頭產物與CRISPR/Cas9基因編輯載體BaeⅠ酶切產物用T4連接酶置于25 ℃反應2 h，獲得相應CRISPR/Cas9表達載體。取5 μL連接產物，轉化到大腸埃希菌熱激感受態DH5α中，涂布于LB/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，37 ℃培養箱倒置培養過夜，挑取克隆培養6～12 h，用載體上的通用引物M13-F與靶序列的下游引物DDRCN-R進行菌液PCR鑒定，陽性鑒定正確后，將菌液送鉑尚生物技術(杭州)有限公司測序(引物信息見表2)。

1.2.6 農桿菌的轉化及其介導的水稻日本晴遺傳轉化

將構建得到的CRISPR/Cas9表達載體的質粒DNA通過電擊轉入農桿菌菌株EHA105中。電擊轉化時將感受態細胞于冰上解凍，將2 μL純化過的質粒DNA加入感受態細胞，混勻后加入到預冷的電擊杯中，并采用Eppendorf Eporator電轉儀在12 500 V·cm-1電場電擊；電擊后迅速加入800 μL無抗生素的YEP培養液，并轉移至1.5 mL離心管中于28 ℃ 230 r·min-1振蕩培養；2 h后取100 μL菌液，涂布于YEP/K+平板上(含卡那霉素50 μg·mL-1)，28 ℃培養箱倒置培養24～48 h。挑取克隆培養6～12 h，用載體上的通用引物M13-F與靶序列的下游引物DDRCN-R進行菌液PCR鑒定，陽性鑒定正確后，再將農桿菌轉入日本晴的愈傷組織中，經遺傳轉化獲得相應的轉基因植株。

A，p35-Cas9-SK導入含氯霉素抗性基因和ccdB致死基因片段流程圖。Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；BbsI，BbsI內切酶；Klenow，DNA聚合酶Klenow片段；Ligation，T4 DNA連接酶介導的連接反應；BaeI，BaeI內切酶識別位點；FastCas-F1、FastCas-R1、FastCas-F2和FastCas-R2，擴增用的引物；B，pOsFastCas9載體T-DNA邊界內功能區結構。 T-Border(R) 和T-Border(L)，T-DNA邊界；OsU6-2 Promoter，水稻U6啟動子；BaeI Cuts，BaeI內切酶識別位點；Cm(R)，氯霉素抗性基因；ccdB，ccdB致死基因；Terminator T，終止子；gRNA，向導RNA序列；2×35S，2×35S啟動子；3×Flag，3×Flag標簽；NLS，核定位信號；Cas9，Cas9酶；NOS，NOS終止子；35S Promoter，35S啟動子；Hygromycin(R)，潮霉素抗性基因；35S PolyA，35S polyA終止子A， Flowchart of p35-Cas9-SK inserted chloramphenicol resistance genes and the lethal gene ccdB; Cm(R), the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene ccdB; BbsⅠ， the restriction enzymes of BbsⅠ; Klenow， DNA polymerase Klenow fragment; Ligation， the ligase chain reaction mediated by T4 DNA ligase; BaeⅠ， the recognition site of BaeⅠ; FastCas-F1， FastCas-R1， FastCas-F2 and FastCas-R2， the primers for amplificationB， Structure of T-DNA of pOsFastCas9vector between T-borders. T-Border(R) and T-Border(L)， the border of T-DNA; OsU6-2 Promoter， the U6 promoter of rice; BaeⅠ Cuts， the restriction enzymes of BaeⅠ; Cm(R)， the resistance genes of chloramphenicol; ccdB， the lethal gene of ccdB; Terminator T， the terminator; gRNA， the sequence of guide RNA; 2×35S， 2×35S promoter; 3×Flag， 3×Flag label; NLS， nuclear localization signal; Cas9， the enzyme of Cas9; NOS， the terminator of NOS; 35S Promoter， the promoter of 35S; Hygromycin(R)， the resistance genes of Hygromycin; 35S PolyA， the terminator of 35S polyA圖1 pOsFastCas9載體改造流程示意圖Fig.1 Schematic diagram of pOsFastCas9 construction workflow

表1 pOsFastCas9載體改造引物序列

Table 1 Nucleotide sequence of pOsFastCas9 vector transformation primer

名稱Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)FastCas?F1TTGGCAGCATCACCCGAFastCas?R1GCTGTGTATAAGGGAGFastCas?F2GAGGCAGCAGACACAGGTATCGCGATAGACGGGTAAGTTGGCAGCATCACFastCas?R2TGATAAGGAGACGGCCGTACCGTTGACCTGCAGACTGGCTGTGTATAAGG

圖2 粘性接頭結構圖Fig.2 Schematic diagram of linker

表2 靶向位點及對應引物核苷酸序列

Table 2 Nucleotide sequence of target site and the corresponding primer

名稱Name核苷酸序列Nucleotidesequence(5′→3′)DDRC1GGAGTAGACGTCGCCCATGGCGGDDRC2GTGCCATTTGCAACACTGCAGGGDDRC3GCGGGACATGCAGTTGCGGGAGGDDRC1?FGGAGTAGACGTCGCCCATGGGTTTTDDRC1?RCCATGGGCGACGTCTACTCCACACADDRC2?FGTGCCATTTGCAACACTGCAGTTTTDDRC2?RTGCAGTGTTGCAAATGGCACACACADDRC3?FGCGGGACATGCAGTTGCGGGGTTTTDDRC3?RCCCGCAACTGCATGTCCCGCACACAM13?FCGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC

“ ”表示PAM位點。

The underlined represents PAM site.

1.2.7 轉基因水稻植株突變體檢測

在靶序列上下游200 bp左右處設計正向引物與反向引物，作為鑒定是否發生突變的特異性引物，用于擴增包含靶序列在內的目的片段(引物具體信息如表3)。以粗提轉基因植株的總DNA為模板，用相應的特異性引物PCR擴增目的片段，將擴增產物送到鉑尚生物技術(杭州)有限公司進行測序，最終通過序列比對鑒定獲得的突變植株。

表3 測序引物核苷酸序列

Table 3 Nucleotide sequence of sequencing primer

名稱Name引物核苷酸序列Nucleotidesequenceofprimers(5′→3′)DDRC1?Seq?FAAGGGAGAGCTGTCGAGTATATCACDDRC1?Seq?RACCTCACGTCCGTCAGGAAGCTCAGDDRC2?Seq?FCCTACTCTCAAGGAAGTCACTGTCTDDRC2?Seq?RACCATAGGGAGAGTGACCTGAGCATDDRC3?Seq?FACTTTGTATGAATTGGACTACTGGCDDRC3?Seq?RTTTTGTGCCCACATAACTAATCATC

2 結果與分析

2.1 CRISPR/Cas9基因編輯載體構建

D3基因在根、葉片和花中顯著表達，并參與調控葉片衰老和細胞死亡過程，現有的研究顯示，其突變會導致分蘗增多，株高矮化等表型[14-18]。為分析CRISPR/Cas9基因編輯系統對基因功能的影響，我們選擇在該基因CDS的不同位置進行基因編輯。如圖3所示，D3基因包括4個外顯子，其CDS序列位于第1個外顯子上。篩選設計的三個靶位點均位于D3基因的CDS序列上，DDRC1位于CDS序列的12 bp處，DDRC2位于CDS序列1 445 bp處，DDRC3位于CDS序列的2 068 bp處。正向引物與反向引物通過退火生成粘性接頭，并與BaeⅠ酶切的線性CRISPR/Cas9基因編輯載體連接，測序結果表明D3基因的三個靶向序列DDRC1、DDRC2、DDRC3的CRISPR/Cas9基因編輯載體構建成功。

DDRC1、DDRC2、DDRC3為D3基因CDS序列上篩選設計的三個CRISPR/Cas9基因編輯載體作用的靶位點DDRC1， DDRC2， DDRC3: three CRISPR/Cas9 target sites in the CDS of D3 gene圖3 水稻D3基因結構及CRISPR/Cas9靶位點示意圖Fig.3 Schematic diagram of D3 gene structure and CRISPR/Cas9 target site

2.2 優化的CRISPR/Cas9載體能有效編輯水稻基因組

為了驗證構建的CRISPR/Cas9基因編輯載體能否有效對預設靶位點進行編輯，我們對野生型日本晴植株和轉基因T0代植株的基因靶序列進行了測序分析。測序結果顯示，T0代植株中檢測到了預期的突變。為精確分析突變類型，我們繁育了T1代轉基因材料。結合T0和T1代材料的測序數據，得出如下結果，DDRC1經遺傳轉化得到31株轉基因植株，經測序鑒定有11株植株的靶序列發生突變，突變率為35.48%，包括5種突變類型，突變方式Mutant1為缺失2個堿基(AT)，突變方式Mutant2為缺失1個堿基(A)，突變方式Mutant3為插入1個堿基(T)，突變方式Mutant4為插入1個堿基(G)，突變方式Mutant5為插入1個堿基(A)；DDRC2經遺傳轉化得到24株轉基因植株，經測序鑒定有6株植株的靶序列發生突變，突變率為25.00%，包括5種突變類型，突變方式Mutant1為缺失3個堿基(TTG)，突變方式Mutant2為缺失3個堿基(AGT)，突變方式Mutant3為缺失2個堿基(GT)，突變方式Mutant4為缺失2個堿基(TG)，突變方式Mutant5為缺失4個堿基(GTGT)；DDRC3經遺傳轉化得到10株轉基因植株，經測序鑒定有2株植株的靶序列發生突變，突變率為20.00%，包括1種突變類型，突變方式Mutant1為缺失8個堿基(CAGTTGCG)；總突變率為29.23%，共產生11種突變。具體突變方式如圖4所示。

在檢測突變類型的同時，我們還對CRISPR/Cas9基因編輯載體作用后產生的突變的遺傳特性進行了分析，經過對部分突變植株的T1代靶向序列進行分析，發現了純合突變植株，這說明變異可以穩定地遺傳到子代中。DDRC1中選取1種缺失突變(突變方式Mutant1)，命名為株系a；選取1種插入突變(突變方式Mutant3)，命名為株系b；DDRC2中選取1種缺失突變(突變方式Mutant2)，命名為株系c；DDRC3中選取1種缺失突變(突變方式Mutant1)，命名為株系d。這4個株系擴繁后，分別對各自得到的10株T1代植株進行突變檢測，結果顯示，株系a的10株T1代植株中有2株為純合突變，命名為a1、a2；株系b的10株T1植株中有1株為純合突變，命名為b1；株系c的10株T1植株中有1株為純合突變，命名為c1；株系d的10株T1植株中有2株為純合突變，命名為d1、d2；并且，T1代植株的突變方式與相對應的T0代突變方式相同，具體測序比對結果如圖5。

“ ”表示PAM位點，“-”表示堿基缺失突變，“+”表示堿基插入突變；A，DDRC1 T0代31株植株中有11株發生突變，包括5種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失2個堿基(AT)；Mutant2為缺失一個堿基(A)；Mutant3為插入1個堿基(T)；Mutant4為插入1個堿基(G)；Mutant5為插入1個堿基(A)。B，DDRC2 T0代24株植株中有6株發生突變，包括5種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失3個堿基(TTG)；Mutant2為缺失3個堿基(AGT)；Mutant3為缺失2個堿基(GT)；Mutant4為缺失2個堿基(TG)；Mutant5為缺失4個堿基(GTGT)。C，DDRC3 T0代10株植株中有2株發生突變，包括1種突變類型。WT為靶向的野生型水稻D3的基因序列；Mutant1為缺失8個堿基(CAGTTGCG)“_”， PAM site; “-”， base deletion ; “+”， base insertion; A， 11 mutations were identified in 31 transgenic plants of DDRC1， including 5 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 2 bases deleted (AT); Mutant2, 1 base deleted (A); Mutant3, 1 base inserted (T); Mutant4, 1 base inserted (G); Mutant5, 1 base inserted (A). B， 6 mutations were identified in 24 transgenic plants of DDRC2， including 4 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 3 bases deleted (TTG); Mutant2, 3 bases deleted (AGT); Mutant3, 2 bases deleted (GT); Mutant4, 2 bases deleted (TG); Mutant5, 4 bases deleted (GTGT). C， Two mutations were identified in 10 transgenic plants of DDRC3， including 1 mutation type; WT, the sequence of D3 in wild rice; Mutant1, 8 bases(CAGTTGCG) deleted圖4 T0代轉基因植株具體突變類型Fig.4 The mutation type of T0 transgenic lines

A為株系a，DDRC1(Mutant1)純合突變植株a1和a2的測序結果；B為株系b，DDRC1(Mutant3)純合突變植株b1的測序結果；C為株系c，DDRC2(Mutant2)純合突變植株c1的測序結果；D為株系d，DDRC3(Mutant1)純合突變植株d1和d2的測序結果A， the sequencing result of the homozygous mutant plants a1and a2 of the DDRC1(Mutant1); B， the sequencing result of the homozygous mutant plant b1 of DDRC1(Mutant3); C， the sequencing result of the homozygous mutant plant c1 of DDRC2(Mutant2); D， the sequencing result of the homozygous mutant plants d1and d2 of DDRC3(Mutant1)圖5 T1代轉基因植株的測序結果Fig.5 The sequencing results of T1 transgenic lines

2.3 轉基因水稻突變體植株表型鑒定

如表4與圖6所示，3周齡T1代純合突變植株中，a1和a2對應的靶位點為DDRC1，突變方式為缺失2個堿基(AT)，與野生型日本晴相比，株高及分蘗數沒有明顯變化；b1對應的靶位點為DDRC1，突變方式為插入一個堿基(T)，與野生型日本晴相比，也無明顯的表型差異；c1對應的靶位點為DDRC2，突變方式為缺失3個堿基(AGT)，與野生型日本晴相比，也無明顯的表型差異；d1和d2對應的靶位點為DDRC3，突變方式為缺失8個堿基(CAGTTGCG)，與野生型日本晴相比，株高明顯變矮，分蘗數增多。3周齡T1代純合突變植株中，只有靶向位點DDRC3的純合突變植株表型有明顯變化，靶向位點DDRC1 與DDRC2的純合突變植株表型沒有明顯變化，推測其可能與靶位點的位置及其突變方式有關系。T1代純合突變植株a1、a2、b1的缺失或者插入突變破壞了CDS序列的起始密碼子ATG，但在序列分析中我們發現，靶位點DDRC1下游135 bp處有還存在一個ATG序列，這個ATG序列可能替代上游的ATG位點重新起始了基因的表達。由于新的表達框只導致基因5’部分缺失，很可能對基因功能只產生了較小的影響，因而沒有產生明顯的表型變化。而T1代純合突變植株c1缺失的3個堿基(AGT)位于D3基因CDS序列的1 441～1 443 bp處，引起了一個三聯密碼子的缺失，對應的氨基酸殘基缺失很可能不能顯著影響基因的功能，因此突變體的表型也沒有受到明顯的影響。DDRC3位點上的突變體d1和d2產生明顯的形態變化，則表明較長的片段缺失能夠更有效地改變基因功能，從而影響植物的表型。這些發現，提示我們在對單個基因功能進行研究時，如果僅產生一種類型的突變，有可能無法確定基因的功能，需要通過獲得多種類型的突變，來相互印證以確保基因功能分析的準確性。而在突變類型的選擇上，要盡可能避免選擇少量缺失或變化較小的突變類型。

表4 T1代純合突變植株的突變方式及其表型對應表

Table 4 The corresponding table of genotype and phenotype of T1homozygous mutants

純合突變植株名稱Homozygousmutantplantsname靶點位置Targetposition突變方式Mutationpattern與野生型日本晴相比株高變化Heightchangecomparedwithwildtype與野生型日本晴相比分蘗數變化Tillernumberchangecomparedwithwildtypea1DDRC1缺失兩個堿基Twobasesdeleted(AT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangea2DDRC1缺失兩個堿基Twobasesdeleted(AT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangeb1DDRC1插入一個堿基onebaseinserted(T)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochangec1DDRC2缺失三個堿基Threebasesdeleted(AGT)無明顯變化Nosignificantchange無變化Nochanged1DDRC3缺失八個堿基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)較矮Shorter增多Increasedd2DDRC3缺失八個堿基Eightbasesdeleted(CAGTTGCG)較矮Shorter增多Increased

A、B、C和D中的植株a1、a2、b1、c1與野生型日本晴wt相比，表型沒有明顯變化；E和F中的植株d1、d2與野生型日本晴wt相比，表型變化明顯，株高變矮，分蘗數增多A， B， C and D， the phenotype of the plant (a1， a2， b1 and c1) did not change significantly compared with wild type; E and F， the phenotype of the plant (d1 and d2) changed significantly compared with wild type， the plant height became shorter， and the tiller number became more圖6 T1代轉基因植株的表型Fig.6 The phenotype of T1 transgenic plants

3 討論

水稻新品種培育的基礎在于現有優質種質資源，而其成功的關鍵在于準確選擇合適的基因進行改造。植物生長發育、抵御不良環境和抗病防衛反應中同時存在著正向和負向調控基因，因此可以考慮通過導入正向調控基因或敲除負向調控基因來實現水稻抗病性的提升。根據目前的技術水平，CRISPR/Cas9在水稻中的基因敲除效率比基于該技術的基因敲入/替換效率要高得多[20]。因此，選擇水稻特定的調控基因進行定點敲除，顯然是目前最為簡潔有效的策略。

本研究結果表明，CRISPR/Cas9基因編輯技術能以較高效率成功編輯水稻靶向DNA 序列，同時靶向編輯效率受靶向位置影響。并且，同一靶向位點，可以產生多種突變方式，靶位點PAM前發生堿基缺失或者插入，發生堿基缺失占總突變的比例為72.23%。此外，我們還發現CRISPR/Cas9基因編輯載體靶向的基因序列的位置的不同，導致純合突變體植株呈現出的表型也不盡相同。由以上結果可見，基于CRISPR/Cas9基因編輯技術發展的遺傳材料往往存在不同的突變方式，能為進一步研究提供豐富的遺傳材料。值得注意的是，CRISPR/Cas9獲得的材料中有部分有明確的基因型突變，但是卻無明顯的表型差異。這一現象提示我們利用CRISPR/Cas9技術，不僅能發展基因功能研究的基礎材料，同時也具有重大的應用價值。以水稻抗病育種為例，水稻基因組中存在大量抗病負調控基因，如pi21、OsWAK112d、Ob-fold等基因[21-24]均為稻瘟病的負向調控基因，根據現有的研究結果，定向地編輯這些基因，使得這些基因功能缺失或改變將有助于水稻抗病性的提升。此外，從我們的研究可以看出，針對同一基因，不僅不同位點的編輯會產生不同的效果，即便是同一位點的編輯也能產生不同的突變類型。因此，基于現有的優良種質針對這些靶位點進行改造，顯然能夠幫助我們以相當高的效率衍生出一系列綜合性狀優良，同時兼具不同特性的新種質，從而加快水稻抗病育種進程。

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(責任編輯 張 韻)

Application of the technology of CRISPR/Cas9 edit rice gene

YUAN Wenxia1，2， WANG Xuming2， LI Dongyue2，3， ZHOU Jie2， YAN Chengqi1，2，*， CHEN Jianping1，2，*

(1.CollegeofChemistryandLifeSciences，ZhejiangNormalUniversity，Jinhua321004，China；2.StateKeyLaboratoryBreedingBaseforZhejiangSustainablePestandDiseaseControl，MOAKeyLaboratoryforPlantProtectionandBiotechnology，ZhejiangProvincialKeyLaboratoryofVirology，InstituteofVirologyandBiotechnology，ZhejiangAcademyofAgriculturalSciences，Hangzhou310021，China; 3.CollegeofPlantProtection，YunnanAgriculturalUniversity，Kunming650201，China)

In this study， the CRISPR/Cas9 vector system was optimized in order to construct gene editing constructors in two steps. With optimized CRISPR/Cas9 system， three genome editing constructors targeting different sites ofD3 gene in rice (OryzasativaL. spp.Japonicacv. Nipponbare) were generated， and the transgenic plants were successfully produced byAgrobacterium-mediated transformation. The sequencing results of T0transgenic plants showed that the mutation rate of target site DDRC1 was 35.48%， and five mutation types were detected; the mutation rate of target site DDRC2 was 25.00%， and also with five mutation types; the mutation rate of target site DDRC3 was 20.00%， and only one mutation type was detected. The phenotype， height and tiller number， together with the genotypes of homozygous mutants were investigated， and the gene editing efficiency of the optimized CRISPR/Cas9 system along with the position effect and mutation patterns were also analyzed and discussed. In summary， the findings in this research provided important information for further developing and utilizing of rice germplasm on variety agronomic trait with the optimized CRISPR/Cas9 system.

rice; CRISPR/Cas9;D3 gene; gene editing

http://www.zjnyxb.cn

10.3969/j.issn.1004-1524.2017.05.01

2017-03-09

國家重點研發計劃(2016YFD0100601，2016YFD0200804)；浙江省自然基金(2014C140001，2016C110017)

原文霞(1990—)，女，山西汾陽人，碩士研究生，主要從事植物病理學研究。E-mail: yuanwenxia5@163.com

*通信作者，嚴成其，E-mail: yanchengqi@163.com；陳劍平，E-mail: jpchen2001@126.com

S511；Q789

A

1004-1524(2017)05-0685-09

浙江農業學報ActaAgriculturaeZhejiangensis， 2017，29(5): 685-693

原文霞，王栩鳴，李冬月，等. 利用CRISPR/Cas9技術靶向編輯水稻基因[J].浙江農業學報，2017，29(5)： 685-693.