UPLC-MS/MS同時測定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁的含量

于暢游 田冬梅 婁志紅

（黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150088）

UPLC-MS/MS同時測定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁的含量

于暢游 田冬梅 婁志紅*

（黑龍江省食品藥品檢驗檢測所，哈爾濱 150088）

建立了超高效液相-質譜聯用（UPLC-MS/MS）法同時測定藥用植物皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁含量的分析方法。優化的分析條件為：流動相：甲醇-水溶液（42∶58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。采用電噴霧離子源進行電離，多離子反應監測（MRM）模式進行信號采集，采用外標法進行定量，結果表明，在不同檢測范圍內各目標化合物線性關系良好（R2>0.9997）。同時，應用建立的方法對比分析了4種目標化合物在皂角果莢和皂角刺兩個部位的含量水平。

超高效液相色譜-串聯質譜法(UPLC-MS/MS)；皂角；槲皮苷；槲皮素；山柰酚；蘆丁

皂角（Gleditsia sinensis）為豆科皂莢屬落葉喬木，是我國特有的樹種之一[1]。皂角的種子和皂角刺等諸多部位均可入藥，具有抗菌抗炎、免疫調節與抗過敏、抗腫瘤等作用[2-6]。研究表明，皂角含有的槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁是皂角中常見的活性成分[7-8]。為更加快速高效檢測分析皂角活性成分的水平，本研究應用超高速液相色譜-質譜聯用儀（UPLC-MS/MS）建立了同時測定皂角中槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁含量的分析方法，同時應用所建立的方法對比分析了上述4種目標化合物在皂角果莢和皂角刺兩個部位的含量水平，為進一步開發利用皂角的藥用價值提供了理論和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

皂角刺及皂角果莢于2017年1月采自于黑龍江省哈爾濱市東北林業大學實驗林場(45°73′N, 126°56′E)，實驗前將皂角刺及果莢分別用粉碎機粉碎，粉末過20目篩備用；槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁（純度均≥98%）標準品購于中國藥品生物制品檢定所；色譜甲醇、乙腈購于北京百靈威公司；色譜甲酸購于美國Sigma公司；去離子水使用超純水儀自制。

1.2 儀器與設備

Qtrap 5500質譜儀（美國AB公司）；色譜儀選用日本沃特斯的超高效液相色譜儀，使用LC-20AD泵，溫度控制器，柱溫箱，SIL-20A自動進樣器；FZ-06中藥粉碎機（浙江溫嶺市百樂粉碎設備廠）；250DC型數控超聲波清洗器（江蘇昆山超聲儀器有限公司）；BS124S電子天平（德國Sartorius公司）；Millipore超純水儀（法國Millipore公司）。

1.3 方法

1.3.1 供試樣品溶液的制備

稱取皂角刺及果莢粉末各0.5g，加入甲醇20mL超聲提取（100 kHz，40℃）30 min，過濾后將殘渣再加入20 mL溶劑超聲提取30 min，過濾后將兩次濾液合并，測定前用0.45 μm的微孔濾膜過濾。

1.3.2 標準品溶液的制備

分別稱取適量標準品用色譜甲醇溶解、定容，配制成1 mg/mL的標準品溶液，存于4℃冰箱中備用，使用前根據需要用流動相配制成標準工作液。

1.3.3 UPLC-MS/MS方法

1.3.3.1 色譜條件

色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18 Column (1.7 μm,2.1 mm×50 mm)；流動相：甲醇-水溶液（42:58，V/V）；流速：0.25 mL/min；柱溫：25℃；進樣量：10 μL。

1.3.3.2 質譜條件

采用電噴霧離子源(electrosprayionization，ESI)，正離子掃描模式，多離子反應監測(multiple reaction monitoring，MRM)掃描方式[9]；錐孔電壓是3 kV；離子源霧化溫度5000℃；霧化氣25psi，氣簾氣15psi。

1.4 精密度及準確性考察

準確量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的標準品溶液，在同一天內重復進樣6次，計算日內精密度及準確性[10]。

1.5 標準曲線的繪制

將4種標準品溶液用流動相稀釋成不同濃度的工作液，按上述UPLC-MS/MS方法分別進行檢測，將標準品工作液濃度（x）與峰面積（y）進行線性回歸，得到回歸方程和相關系數（R2），確定線性范圍。

1.6 數據統計分析

相同提取條件下，每個樣品重復3次，實驗結果取平均值，采用SPSS 18.0對其做方差，SigmaPlot 10.0用于繪制數據圖像。

2 結果與討論

2.1 UPLC-MS/MS分析條件的優化

對比電噴霧離子源正、負離子掃描模式下槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁標準品的結果表明，目標化合物在正離子掃描模式下電離信號高于負離子掃描模式，因此采用正離子掃描模式對目標化合物進行質譜分析。通過對質譜條件的優化得出最優的質譜條件為：錐孔電壓是3 kV；離子源霧化溫度5 000℃；霧化氣25 psi，氣簾氣15 psi；4種具有藥用活性的化合物碎裂離子、去簇電壓、碰撞電壓、碰撞室射出電壓見表1。對超高效液相的流動相的組成和比例進行考察的結果表明，使用甲醇-水溶液作為流動相的組成時，靈敏度高且分離效果顯著，其中甲醇與水的比例為42∶58時，所測物質的出峰時間適中，分離效果好，峰形對稱。因此選擇甲醇-水溶液（42∶58，V/V）作為分離槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的流動相。

在各項質譜條件及參數優化完成后，應用最優的UPLC-MS/MS方法同時定量檢測目標化合物標準品的色譜圖（圖1），其中蘆丁的出峰時間為2.85 min、槲皮苷的出峰時間為4.01 min、槲皮素的出峰時間為5.05 min、山柰酚的出峰時間為5.75 min。

表1 4種目標化合物的質譜分析條件參數(正離子模式)

圖1 目標化合物標準品的UPLC-MS/MS色譜

2.2 分析方法的考察

準確量取含槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的標準品溶液連續進樣6次，計算精密度及準確性的結果（表2）表明，儀器的精密度及準確性良好。

表2 精密度、準確性實驗結果

2.3 標準曲線的繪制

按照上述分析方法的條件，取4種目標化合物的標準品溶液進行UPLC-MS/MS分析，將濃度和峰面積（3次平均值）進行線性回歸，并得到回歸方程和相關系數。由表3可知，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁分別在10～100 000、100～100 000、10～100 000、100～1 000 000 ng/mL范圍內線性關系良好，R2均>0.999 7，充分證明了所建立方法的靈敏度較高。

表3 回歸方程、相關系數及線性范圍(n=3)

2.4 皂角刺與果莢中目標化合物的含量

取1.3.1項所配制的樣品溶液，按照上述的實驗方法對皂角刺及皂角果莢進行UPLC-MS/MS分析，記錄峰面積，并由2.3中所得的回歸方程計算槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的含量。測定結果表明，皂角刺中，槲皮苷、槲皮素、山柰酚和蘆丁的含量分別為75.983、4.435、11.336、412.409 μ g/g；皂角果莢中4種目標化合物的含量分別為0.391、18.415、10.014、292.265 μ g/g。槲皮苷和蘆丁在皂角刺中的含量高于果莢中的含量，具有顯著性差異（p<0.05）；槲皮素在皂角刺中的含量低于果莢中的含量，具有顯著性差異（p<0.05）；山奈酚在皂角刺和果莢中的含量相近，無顯著差異。

3 結語

本實驗建立了UPLC-MS/MS法同時測定皂角槲皮苷、槲皮素、山柰酚、蘆丁含量的方法，經過方法學考察證明，此方法可以快速、靈敏地實現皂角中4種目標化合物的同步定量分析。同時，應用建立的方法對比分析了皂角刺及皂角果莢兩個部位4種目標化合物的含量水平，為皂角的綜合開發利用提供了科學依據。

［1］楊曉峪,李振麟,濮社班,等.皂角刺化學成分及藥理作用研究進展［J］.中國野生植物資源,2015,34(3):38-41.

［2］王瑩瑩,劉偉杰,杜鋼軍.皂角刺抗腫瘤的初步研究［J］.河南大學學報(醫學版),2014(2):88-90.

［3］曹冉冉.中藥材皂角刺有效成分分離及連翹品質資源研究［D］.河南科技大學,2015.

［4］Lu D,Xia Y,Tong B,et al.In vitro Anti-Angiogenesis Effects and Active Constituents of the Saponin Fraction From Gleditsia sinensis［J］.Integrative Cancer Therapies,2012,13(5):446.

［5］李崗,王召平,仙云霞,等.皂角刺中黃酮類成分及其抗腫瘤活性研究［J］.中草藥,2016,47(16):2 812-2 816.

［6］徐哲.皂角刺抗腫瘤活性成分與含量測定方法研究［M］.沈陽:沈陽藥科大學,2007.

［7］李榮,肖順漢,劉明華.皂角刺抗腫瘤作用研究新進展［J］.四川生理科學雜志,2009,31(1):29-31.

［8］李萬華,傅建熙,范代娣,等.皂角刺化學成分的研究［J］.陜西理工學院學報(社會科學版),1999(3):41-42.

［9］《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編彩色圖譜,(第二版)［M］.北京:人民衛生出版社,1996.

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第1作者簡介：于暢游（1983-），女，主管藥師，研究生，研究方向：食品、藥品、醫療器械等微生物檢驗。

Determination of Quercetin-3-O-rhamnoside、Quercetin、Kaempferol and Rutin of Gleditsia sinensis Harms by UPLC-MS/MS

YUChangyou
（Heilongjiang Institute for Food and Drug Control,Harbin150088）

In this study,we established an UPLC-MS/MS method for the simultaneous determination of quercetin,quercetin,kaempferol and rutin in Gleditsia sinensis.By investigation of chromatography and mass spectrometry methods,the optimum analytical conditions:Mobile phase of methanol-water solution (42∶58,V/V);flow rate,0.25 mL/min;column temperature,25℃;sample size,10 μL.Using electrospray ionization(ESI)ionization,multiple reaction monitoring(MRM)mode for signal acquisition,quantified using the external standard method.The result showed that the test at different concentration range was a great linear relationship(R2>0.9997).Using this method,we assayed and tested the contents of the involved four compounds in thorn and pod,showing high sensitivity,good selectivity and shorter analysis time.

UPLC-MS/MS;Gleditsia sinensis;Quercetin-3-O-rhamnoside;Quercetin;Kaempferol;Rutin

Q946.83+3,TH 843

A

婁志紅（1971-），女，主任藥師。

2017-01-20

（責任編輯：王岳）

1001-9499（2017）03-0049-03