不同脅迫溫度條件下壇紫菜中脂肪酸和揮發性物質分析

宋 悅，卓 馨，陳娟娟，駱其君，楊 銳，陳海敏，嚴小軍

（寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

不同脅迫溫度條件下壇紫菜中脂肪酸和揮發性物質分析

宋 悅，卓 馨，陳娟娟*，駱其君，楊 銳，陳海敏，嚴小軍

（寧波大學海洋學院，浙江 寧波 315211）

摘 要：為了解高溫脅迫條件下壇紫菜脂肪酸變化規律，采用氣相色譜-質譜聯用技術對不同脅迫溫度條件下的壇紫菜脂肪酸和揮發性物質進 行分析。結果顯示，以20 ℃為對照溫度，分別在25、28 ℃和35 ℃三個溫度脅迫后，壇紫菜中共鑒定出13 種總脂肪酸、14 種游離脂肪酸和32 種揮發性物質。當脅迫溫度升高至28 ℃時，飽和脂肪酸和揮發性物質含量隨脅迫溫度升高而增加，而不飽和脂肪酸和游離脂肪酸含量則隨脅迫溫度升高而降低；當脅迫溫度升高至35 ℃時，總脂肪酸、總游離不飽和脂肪酸和揮發性物質含量均隨脅迫溫度升高而降低。了解高溫脅迫條件下總脂肪酸、游離脂肪酸和揮發性物質之間的轉化，有助于了解壇紫菜抗高溫脅迫機理和壇紫菜的健康栽培。
關鍵詞：壇紫菜；高溫脅迫；脂肪酸；揮發性物質；氣相色譜-質譜法

壇紫菜（Pyropia haitanensis）是我國重要的經濟海藻，其年產量約占紫菜年總產量的75%[1-2]，由于生長在環境復雜的潮間帶，其生長常受到一些因素的影響，如溫度、光照、營養鹽和水流等，其中溫度是最主要的影響因素[3-4]。近幾年，在浙閩海區，每年10～11月會出現高溫回暖天氣，俗稱“小陽春”，此時養殖壇紫菜經常會出現大量爛菜現象，造成巨大損失[5]，因此亟需篩選具有耐高溫品系，了解壇紫菜抗高溫脅迫機制，是指導紫菜栽培生產及減災防病的當務之急。細胞膜系統，作為藻類對高溫脅迫的最初敏感器，在脅迫環境中不斷地調整脂質代謝以維持細胞膜的流動性、完整性和功能性，從而得以存活與生長[6-9]。高溫脅迫條件下，細胞膜受到損傷，活性氧的大量釋放打破脂肪酸與膜脂之間的平衡，脂肪酸鏈被不同程度的氧化，不飽和度、雙鍵位置及長度的變化都在不同程度地影響著細胞膜的功能和生物體的抗熱性[10-13]。低溫條件下的有機體傾向于產生更多的不飽和脂肪酸[14-15]，受到高溫脅迫后的有機體膜脂飽和脂肪酸含量增多，有助于增加細胞膜脂的變相溫度，通過提高細胞膜系統的穩定性來提高耐熱能力[16]。

某些揮發性物質被稱為揮發性氧化脂質，當藻類受到脅迫時，脂酶促進游離不飽和脂肪酸的釋放，進一步在脂氧合酶的作用下轉化得到，可以在藻類與環境、藻類與藻類之間進行信號傳遞，在保護藻類防御各種脅迫中有重要作用[17-19]。因此，研究高溫脅迫條件下壇紫菜的脂肪酸和揮發性物質的變化，對于了解壇紫菜的抗高溫脅迫機理，以及壇紫菜的健康養殖具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脂肪酸C19:0、正己烷、乙腈、五氟芐基溴（PFBBr）、N,N-二異丙基乙胺、丁羥甲苯（均為色譜純） 美國Sigma-Aldrich公司；甲醇、香草醛、碳酸鉀、乙酸乙酯、乙酰氯（均為分析純） 國藥集團化學試劑有限公司；甲酰氯（100 mL甲醇中加入10 mL乙酰氯）現配現用。

1.2 儀器與設備

QP 2010氣相色譜-質譜分析儀（配有AOC-20自動進樣器） 日本Shimadzu公司；SPB-50色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、Vocol色譜柱（60 m×0.32 mm，0.18 μm）、固相微萃取系統和75 μm二乙基苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/ carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭 美國Supelco公司；FreeZone冷凍干燥機 美國Labconco公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品前處理

2015年11月2日在寧波象山采集的浙東1號壇紫菜保存于－20 ℃冰箱。挑選健康壇紫菜，壇紫菜長度大約在15～20 mm之間，紫菜寬度在3～4 mm之間。于0.7% KI海水中消毒10 min后清洗2～3 次，滅菌海水中復蘇24 h，培養溫度為（19±1） ℃，光強為2 500～3 000 lx，光暗比為1∶1（12 h/12 h）。復蘇完成后取出分置于水溫為20、25、28、35 ℃的培養箱內熱激1 h，熱激完成的壇紫菜取出后加液氮于－80 ℃冰箱保存，冷凍干燥后液氮研磨成粉。

1.3.2 總脂肪酸分析

1.3.2.1 總脂肪酸提取

準確稱取干藻粉50 mg置于4 mL樣品瓶內，加入1 mL正己烷、1.5 mL甲酰氯和15 μg內標物C19:0。振蕩1 min，70 ℃水浴提取2 h，冷卻30 min至室溫，加2.5 mL 6% K2CO3溶液和1 mL正己烷。振蕩30 s，3 500 r/min離心5 min，上清液蒸干。按照上述前處理操作步驟，平行3 次，獲得3 個平行重復，且分別用1 mL正己烷復溶、離心和過膜，上機待測。每個平行樣品采用氣相色譜-質譜分析方法重復進樣兩針。

1.3.2.2 總脂肪酸氣相色譜-質譜分析

氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃；載氣為99.999%高純氦氣；柱流速0.81 cm3/min；柱前壓73.0 kPa；升溫程序：柱起始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持20 min；分流進樣，分流比為50∶1。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；選取全程離子碎片掃描模式；質量掃描范圍m/z 50～650；溶劑延遲時間3 min。

1.3.3 游離脂肪酸分析

1.3.3.1 游離脂肪酸提取

準確稱取干藻粉200 mg于50 mL離心管中，加入6 mL乙酸乙酯（50 mg/L丁羥甲苯），振蕩2 min，超聲5 min，于4 ℃搖1 h，10 000 r/min離心15 min，上清液轉至另一50 mL離心管中。固體殘渣加入4 mL乙酸乙酯，振蕩2 min，超聲5 min，10 000 r/min離心15 min，合并上清液于50 mL離心管中，加5 mL冰水，10 000 r/min離心15 min。取乙酸乙酯相于4 mL樣品瓶中，旋轉蒸干。

4 mL樣品瓶中加15 μL PFBBr、30 μL N-乙基二異丙胺、150 μL乙腈和20 μg C19:0，35 ℃水浴30 min，N2吹干。用0.5 mL正己烷復溶、離心和過膜，平行分析3 次。

1.3.3.2 游離脂肪酸氣相色譜-質譜分析

氣相色譜條件：進樣口溫度250 ℃；載氣為99.999%高純氦氣；柱流速0.62 cm3/min；柱前壓51.6 kPa；升溫程序：柱起始溫度150 ℃，保持3.5 min，以20 ℃/min升至200 ℃，保持5 min，再以5 ℃/min升至280 ℃，保持18 min；不分流進樣。

質譜條件：負化學離子源；離子源溫度200 ℃；接口溫度250 ℃；選取全掃描模式；質量掃描范圍m/z 50～750；溶劑延遲時間3 min。

1.3.4 揮發性物質分析

1.3.4.1 分析樣品預處理

稱取樣品0.3 g（鮮質量），液氮研磨成粉，加入15 mL頂空瓶中，再加入2 mL緩沖溶液A（50 mmol/LTris與20 mmol/L NaCl，加鹽酸調pH值至8.0）和內標香草醛0.6 mg，萃取頭氣相色譜進樣口老化30 min，40 ℃條件下頂空瓶中萃取50 min，室溫條件下萃取20 min，取出萃取頭立即插入210 ℃進樣口，脫吸附5 min，平行測定3 次。

1.3.4.2 揮發性物質氣相色譜-質譜分析

氣相色譜條件：進樣口溫度210 ℃；載氣為99.999%高純氦氣；柱流速1.99 cm3/min；柱前壓128.3 kPa；升溫程序：柱起始溫度35 ℃，保持3 min，以3 ℃/min升至40 ℃，保持1 min，再以5 ℃/min升至210 ℃，保持25 min；不分流進樣。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度200 ℃；接口溫度300 ℃；選取全掃描模式；質量掃描范圍m/z 40～1 000；溶劑延遲時間3 min。

2 結果與分析

2.1 脂肪酸和揮發性物質的定性定量方法建立

圖 1 壇紫菜中各組分的總離子流圖Fig. 1 Total ion current chromatograms of FAs and VOCs from P. haitanensis

以C19:0脂肪酸作為內標物，結合各個總脂肪酸的保留時間，并將其與C19:0脂肪酸的保留時間進行比較分析，得到的相對保留時間即為定性依據之一。此外，從圖1中獲得各個保留時間條件下色譜峰的質譜圖，并從各組分分子離子峰，確定各組分的分子質量，再根據各組分的離子碎片質量譜圖，通過NIST庫中的脂肪酸標準譜圖比較分析作為另一個定性依據。游離脂肪酸通過PFBBr衍生化法進行分析，是將游離脂肪酸與PFBBr進行酯化反應生成脂肪酸五氟苯甲酯[FA-PFBME]，五氟苯甲酯失去五氟苯甲基得到[M－PFB]－離子，它們為游離脂肪酸在負化學離子源質譜圖中豐度最高的離子，用于推測分子質量進行定性分析。由于總脂肪酸和游離脂肪酸的種類較多，因此采用的是相對定量分析方法，即通過加入C19:0脂肪酸標準物質作為定量內標，根據不同的C19:0峰面積繪制一條標準曲線，并利用該標準曲線和各組分的峰面積，由此計算出各組分在樣品中的含量。

揮發性物質的定性分析與脂肪酸類似，而其相對定量則依據內標香草醛來分析揮發性物質在樣品中的含量。

2.2 不同溫度脅迫條件下壇紫菜總脂肪酸含量變化

28 ℃為自然界壇紫菜能承受的最高溫度，而選擇35 ℃是為了短期內，使壇紫菜代謝物可瞬間改變，以便更好地了解熱激應答的代謝過程。選取20 ℃作為對照溫度，25、28 ℃和35 ℃三個溫度作為脅迫溫度，在高溫脅迫條件下，壇紫菜膜脂與脂肪酸之間的平衡被打破，脂肪酸的種類和含量發生有目的的改變，來參與脅迫防御。如圖2所示，對不同溫度脅迫條件下的壇紫菜進行總脂肪酸分析，共檢測到13 種脂肪酸，包括C14:0、C16:0、C16:1 n-7、C16:1 n-9、C18:0、C18:1 n-9、C18:1 n-11、C18:2、C20:1、C20:2、C20:4、C20:5和C22:1。其中，C16:0、C20:4和C20:5含量較高，在每克壇紫菜中分別為11.95、7.88 μmol和14.27 μmol，占了脂肪酸總含量的80.33%～83.95%。

不同溫度脅迫條件下，每種脂肪酸的變化不盡相同，因此對其進行分類分析。如圖2n、o所示，當脅迫溫度升至28 ℃時，飽和脂肪酸含量逐漸升高，當升至35 ℃時又出現明顯下降，而不飽和脂肪酸含量則隨著脅迫溫度的升高不斷下降。壇紫菜在高溫脅迫條件下會通過增加飽和脂肪酸的含量，增加細胞膜脂的變相溫度，提高細胞膜系統的穩定性來提高耐熱能力，所以當脅迫溫度升至28 ℃時，飽和脂肪酸含量升高。同時，壇紫菜在高溫脅迫條件下釋放大量活性氧，氧化膜脂并產生大量短鏈揮發性物質[10,20]。因此膜脂的不飽和脂肪酸鏈被大量存在的活性氧氧化，生成具有防御作用的氧化脂質，導致不飽和脂肪酸含量下降。但當刺激條件達到35 ℃脅迫1 h時，超出壇紫菜所能承受的最高溫度，細胞膜系統受到嚴重損傷，光合作用產生的能量不足以支撐自身的生長，脂肪酸被氧化代謝，而未得到及時補充，因此飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量均出現明顯下降。

圖 2 壇紫菜在不同脅迫溫度條件下的總脂肪酸含量變化Fig. 2 Changes in total fatty acids of P. haitanensis under heat stress at different temperatures for 1 h

2.3 不同溫度脅迫條件下壇紫菜游離脂肪酸含量變化

圖 3 壇紫菜在不同溫度條件下高溫脅迫1 h游離脂肪酸含量變化Fig. 3 Changes in free fatty acids of P. haitanensis after heat shock at different temperatures for 1 h

不同溫度脅迫條件下壇紫菜總脂肪酸分析發現，膜脂可能釋放脂肪酸參與脅迫防御，因此對應條件的游離脂肪酸分析必不可少。如圖3所示，對不同溫度脅迫條件下壇紫菜游離脂肪酸進行分析，共檢測到14 種游離脂肪酸，分別為C13:0、C14:0、C15:0、C16:0、C16:1、C18:0、C18:1（含2 種異構體）、C18:2、C20:1、C20:3、C20:4、C20:5和C22:1。其中C16:0、C20:4和C20:5含量較高，在每克壇紫菜中分別為0.45、0.46 μmol和0.89 μmol，占游離脂肪酸總含量的58.50%～70.20%。

不同溫度脅迫條件下每種游離脂肪酸的變化不盡相同，因此對其進行分類分析。當脅迫溫度升至25 ℃時，游離飽和脂肪酸的總含量幾乎無變化，而當溫度繼續升高時其含量出現下降。對總脂肪酸的分析中，飽和脂肪酸的總含量隨著脅迫溫度的升高呈增加趨勢，因此可能是游離飽和脂肪酸用于合成膜脂提高壇紫菜的耐熱能力，因而含量出現下降。C16:1、C18:1、C18:2、C20:1、C20:3、C20:4、C20:5、C22:1和游離不飽和脂肪酸總量均隨著脅迫溫度的升高呈現降低趨勢。當植物受到生物或非生物類脅迫時，防御性基因被激活表達相應的酶或蛋白，多不飽和脂肪酸在酶或者化學氧化作用下生成氫過氧化物，再被降解成氧化脂質參與脅迫防御[21-22]。因此，不飽和脂肪酸含量的降低可能是由于被氧化代謝成氧化脂質，因此本實驗對揮發性物質的變化情況進行進一步分析。

2.4 不同溫度脅迫條件下壇紫菜揮發性物質含量變化

揮發性物質是海藻的高效防御機制，其含量的變化是植物與環境復雜相互作用的結果，在防御脅迫中至關重要[23-24]。如表1所示，共鑒定出32 種揮發性物質，包括16 種醛、4 種酮、4 種醇、3 種酯、3 種烷烴和2 種烯烴。其中，C8醇、醛、酮為主要成分，如1-辛烯-3-酮、（E）-2-辛烯醛、3-乙烯環己醇、1-辛烯-3-醇、（E）-2-辛烯醇、1,5-辛二烯-3-醇、1,5-辛二烯-3-酮和辛醛，占總量的比例最高達74%。C8揮發性物質主要來源于C20多不飽和脂肪酸[25-26]，如1-辛基-3-醇來源于C20:4，1,5-辛二烯-3-醇和1,3,5-辛三烯來源于C20:5[27]。

表 1 壇紫菜在不同溫度條件下高溫脅迫1 h揮發性物質含量變化Table 1 Changes in VOCs of P. haitanensis after heat shock at different temperatures for 1 h

在脅迫過程中，C8揮發性物質具有引起氧化損傷、抑制生長和激活防御基因等作用[28-29]。如圖4所示，當脅迫溫度升至28 ℃時，所有C8揮發性物質含量都隨著熱激溫度的升高而增加，但當脅迫溫度升高至35 ℃時，所有的揮發性物質含量均下降，有些甚至低于對照組含量。當脅迫溫度升至28 ℃時，C8揮發性物質含量逐漸升高，而游離脂肪酸C20:3、C20:4和C20:5含量逐漸降低，說明隨著熱激溫度升高，壇紫菜感受更強的熱激脅迫，產生更多的保護性物質參與抗脅迫過程，來減輕藻體自身損害。但當高溫脅迫溫度升至35 ℃時，C8揮發性物質和游離脂肪酸C20:3、C20:4和C20:5含量均降低。在脅迫條件下，揮發性物質可以在羥自由基的作用下轉化為其他物質。同時，藻體可以利用揮發性物質來獲得碳源，并避免這種高代價防御帶來的損害[30]。而總脂肪酸的分析也發現當高溫脅迫溫度達到35 ℃時，飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸含量均下降，說明藻體受到嚴重損害，需要大量物質來維持生長。因此，在35 ℃條件下，飽和脂肪酸、游離脂肪酸C20:3、C20:4、C20:5和C8揮發性物質含量的下降可能是由于過度的熱激防御使藻體遭受較大的損害而不得不重新利用揮發性物質來維持自身的生存與生長，也可能是由于35 ℃條件下熱激1 h時，藻體已經處于適應階段，但1 h之前的脅迫階段損失過大，于是藻體重新利用揮發性物質來維持自身的生長。

圖 4 不同溫度脅迫條件下揮發性物質含量變化Fig. 4 Changes in VOCs of P. haitanensis after heat shock at different temperatures for 1 h

3 結 論

本實驗通過實驗室模擬高溫脅迫模式下，氣相色譜-質譜對20、25、28 ℃和35 ℃刺激條件下壇紫菜中脂肪酸和揮發性物質進行定性定量研究，共鑒定出13 種總脂肪酸，14 種游離脂肪酸以及32 種揮發性物質（16 種醛、4 種酮、4 種醇、3 種酯、3 種烷烴和2 種烯烴）。結果顯示，當脅迫溫度升高至28 ℃時，飽和脂肪酸和揮發性物質含量隨脅迫溫度升高呈增加趨勢，而不飽和脂肪酸和游離脂肪酸含量則隨脅迫溫度升高而降低；當脅迫溫度升高至35 ℃時，總脂肪酸、總游離不飽和脂肪酸和揮發性物質含量均隨脅迫溫度升高而降低。由此說明高溫脅迫條件下壇紫菜中的總脂肪酸、游離脂肪酸和揮發性物質通過含量的改變進行互相調節，來對抗高溫逆境引起的損傷，使藻體在逆境環境中得以生存和生長。此研究有助于進一步了解壇紫菜抗高溫脅迫機理、減輕高溫引起的藻類栽培損失。

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Analysis of Fatty Acids and Volatile Organic Compounds of Pyropia haitanensis under Heat Shock at Different Temperatures

SONG Yue, ZHUO Xin, CHEN Juanjuan*, LUO Qijun, YANG Rui, CHEN Haimin, YAN Xiaojun
(School of Marine Sciences, Ningbo University, Ningbo 315211, China)

To understand the changes in the fatty acid pro le of Pyropia haitanensis under heat shock stre ss, the fatty acids (FAs) and volatile organic compounds (VOCs) of P. haitanensis under heat shock stress at different temperatures were analyzed by gas chromatography-mass spectrometry (GC-MS). The results showed that after subjecting P. haitanensis to heat shock at 20 (control), 25, 28 and 35 ℃, a total of 13 total fatty acids (TFAs), 14 free fatty acids (FFAs) and 32 VOCs were identi ed. The contents of saturated fatty acids (SFAs) and VOCs were increased with increasing heat shock temperature up to 28 ℃, whereas the contents of unsaturated fatty acids (UFAs) and FFAs were decreased. As the heat shock temperature further rose to 35 ℃, the contents of TFAs, FFAs and VOCs were decreased. This study may be helpful to understand the mechanism of heat resistance of P. haitanensis and its cultivation.

Pyropia haitanensis; heat shock; fatty acid; volatile organic compounds; gas chromatography-mass spectrometry

10.7506/spkx1002-6630-201710032

TS252.53

A

1002-6630（2017）10-0191-08

宋悅, 卓馨, 陳娟娟, 等. 不同脅迫溫度條件下壇紫菜中脂肪酸和揮發性物質分析[J]. 食品科學, 2017, 38(10): 191-198.

DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710032. http://www.spkx.net.cn

SONG Yue, ZHUO Xin, CHEN Juanjuan, et al. Analysis of fatty acids and volatile organic compounds of Pyropia haitanensis under he at shock at different temperatures[J]. Food Science, 2017, 38(10): 191-198. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-201710032.http://www.spkx.net.cn

2016-07-30

浙江省自然科學基金項目（LY17D060002）；2015年度國家星火計劃項目（2015GA701027）；

浙江省科技廳公益項目（2016C37090）；寧波大學王寬誠幸福基金資助項目

宋悅（1993—），女，碩士研究生，研究方向為分析化學。E-mail：306574925@qq.com

*通信作者：陳娟娟（1981—），女，副教授，博士，研究方向為分析化學。E-mail：chenjuanjuan@nbu.edu.cn