半月板損傷并發膝關節滑膜炎患者局部滑膜組織及滑液中基質金屬蛋白酶3、9、13的表達觀察

黃媛霞，李愛國，陶金剛，徐海斌，路坦

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝453100)

半月板損傷并發膝關節滑膜炎患者局部滑膜組織及滑液中基質金屬蛋白酶3、9、13的表達觀察

黃媛霞，李愛國，陶金剛，徐海斌，路坦

(新鄉醫學院第一附屬醫院，河南衛輝453100)

目的 觀察半月板損傷導致的滑膜炎患者滑膜滑液中基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和基質金屬蛋白酶13(MMP-13)的表達變化。方法 128例半月板損傷患者，根據是否有伴有滑膜炎分為半月板損傷誘發滑膜炎者81例(觀察組)和單純半月板損傷者47例(對照組)。分別采用熒光定量PCR法和免疫組化法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白，采用ELISA法檢測兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。結果 觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相對表達量分別為3.12±0.41、2.10±0.24、3.01±0.30，對照組分別為1.53±0.35、0.87±0.18、1.12±0.21,P均<0.05；觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 蛋白相對表達量分別為394.1±20.6、170.5±14.8、190.7±13.6，對照組分別為204.5±15.3、90.3±8.4、109.3±10.4,P均<0.05。觀察組滑液組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA相對表達量分別為12.5±2.1、15.7±2.4、9.5±1.9，對照組分別為19.4±2.6、17.5±2.3、14.7±2.4,P均<0.05。觀察組Ayral滑膜炎評分≤60分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平明顯低于Ayral滑膜炎評分>60分者(P<0.05)。結論 半月板損傷導致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表達。MMP-3、MMP-9和MMP-13的異常表達可能與半月板損傷滑膜炎的發生有關。

滑膜炎；半月板損傷；基質金屬蛋白酶3；基質金屬蛋白酶9；基質金屬蛋白酶13

膝關節是人體重要關節，半月板可分散關節軟骨載荷、協助關節滑液潤滑關節，保護關節軟骨，增強關節穩定性[1,2]。外力可導致膝關節在運動的同時發生破裂和旋轉，造成半月板損傷。半月板損傷是常見的膝關節病變，可導致膝關節屈伸功能異常。長時間半月板損傷可導致半月板周圍的膝關節軟骨發生病變，最常見的為滑膜炎。半月板損傷所致滑膜炎主要臨床表現為滑膜組織充血水腫，關節滑液增多并伴有關節周圍疼痛腫脹。基質金屬蛋白酶(MMPs)是一組金屬依賴的可降解細胞外基質的蛋白酶類。研究發現，MMPs與基質金屬蛋白酶組織抑制因子比例失衡可能導致細胞外基質降解異常[3,4]。基質金屬蛋白酶3(MMP-3)、基質金屬蛋白酶9(MMP-9)和基質金屬蛋白酶13(MMP-13)在關節軟骨降解中發揮重要作用[5,6]，可破壞降解蛋白聚糖而保持關節軟骨彈性[7]。正常生理條件下，MMPs與基質金屬蛋白抑制物相互制約相互平衡,維持軟骨結構的完整性。但半月板損傷導致的滑膜炎患者病變組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達變化目前尚未見相關報道。我們觀察了半月板損傷導致的滑膜炎患者滑膜滑液中MMP-3、MMP-9和MMP-13的表達變化。現將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取我院于2013年6月～2016年6月收治的半月板損傷的128例患者，均經磁共振成像或者關節鏡下檢查確診為半月板損傷。128例患者分為半月板損傷誘發滑膜炎者81例(觀察組)和單純半月板損傷者47例(對照組)。觀察組中男49例，女32例；年齡46～77(52.5±12.3)歲；其中右膝41例，左膝40例；病程(3.7±1.1)年；關節鏡下損傷部位及類型：前1/3處20例(橫裂9例，縱裂5例，斜裂2例，層裂2例，復合裂2例)；中1/3處39例(橫裂15例，縱裂12例，斜裂6例，層裂3例，復合裂3例)；后1/3處22例(橫裂10例，縱裂4例，斜裂3例，層裂3例，復合裂2例)；采用Ayral的方法進行評定[8]，Ayral滑膜炎評分≤60分者49例、>60分者32例。對照組中男27例，女20例；年齡45～75(54.1±10.2)歲；其中右膝22例，左膝25例；病程(3.2±1.0)年；關節鏡下損傷部位及類型：前1/3出11例(橫裂4例，縱裂3例，斜裂1例，層裂1例，復合裂1例)；中1/3處20例(橫裂6例，縱裂7例，斜裂3例，層裂2例，復合裂2例)；后1/3處16例(橫裂5例，縱裂5例，斜裂2例，層裂2例，復合裂2例)；Ayral滑膜炎評分為≤60者28例、>60者19例。兩組年齡、性別比例、病程、損傷部位及損傷類型等臨床資料具有可比性。

1.2 試劑及儀器 實時熒光定量2×SYBR Green Mix和逆轉錄試劑盒均購自南京唯贊生物有限公司；引物有上海英俊生物有限公司合成；MMP-3、MMP-9和MMP-13 ELISA檢測試劑盒均購自R&D公司；鼠抗人MMP-3、MMP-9和MMP-13抗體均購自美國Santa Cruz公司；HRP標記的羊抗鼠二抗均購自杭州華安生物有限公司；DAB顯色液購自上海生工生物有限公司；顯微鏡購自日本奧林巴斯生物有限公司，其他試劑均為國產分析純試劑，購自國藥集團。

1.3 兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白檢測 ①熒光定量PCR法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA：取兩組滑膜組織，液氮研磨組織，RNA提取試劑盒提取總RNA，分光光度計測定RNA水平，逆轉錄試劑盒將RNA逆轉錄為cDNA。以GAPDH為內參， MMP-3上游引物為5′- ACCCAAATGGAGGAAAAACC-3′, 下游引物5′- CTTCAGCATTGGCTGAGTGA-3′； MMP-9上游引物為5′- TTGACAGCGACAAGAAGTGG-3′,下游引物5′-GCCATTCACGTCGTCCTTAT-3′；MMP-13上游引物為5′- GTCTCTCCTTCCCAGGGC -3′,下游引物5′- TTG ACCATGGGGCTAGAA -3′；GAPDH上游引物為5′- TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。反應體系： 2×SbGreen RT-PCR Mix 25 μL，FGF5-F1 1 μL， FGF5-R1 1 μL，cDNA 1 μL，加水補至50 μL。反應條件為94 ℃預性 5 min，94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，40個循環，以2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。②免疫組化法檢測兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 ：取兩組滑膜組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋、切片，脫蠟、水化，滴加0.3%的過氧化氫-甲醇溶液，混合30 min以消除內源性過氧化物酶的影響，PBS洗滌3次，每次5 min，再用PBS稀釋的10%的山羊血清封閉 1 h，封閉液分別稀釋MMP-3、MMP-9和MMP-13一抗，滴于玻片上，4 ℃孵育12 h，PBS洗滌3次，每次5 min，再用封閉液稀釋HRP標記的二抗，滴于玻片上室溫孵育30 min，PBS洗滌3次，每次5 min，DAB顯色，脫水、封片并拍照，采用軟件對圖片進行分析。兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13檢測 采用ELISA法檢測兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13。所有操作均嚴格按照使用說明書進行。設計校正孔，添加反應時只加TMB顯色液和終止液。分別取兩組滑液標本，每孔100 μL加入相應孔中，室溫孵育120 min，洗液洗滌3次，每次5 min；最后一次用紙吸干液體，加入稀釋后的一抗，室溫孵育3 h,PBS洗滌3次，每次5 min，加入稀釋好HRP標記的羊抗鼠的二抗，室溫孵育30 min，PBS洗滌3次、每次5 min。加入100 μL DAB顯色液，37 ℃孵育20 min，液體顏色變化后加入1 mol/L濃硫酸終止反應。采用酶標儀測定每孔的在480 nm處的吸光度值。根據吸光值建立標準曲線，根據標準曲線建立方程，計算MMP-3、MMP-9和MMP-13蛋白的相對表達量。

2 結果

兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量比較見表1。

表1 兩組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較見表2。

觀察組不同Ayral滑膜炎評分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較見表3。

3 討論

表2 兩組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較

注：與對照組比較，#P<0.05。

表3 觀察組不同Ayral滑膜炎評分者滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13水平比較

注：與Ayral滑膜炎評分≤60者比較，#P<0.05。

半月板損傷是臨床常見的膝關節病變，長時間半月板損傷可導致滑膜炎，導致膝關節出現水腫和疼痛等癥狀，嚴重影響患者生活質量。目前臨床主要通過關節鏡診斷半月板損傷所致滑膜炎，但關節鏡是一種創傷性診斷方法。因此，尋找一種快速有效診斷滑膜炎的指標具有重要臨床意義。滑膜是關節囊的內層，其主要包括兩部分，分別為內襯層，由1～4層滑膜細胞組成，具有吞噬能力。另一部分為基底層[9]。研究發現滑膜具有分泌和吞噬功能，其分泌的滑液不僅對關節具有潤滑作用，而且具有營養關節的功能[10]。但關節滑膜一旦發生感染，滑膜會分泌大量的炎癥介質進入滑液，因此滑液診斷滑膜和關節病變的敏感性較高。

MMPs是一組金屬依賴的可降解細胞外基質的蛋白酶類,其在關節軟骨細胞外基質的代謝過程中發揮重要作用[11]。MMP-3是基質金屬蛋白酶家族成員之一，由軟骨細胞、滑膜細胞分泌，不僅能降解多種細胞外基質中的細胞外蛋白多糖等基質蛋白底物，更重要的是MMP-3可激活MMP-9和MMP-13等酶原產生級聯放大反應，加重軟骨破壞程度[12]。MMP-9在可破壞軟骨基質，暴露軟骨組織膠原，破壞膠原形成的網狀結構[13]。MMP-9破壞膠原后產生的膠原網狀結構為進一步降解提供了基礎。因此MMP-3和MMP-9的相互作用加速了膠原網狀結構破壞，導致膠原軟骨發生不可逆的改變。MMP-13的主要生物學作用是介導Ⅱ型膠原降解[14]。

本研究結果發現，觀察組滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13 mRNA和蛋白相對表達量均高于對照組。說明半月板損傷引起的滑膜炎滑膜組織中MMP-3、MMP-9和MMP-13表達水平升高，而MMP-3、MMP-9和MMP-13表達水平的增加可能導致基質金屬蛋白酶和基質金屬抑制物失衡，最終使關節軟骨破壞受損。進一步分析顯示觀察組滑液MMP-3、MMP-9和MMP-13的水平高于對照組。進一步證實觀察組關節滑膜組織和滑液中存在MMPs表達水平上調，打破了關節軟骨基質金屬蛋白酶和基質金屬蛋白酶抑制物的平衡，使軟骨組織損傷。說明MMP-3、MMP-9和MMP-13水平隨著Ayral滑膜炎評分增加而升高，可能與滑膜炎病變程度成正相關。

綜上所述，半月板損傷導致的滑膜炎患者滑膜、滑液存在MMP-3、MMP-9和MMP-13 高表達。MMP-3、MMP-9和MMP-13的異常表達可能與半月板損傷滑膜炎的發生發展有關。

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河南省醫學科技攻關計劃項目(豫衛科201304029)。

徐海斌(E-mail: nhoscn@126.com)

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B

1002-266X(2017)19-0091-03

2016-08-30)