青海省漢族PIH患者血漿EPO水平及EPO基因3′端低氧增強子區T3541G單核苷酸多態性觀察

李紅榮，張耀剛，呂彩霞，王香林，莊文婷，李建華

(1青海大學醫學院基礎醫學部，西寧810016；2青海大學醫學院基礎醫學部解剖學教研室；3甘肅武威腫瘤醫院)

青海省漢族PIH患者血漿EPO水平及EPO基因3′端低氧增強子區T3541G單核苷酸多態性觀察

李紅榮1，張耀剛1，呂彩霞3，王香林1，莊文婷1，李建華2

(1青海大學醫學院基礎醫學部，西寧810016；2青海大學醫學院基礎醫學部解剖學教研室；3甘肅武威腫瘤醫院)

目的 觀察青海省漢族妊娠高血壓(PIH)患者促紅細胞生成素(EPO)基因3′端低氧增強子上T3541G單核苷酸多態性。方法 124例PIH患者為觀察組，112例正常孕婦為對照組。抽取兩組外周靜脈血，采用ELISA法檢測兩組血漿EPO。采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應方法對兩組EPO SNP/T3541G進行基因型分型并測序驗證。結果 觀察組和對照組血漿EPO水平分別為(454.113±35.097)、(396.316±50.262)pg/mL，二者比較，P<0.05。觀察組 EPO T3541位點基因型頻率野生型(TT)、雜合子型(TG)和突變純合子型(GG)分別為9.7%、74.2%、16.1%、對照組分別為42.9%、46.4%、10.7%，兩組比較，P均<0.05。觀察組EPO T3541位點等位基因頻率T、G分別為46.8.%、53.2%，對照組分別為66.1%、33.9%，兩組比較，P均<0.05)。EPO 基因SNP/T3541G多態性與PIH呈正相關(OR為0.451，95%CI：0.311～0.655)，T等位基因為PIH的保護基因(OR為0.708，95%CI：0.602～0.833)，G等位基因為PIH的危險因素(OR為1.569，95%CI：1.263～1.949)。結論 青海省漢族PIH患者血漿EPO水平高于健康孕婦。EPO基因SNP/T3541G多態性與PIH有關。

妊娠并發癥；妊娠高血壓；子癲前期；促紅細胞生成素基因；單核苷酸基因多態性

妊娠高血壓(PIH)是產科的常見疾病，是導致孕產婦及圍產兒死亡的重要原因，國外報道發病率7%～12%、我國為9.4%、我國高原地區為24.6%、青海省為15%[1～3]。目前研究認為PIH的發病與遺傳、母胎免疫失衡、胎盤滋養細胞缺血、氧化應激有關[4]，但其具體發病機制目前尚不明確。有研究[2]發現，PIH患者體內存在缺血缺氧的病理損害。促紅細胞生成素(EPO)可作用于骨髓造血系統，促進紅細胞的增殖分化，人體中主要由腎臟產生。近年研究發現其作為新的促血管生成因子，具有促進血管生成、抵抗細胞凋亡、抗缺氧等多種生物學功能。缺氧環境下，缺氧誘導因子(HIF)可調控EPO基因大量表達[5]。EPO基因3′端低氧增強子區域存在一個SNP位點(T3541G)，其多態性與EPO表達有關。在妊娠期母體血清、蛻膜、絨毛、胎肝、胚胎腦組織中EPO呈高表達[6]。目前關于EPO基因 SNP/T3541G多態性和PIH的相關性方面的報道較少。青海省大部分地區屬于高原，空氣中氧分壓低，而妊娠使孕婦對氧的需求量增加，相對于平原地區，高原孕產婦表現為胎盤灌注不足，胎盤缺血缺氧。在缺氧環境中，機體通過上調EPO來提高機體攜氧能力，改善組織缺血缺氧。本研究觀察了青海省漢族PIH患者血漿EPO水平變化及EPO基因 SNP/T3541G的多態性?，F報告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年10月～2016年1月間西寧市各大醫院(青海省人民醫院、青海大學附屬醫院、西寧市第二人民醫院等)收治的PIH患者124例，年齡23～35(28.6±5.8)歲，紅細胞數(4.06±0.46)×1012/L ，血紅蛋白(121.31±14.24)g/L，均來自青海省漢族世居人群，符合 1996 年美國婦產科醫師學會(ACOG)提出的PIH分類方法與診斷標準[2]，排除妊娠前患有高血壓、糖尿病、腎病等慢性病。另隨機選取產前體檢正常的孕婦112例為對照組，年齡21～32(26.4±2.2)歲，紅細胞數(4.12±0.35)×1012/L ，血紅蛋白(123.71±12.85)g/L;均來自青海省漢族世居人群。兩組性別、年齡、紅細胞數、血紅蛋白等資料具有可比性。

1.2 血漿EPO檢測 抽取兩組外周靜脈血2 mL，采用ELISA法檢測兩組血漿EPO。所有操作步驟均嚴格按照使用說明書進行。重復3次，取平均值。本研究經本院倫理委員會批準同意，所有患者知情同意并簽署知情同意書。

1.3 EPO 基因SNP/T3541G多態性觀察 用EDTA管采集兩組患者外周靜脈血2 mL，使用基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司生產)提取全血基因組DNA。參考文獻[7]合成EPO基因 SNP/T3541G位點引物(上游引物5′-ACTCTTGGCTTTTCTGTTTTCTGGG -3′和下游引物5′-TACT-GCGGTGAGGCCTTGAATGTAG-3′)。EPO SNP/T3541G多態性檢測采用限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應(PCR-RFLP)法，所用內切酶為AccI(New England Biolabs，Beverly，MA)。PCR總反應體積20μL：2×Taq PCR Master Mix10μL(天根生化科技有限公司生產)， ddH2O 6 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL，PCR反應條件：95 ℃預變性5 min后進入循環，95 ℃、30 s，58 ℃、40 s，72 ℃、45 s，共32個循環，72 ℃延伸10 min 。PCR 產物為226 bp。取PCR 產物8 μL用AccI 內切酶 1μL，10×Tag Buffer 5 μL,ddH2O 6 μL,總體積20 μL，離心混勻后經37 ℃水浴鍋消化5 h，酶切產物經 4%瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物被AccI 切為小片斷(201 bp 和 25 bp)，基因型為TT型，如果發生突變，AccI將不能切斷 PCR 產物。酶切產物為一個條帶(226 bp)，基因型為GG型。酶切產物為三條帶(226、201和25 bp)基因型為TG型。AccI的識別位點為5′…GT▼MKAC…3′，3′…CAKM▼TG…5′。K為G或T，M為A或C。將對照組和觀察組基因型為TT、TG、GG型的PCR產物樣品各2份送上海生物工程有限公司測序。

2 結果

2.1 兩組血漿EPO水平比較 觀察組和對照組血漿EPO水平分別為(454.113±35.097)、(396.316±50.262)pg/mL，二者比較，P<0.05。

2.2 兩組EPO基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較 兩組EPO 基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較見表1。相關性分析顯示，EPO 基因SNP/T3541G多態性與PIH呈正相關(OR為0.451，95%CI：0.311～0.655，P<0.05)，T等位基因為PIH的保護基因(OR為0.708，95%CI：0.602～0.833)，G等位基因為PIH的危險因素(OR為1.569，95%CI：1.263～1.949)。

表1 兩組EPO 基因SNP/T3541G等位基因及基因型頻率比較(%)

注：與對照組相比，▲P<0.05。

3 討論

EPO是具有多種活性的血管因子，在心腦血管疾病中具有血管保護作用[8]；在腫瘤患者體內，EPO可調節瘤體血管生成。人類EPO基因定位于7q22，其3′端增強子上3 512 bp～3 740 bp之間有HIF-1和其它因子的結合部位，如肝核因子、雌激素等。許多轉錄因子結合在這個部位，可提高EPO基因的轉錄表達水平[9]。有研究表明，把低氧反應增強子通過載體轉染至Hep3B等細胞，可在低氧或CoCl2刺激下大量表達EPO基因[10,11]。最新研究發現,在妊娠過程中，EPO具有促進胎盤血管生成，改善胎盤血管功能的作用；可調控胎盤滋養細胞的增殖、分化、侵襲、凋亡，完成子宮螺旋動脈重鑄及胎盤血管新生，維持母胎界面平衡，保證胎盤正常血供和營養支持[12]。

EPO與PIH的相關性國內外早有報道[13～15]，在PIH患者的胎盤、血液、臍帶血中EPO水平明顯增高。本研究發現，在青海省漢族PIH組中，突變雜合子TG及突變純合子GG基因型頻率明顯高于對照組。T等位基因頻率低于對照組，但G等位基因頻率明顯高于對照組。EPO基因SNP/T3541G與PIH呈正相關，G等位基因是PIH的危險因素。EPO基因是受HIF基因調控的缺氧誘導通路主要調控基因。在缺氧的條件下，HIF基因高表達，作用于低氧調控區使EPO表達上調十倍左右，從而使機體內紅細胞和血紅蛋白濃度升高，改善機體缺氧狀態。HIF在妊娠絨毛和蛻膜組織中表達增強，可誘導 EPO合成增加[16]，EPO促進血管生成和抗凋亡，調節胚胎發育。原因可能為EPO通過下調NF-κB的表達從而抑制滋養細胞凋亡及相關活化通路，活化的 NF -κB 通過與相應的炎癥介質靶基因啟動子區的κB 位點相結合而導致炎癥介質相關基因的過度表達，因此EPO可通過抑制NF-κB來抑制TNF-ɑ介導的炎癥因子釋放，另外，EPO可增強內皮細胞功能，促進eNOS的合成，使NO合成增多，血管擴張，改善胎盤血液供應，從而對胎盤產生保護作用[17]。

研究報道，EPO基因T3541G位點突變型TG和GG型較野生型TT型相比，可促進EPO表達[18,19]。如在藏族紅細胞增多患者中以TG型多見。這與本研究結果一致，PIH患者EPO基因T3541G位點突變以TG型多見，血漿EPO水平明顯高于正常孕婦。對藏豬EPO基因的多態性研究[20]認為隨著海拔增高，藏豬的突變型基因頻率增高可能與高原低氧環境適應有關。

綜上所述，青海省漢族PIH患者血漿EPO水平高于健康孕婦。EPO基因SNP/T3541G多態性與PIH有關。但本研究樣本量相對較少，且沒有具體檢測不同基因型對EPO表達的影響，只是比較了兩組血漿EPO水平。今后研究應將EPO增強子區T3541G不同基因型的基因通過載體導入到相應細胞中，區分其對EPO表達的影響，為EPO基因多態性與妊高征的相互作用提供有力證據。

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青海省自然科學基金資助項目(2015-ZJ-746)。

李建華(E-mail: lijianhua@qhu.deu.cn)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.017

R714.26

B

1002-266X(2017)19-0057-03

2017-01-19)