宮頸癌組織中p16蛋白、線粒體融合蛋白2的表達變化

李昌紅,車玲玉,程振輝,孫鑫,白云

(華北理工大學生命科學學院，河北唐山063000)

宮頸癌組織中p16蛋白、線粒體融合蛋白2的表達變化

李昌紅,車玲玉,程振輝,孫鑫,白云

(華北理工大學生命科學學院，河北唐山063000)

目的 觀察宮頸癌組織中抑癌基因p16和線粒體融合蛋白2(HSG)的表達變化。方法 采用免疫組織化學的方法檢測72例宮頸癌組織、51例宮頸上皮內瘤變(CIN)組織(其中CINⅠ級27例、CINⅡ級10例、CINⅢ級14例)、25例正常宮頸組織中p16和HSG的表達。結果 宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中p16的陽性表達率分別為91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宮頸癌組織中p16的陽性表達率均高于CIN宮頸組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中HSG的陽性表達率分別為 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宮頸癌組織中HSG陽性表達率低于CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。p16表達與宮頸癌分化程度有關(P<0.05); HSG表達與宮頸癌臨床分期、分化程度有關(P均<0.05),與患者年齡、淋巴結轉移情況及病理類型無關(P均>0.05)。相關性分析顯示，宮頸癌組織p16表達與HSG的表達呈負相關(r=-0.464，P<0.05)。結論 宮頸癌組織中p16陽性表達率降低，HSG陽性表達率升高。p16、HSG的異常表達可能與宮頸癌的發生發展有關。

宮頸腫瘤；宮頸癌；多腫瘤抑癌基因；細胞增殖抑制基因

宮頸癌是女性生殖道最常見的惡性腫瘤之一[1]。p16又稱多腫瘤抑制基因，是被發現的第一個可直接作用于細胞周期參與細胞周期調控，控制細胞生長與分化并抑制細胞分裂的基因[2]。p16是細胞周期中的一種抑癌基因，能直接參與細胞周期的調控并負責調節細胞增殖與分裂，在肝癌、肺癌、乳腺癌等多種惡性腫瘤中存在異常表達。細胞增殖抑制基因HSG,又稱為線粒體融合蛋白2，既往研究發現，它可以使細胞周期停滯在G0/G期，誘導細胞凋亡；并且能抑制ras蛋白，調節ERK/MARP路徑，從而遏制腫瘤細胞快速增殖[3，4]。目前，國內外關于p16、HSG在宮頸癌中的相關研究報道較少。我們觀察了宮頸癌組織中p16、HSG的表達變化，探討p16、HSG在宮頸癌發生發展中的作用。

1 材料與方法

1.1 宮頸病變組織標本來源 收集2011年7月～2016年7月華北理工大學附屬醫院婦科手術切除的宮頸癌組織標本72例、宮頸上皮內瘤變(CIN)Ⅰ27例、CINⅡ10例，CINⅢ 14例、正常宮頸組織標本25例。宮頸癌患者中年齡(48.8±2.6 )歲，將宮頸癌患者年齡按照FIGO分期標準分為 Ⅰ期32例，Ⅱ期19例、Ⅲ～Ⅳ期21例。四類標本來源與患者年齡等臨床資料差異無統計學意義。

1.2 試劑與儀器 鼠抗人p16基因單克隆抗體購自北京中杉金橋生物技術有限公司 ,兔抗人HSG基因單克隆抗體購自美國Santa Cruz公司，SP-9001免疫組化染色試劑盒、DAB顯色劑及枸櫞酸鹽購自北京中杉金橋生物技術有限公司，華北理工大學提供Olympus光學顯微鏡。

1.3 宮頸癌組織中p16、HSG蛋白檢測方法 采用免疫組化方法。將標本制成3 μm石蠟切片，對脫蠟完全的標本進行抗原修復，暴露抗原決定簇；過氧化氫溶液除去內源性氧化酶，解除內源物質對實驗的干擾；滴加一抗和HSG，4 ℃冰箱過夜。將5 μL p16與1 000 μL的稀釋液均勻混合配制成通用二抗(p16)，4 ℃冰箱過夜。DAB顯色劑進行顯色操作，用蒸餾水洗去DAB顯色劑，然后進行脫水，脫水后風干，中性樹脂封片，封片完成后在顯微鏡下觀察。p16陽性表達定位于細胞核及細胞質中，呈深黃色大顆粒。p16在細胞核及細胞質處深黃色大顆粒為陽性；HSG陽性表達定位于細胞質中，呈棕黃色顆粒。HSG在細胞質中呈現出棕黃色顆粒則為陽性。計算陽性細胞百分比：>60%為強陽性，10%～60%為陽性，<10%為弱陽性，未發現陽性細胞為陰性，強陽性與弱陽性均判定為蛋白表達陽性。

1. 4 統計學方法 采用 SPSS13.0統計軟件。計數資料比較采用χ2檢驗和Fisher確切概率法，相關性分析采用Spearman等級相關分析法。P<0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 宮頸癌組織、CIN組織、正常宮頸組織中p16和HSG蛋白的表達變化 宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中p16陽性表達率分別為91.67%(66/72)、22.22%(6/27)、60.00%(6/10)、64.28%(9/14)、20.00%(5/25)；宮頸癌組織中p16陽性表達率均高于CIN宮頸組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。宮頸癌組織、CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織中HSG的陽性表達率分別為 8.3%(6/72)、44.44%(12/27)、40.00%(4/10)、35.7%(5/14)、60.00%(15/25)；宮頸癌組織中HSG陽性表達率低于CINⅠ組織、CINⅡ組織、CIN Ⅲ組織、正常宮頸組織(P均<0.05)。

2.2 p16、HSG表達與宮頸癌臨床病理參數的關系 p16表達與宮頸癌分化程度有關(P<0.05); HSG表達與宮頸癌臨床分期、分化程度有關(P均<0.05),與患者年齡、淋巴結轉移情況及病理類型無關(P均>0.05)。見表1。

表1 p16 、HSG表達與宮頸癌臨床病理參數的關系(例)

2.3 宮頸癌組織 p16、HSG表達的相關性 相關性分析顯示，宮頸癌組織p16表達與HSG的表達呈負相關(r=-0.464,P<0.05)。

3 討論

宮頸癌是危害婦女健康的第二大腫瘤，死亡率位居女性惡性腫瘤的首位，同時也是女性癌癥的第二大死亡原因[9]。宮頸癌的發生發展過程是非常復雜的，它與細胞周期的調節失控有關，也與多種抑癌基因的表達以及細胞凋亡的參與密切相關。

p16是1994年美國冷泉港實驗室Kamb等科學家發現的一種新的抗癌基因[10]，定位于人類染色體9p21上;由2個內含子及3個外顯子組成，第1外顯子由126 bp組成，第2外顯子由307 bp組成，第3外顯子11 bp組成。該基因是細胞周期中的一種基本基因和細胞周期調節蛋白之一，它可阻止細胞由G1期進入S期，從而抑制細胞增殖；p16基因的表達產物(即p16蛋白)直接參于細胞增殖的負調節并定位于細胞核內。據之前的研究表明p16可能是比P53更重要的一種新型抗癌基因。有人把p16基因比作細胞周期中的剎車裝置，一旦失靈則會導致細胞惡性增殖[11]，便可能導致惡性腫瘤發生。發生突變或缺失時，通常極易導致細胞異常增殖[11]，形成腫瘤。p16基因直接參與腫瘤的形成，目前已經分別在肺癌、乳腺癌、腦腫瘤、骨腫瘤、皮膚癌、膀胱癌、腎癌、卵巢癌和淋巴瘤、黑色素瘤中發現p16基因發生突變，這提示p16基因以缺失、突變方式廣泛參予腫瘤形成[12]。因此，檢測p16基因的突變與缺失，是判斷宮頸組織是否有腫瘤以及推斷腫瘤的部分性質的一項重要指標；對于宮頸癌的預后診斷及臨床治療更是具有極其重要的現實意義。

本研究發現，宮頸癌組織中p16陽性表達率降低。p16的表達與宮頸癌組織分化程度有關；這說明p16基因的表達水平越高，腫瘤組織分化程度越嚴重[13]；這也提示p16基因的表達上調與宮頸癌的進展密切相關，且能夠參與并調節生物體多種生理病理過程：具有促進腫瘤細胞凋亡并抑制腫瘤細胞增殖的作用；能夠通過使癌變細胞的細胞周期停留在G0/G期，而誘導細胞凋亡。本研究結果顯示，HSG在宮頸癌組織中的表達量明顯低于在正常宮頸組織里和良性腫瘤組織當中。在臨床分期和分化中，p16表達量與其發展程度呈負相關；且有淋巴結轉移組的表達量低于無淋巴結轉移組。這即證明HSG的表達量越低，腫瘤組織發展就越慢；即HSG能較有效地抑制惡性腫瘤細胞進而削弱癌細胞對周圍組織的浸潤作用。以上結果都充分表明了HSG是一種潛在的抑癌基因，具有抗腫瘤效應[14]。它也是一種潛在的生物標志物，其在細胞信號轉導、能量代謝、增殖及調亡等生理或病理性過程中具有重要的調節作用；并且HSG基因與宮頸癌的不良預后也有著密切的相關性。因此它亦能夠作為評估宮頸癌病情進展和預后的指標之一。

HSG是具有抑制細胞增殖作用的融合蛋白，并且也是一種高度保守的跨膜GTP酶。它在細胞信號轉導、能量代謝、細胞增殖以及細胞凋亡等多種生命過程中均具有重要的調節作用；對于多種腫瘤傳代細胞系同樣具有抗增殖和誘導其凋亡的作用。HSG可以使分裂細胞的細胞周期在G0/G1期停止然后誘導相對應的細胞凋亡，該基因在腫瘤中的作用是通過促進腫瘤細胞凋亡而抑制腫瘤細胞增殖[15]。

本研究中，宮頸癌組織p16表達與HSG的表達呈負相關。可能原因為，在宮頸癌發生發展過程中， p16可直接作用于細胞周期，腫瘤組織中p16的表達情況可作為宮頸癌惡性程度的指標[16]。p16在宮頸組織中的表達特點提高了宮頸癌的早期診斷、預后判斷的準確率,并且也為腫瘤的基因治療提供理論依據[17]。HSG則是一種潛在的抑癌基因，具有較強的抗腫瘤效應[18],能抑制腫瘤細胞的增殖,降低腫瘤細胞的浸潤能力。

綜上所述，宮頸癌組織中p16陽性表達率降低，HSG陽性表達率升高。p16、HSG的異常表達可能與宮頸癌的發生發展有關。p16、HSG可能作為宮頸癌診斷和預后判斷的參考指標，提高對官頸癌診斷的靈敏度[19]和預后判斷的準確率[20]。但p16、HSG在宮頸癌組織中相互作用的具體機制尚有待于進一步研究。

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河北省衛生計生委醫學科學研究重點課題計劃(20170894)；華北理工大學2017年大學生創新計劃項目(20170897);華北理工大學2017年大學生創新創業訓練計劃立項項目(X2017189)。

白云(E-mail: 1063628881@qq.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.015

R737.33

B

1002-266X(2017)19-0051-03

2016-11-17)