子宮內(nèi)膜癌組織中長鏈非編碼RNA ANRIL的表達變化及其意義

殷悅，姜霞，代麗麗，魏旭靜，李林，李義飛

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，石家莊 050031)

·臨床研究·

子宮內(nèi)膜癌組織中長鏈非編碼RNA ANRIL的表達變化及其意義

殷悅，姜霞，代麗麗，魏旭靜，李林，李義飛

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，石家莊 050031)

目的 觀察子宮內(nèi)膜癌組織中長鏈非編碼RNA(lncRNA)ANRIL的表達變化，并探討其臨床意義。方法 子宮內(nèi)膜癌患者40例(觀察組)，均行子宮切除術，術中留取子宮內(nèi)膜癌組織；另選擇因陰道異常出血行宮腔鏡刮宮活檢或因子宮肌瘤行全子宮切除術的患者40例(對照組),術中留取正常子宮內(nèi)膜組織標本。采用實時熒光定量PCR法檢測兩組組織ANRIL，分析ANRIL表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關系。結果 觀察組、對照組組織中ANRIL的相對表達量分別為19.89(5.26，61.42)和6.08(1.62，27.79)，兩者相比，P<0.05。觀察組病理分級為Ⅰ+Ⅱ級、Ⅲ級組織中ANRIL的相對表達量分別為6.12(1.58，24.65)、15.21(6.12，59.73)，兩者相比，P<0.05。ANRIL表達與子宮內(nèi)膜癌患者年齡、FIGO病理分期及有無盆腔淋巴結轉移、是否合并高血壓、糖尿病、雌激素及孕激素水平均無關(P均>0.05)。 結論 子宮內(nèi)膜癌組織中ANRIL表達升高，ANRIL可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

子宮腫瘤；子宮內(nèi)膜癌;長非編碼RNA；長鏈非編碼RNA ANRIL

長鏈非編碼RNA(LncRNA)是指長度超過200個核苷酸(nt)且不能編碼蛋白的RNA片段[1]。lncRNA之前被認為是沒有生物學功能的轉錄組“背景噪音”，但隨著分子生物學的研究進展發(fā)現(xiàn)其可作為功能分子在染色質(zhì)修飾與重塑、端粒的維持、調(diào)控細胞分化與細胞周期等多層面發(fā)揮著重要生物學調(diào)控作用[3，4]。ANRIL是lncRNA的一種，被認為是膀胱癌、前列腺腺癌、胃癌、黑色素瘤、乳腺癌等多種惡性腫瘤的致癌基因。目前關于ANRIL在子宮內(nèi)膜癌組織中表達情況的相關報道較少。2015年12月～2016年10月，本研究觀察了子宮內(nèi)膜癌組織中ANRIL的表達變化，并探討其意義。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2009年4月～2015年12月在河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院治療的子宮內(nèi)膜癌患者40例(觀察組)，年齡37～65歲，中位年齡55歲；病理分級為Ⅲ級13例、Ⅰ+Ⅱ級27例；均行子宮切除術，術中留取子宮內(nèi)膜癌組織，手術分期符合2009年國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)修訂的子宮內(nèi)膜癌手術分期標準，術前均未接受全身或局部的放療及藥物治療。另選擇因陰道異常出血行宮腔鏡刮宮活檢或因子宮肌瘤行全子宮切除術的患者40例(對照組)，年齡31～67歲，中位年齡51歲，術中留取正常子宮內(nèi)膜組織標本。標本獲得后置于液氮中低溫儲存?zhèn)溆谩Ｋ袠吮揪?jīng)患者及家屬知情同意，病理診斷證實。兩組患者年齡差異無統(tǒng)計學意義。所有患者均排除心、肝、腎等重要臟器疾病。

1.2 子宮內(nèi)膜癌組織中ANRIL檢測方法 采用實時定量PCR法。TRIzol試劑盒購自Invitrogen公司，RevertAid First strand cDNASynthesis Kit試劑盒購自Thermo Fisher公司，實時熒光定量PCR選用UltraSYBR Mixture(With RoxⅠ)購自康為世紀公司，內(nèi)參β-actin、ANRIL引物均購自Invitrogen公司。分別取兩組標本，嚴格按照TRIzol試劑盒使用說明書提取總RNA。選用RevertAid First strand cDNASynthesis Kit試劑盒，采用T100 Thermal Cycler PCR儀(購自美國Bio-Rad公司)對提取總RNA進行反轉錄合成cDNA。ANRIL上游引物5′-GCGCCGGACTAGGACTATTT-3′，下游引物5′-GCCAGGACGGAGATCAGATG-3′；內(nèi)參β-actin引物序列：上游引物5 ′-CAGCCATGTACGTTGCTATCCAGG-3′，下游引物5′-AGGTCCAGACGCAGGATGGCATG-3′，產(chǎn)物長度153 bp。反應體系20 μL：1.2×UltraSYBR 混合物10 μL、上游引物(10 μmol/mL)0.4 μL、下游引物(10 μmol/mL)0.4 μL、cDNA 1 μL、去核糖核酸酶水8.2 μL。反應條件：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s,60 ℃、1 min，42個循環(huán)。以2-ΔΔCt代表ANRIL的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法 采用SPSS21.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。本研究為計量資料不符合正態(tài)性以(四分位數(shù)間距)表示P50(P25，P75)，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗、方差分析(ANOVA)，不符合正態(tài)分布的資料用非參數(shù)檢驗。ANRIL的表達量在不同子宮內(nèi)膜組織及內(nèi)膜癌患者不同臨床病理參數(shù)中的比較用Mann-Whitney法檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

觀察組、對照組組織中ANRIL的相對表達量分別為19.89(5.26，61.42)和6.08(1.62，27.79)，兩者相比，P<0.05。觀察組病理分級為Ⅰ+Ⅱ級、Ⅲ級組織中ANRIL的相對表達量分別為6.12(1.58，24.65)、15.21(6.12，59.73)，兩者相比，P<0.05。

ANRIL表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關系見表1。由表1可見，ANRIL表達與子宮內(nèi)膜癌患者年齡、FIGO病理分期及有無盆腔淋巴結轉移、是否合并高血壓、糖尿病、雌激素及孕激素水平無關(P均>0.05)。

表1 ANRIL表達與子宮內(nèi)膜癌臨床病理參數(shù)的關系

3 討論

子宮內(nèi)膜癌是子宮內(nèi)膜發(fā)生的癌，絕大多數(shù)為腺癌，它是婦科最為常見的三大惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和病死率逐年上升[5]，對女性健康和生命構成嚴重的威脅，因此探索子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展的分子生物學機制,尋找新型腫瘤分子標記物和治療靶點，有助于子宮內(nèi)膜癌患者早期發(fā)現(xiàn)、診斷、治療，從而實現(xiàn)提其高生存質(zhì)量，延長壽命，降低病死率的目標。

LncRNA由于其不能編碼蛋白一直被認為“轉錄過程的副產(chǎn)物”而被人們忽視，然而近年來越來越多的研究表明，LncRNA在錯綜復雜的機體調(diào)控網(wǎng)絡中扮演重要角色，它做為功能分子參與表觀遺傳、轉錄調(diào)控以及轉錄后的調(diào)控[6]。像編碼蛋白質(zhì)的對應產(chǎn)物一樣，LncRNA也受到典型的轉錄因子和表觀遺傳調(diào)節(jié)。例如EZH2可表觀的抑制 lncRNA SPRY4-IT1 在非小細胞肺癌中的表達[7]，隨著DNA的損傷ANRIL被轉錄因子E2F1 反式激活[8],HOTAIR被缺氧誘導因子-1α反式激活,原癌基因已被證明在多種人類腫瘤中存在高表達[9]，原癌基因作為關鍵的轉錄因子,在調(diào)節(jié)許多細胞生物過程,包括細胞增殖、細胞周期、細胞凋亡、細胞代謝中起著至關重要的作用 。研究證實lncRNA與人類腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Zhao等[11]研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中長鏈非編碼RNA MALAT1的轉錄受到Wnt/β-catenin信號通路啟動子TCF的調(diào)控，并且PCDH10也是通過抑制該通路實現(xiàn)對MALAT1的調(diào)節(jié)，從而使其表達水平下調(diào)。Liu等[19]應用實時熒光定量PCR技術檢測了胃癌及癌旁組織中長鏈非編碼RNA FEZF1-AS1的表達量，發(fā)現(xiàn)其在癌組織的表達水平明顯高于癌旁組織，還發(fā)現(xiàn) FEZF1-AS1的表達量與腫瘤的TNM分期、瘤體大小及預后呈明顯相關性，他們還利用RNA結合蛋白免疫沉淀實驗和RNA-pulldown實驗證明了長鏈非編碼RNA FEZF1-AS1通過結合賴氨酸特異性組蛋白去甲基化酶1(LSD1)表觀的抑制了p21的表達，從而促進了胃癌的增殖[12]。

LncRNA 家族成員之一的ANRIL(INK4位點的長鏈反義非編碼RNA)最早是Pasmant等[13]在患有神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和INK4B-ARFINK4A基因叢完全缺失的家族性黑素瘤的患者中發(fā)現(xiàn)的。目前多數(shù)對ANRIL功能的研究，很多是通過RNA干擾技術造成其功能缺失實現(xiàn)的。實驗表明特異性的RNA干擾能下調(diào)ANRIL的表達，并且能夠顯著抑制非小細胞肺癌的增殖。研究發(fā)現(xiàn)在ANRIL啟動子區(qū)域原癌基因與E-box直接結合誘導了ANRIL的表達[18]。ANRIL的沉默也可以使原癌基因誘導細胞促生長的趨勢減弱。這與Qiu等[14]的研究結果一致，其探討的卵巢癌發(fā)病機制認為，ANRIL的過表達使 bcl - 2蛋白和mRNA水平增加，促進癌細胞增殖，抑制細胞凋亡。ANRIL可作用于特定獨立基因,抑制其鄰近的腫瘤抑制因子包括P14ARF(p53通路的調(diào)節(jié)因子)以及兩個周期蛋白依賴性激酶抑制劑P15INK4B、P16INK4A分子，其中P15INK4B在細胞增殖、細胞周期進程、細胞復制衰老過程中發(fā)揮重要作用[15]。Huang等[16]發(fā)現(xiàn)ANRIL在肝細胞癌中的表達水平被上調(diào)，并且其表達水平與腫瘤的大小及巴塞羅那臨床肝癌分級密切相關，同時其還發(fā)現(xiàn)ANRIL是通過抑制KLF2蛋白的轉錄來實現(xiàn)其調(diào)節(jié)肝癌細胞的增殖和侵襲的。古松鋼等[17]用免疫組化SP法和實時熒光定量PCR法檢測結、直腸癌組織及對應癌旁正常組織中ANRIL的表達水平，發(fā)現(xiàn)ANRIL在癌組織中的表達量明顯高于正常組織。Zhu等[18]通過研究ANRIL在膀胱癌和相應癌旁組織中的表達水平及T24和 EJ細胞株轉染后增殖和凋亡情況，首次提出ANRIL可能是膀胱癌的促癌基因，其通過內(nèi)在細胞凋亡途徑調(diào)節(jié)膀胱癌細胞的增殖和凋亡。

然而關于ANRIL在子宮內(nèi)膜癌組織中表達水平及其如何調(diào)節(jié)下游分子引起發(fā)病機制的研究仍不明確。本研究采用實時熒光定量的方法檢測ANRIL在子宮內(nèi)膜不同子宮內(nèi)膜組織的相對表達量，發(fā)現(xiàn)ANRIL在子宮內(nèi)膜癌組織中的表達水平明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，并且病理分級為Ⅲ級的癌組織中ANRIL的表達水平也明顯高于其在Ⅰ+Ⅱ級癌組織中的表達水平,且差異具有統(tǒng)計學意義。推測ANRIL可能在子宮內(nèi)膜癌發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮一定的調(diào)節(jié)作用。其具體機制可能為：ANRIL通過綁定PRC2抑制KLF2和P21的轉錄，從而影響子宮內(nèi)膜癌細胞的增殖和凋亡。

綜上所述，子宮內(nèi)膜癌組織中ANRIL表達升高，ANRIL可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展。

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河北省自然科學基金資助項目(H2012206040)。

張紅真(E-mail： 974081280@126.com)

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R711.74

B

1002-266X(2017)19-0048-03

2016-11-01)