Toll樣受體4特異性拮抗劑TAK-242對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖、凋亡的影響及其機制

魏蔚，劉玉華，劉守燕

(1平頂山學院醫學院,河南平頂山467000；2平頂山市第一人民醫院)

Toll樣受體4特異性拮抗劑TAK-242對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖、凋亡的影響及其機制

魏蔚1，劉玉華1，劉守燕2

(1平頂山學院醫學院,河南平頂山467000；2平頂山市第一人民醫院)

目的 觀察Toll樣受體4(TLR4)特異性拮抗劑TAK-242對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。方法 取對數生長期人卵巢癌SKOV-3 細胞分為A組、B組、對照組及空白組， A、B組分別加入終濃度為20、40 nmol/L的 TAK-242培養，對照組加入1% DMSO，空白組不做任何處理。采用MTT比色法觀察給藥24、48、72 h時各組細胞增殖情況，采用Annexin-V/PI觀察給藥24、48、72 h時各組凋亡細胞。采用Western blotting法檢測給藥48 h時各組細胞核因子-κB (NF-κB )p65、總蛋白細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cleaved-caspse 3)。結果 給藥24、48、72 h時，A、B組細胞增殖抑制率均高于對照組、空白組(P均<0.05)；給藥24、48、72 h時， B組細胞增殖抑制率均高于A組(P均<0.05)；隨給藥時間延長，B組細胞增值抑制率升高(P均<0.05)。給藥24、48、72 h時，A、B組細胞凋亡率均高于對照組、空白組(P均<0.05)；TAK-242濃度升高，細胞凋亡率升高，隨給藥時間延長，細胞凋亡率升高(P均<0.05)；隨給藥時間增加，B組細胞增值抑制率升高(P均<0.05)。給藥48 h時，細胞NF-κB p65、Cyclin D1蛋白相對表達量低于空白組和對照組，cleaved-caspase 3相對表達量高于空白組和對照組(P均<0.05)。結論 TAK-242可抑制人卵巢癌細胞的增殖、促進細胞凋亡，其機制可能為NF-κB信號通路功能被抑制。

卵巢腫瘤；卵巢癌；Toll樣受體4；細胞增殖；細胞凋亡

卵巢癌是我國常見的婦科腫瘤，發病率和病死率均較高[1, 2]。化療是卵巢癌的常用治療方法[3, 4]。但化療藥物可導致患者出現耐藥性，不良反應較多，因此開發出新型、高效的化療藥物對改善卵巢癌患者的預后具有重要臨床意義[5, 6]。Toll樣受體4(TLR4)屬于Ⅰ型跨膜蛋白，分布于多種組織細胞中，可通過NF-κB信號通路或JNK/SAPK激活途徑激發人體抗感染過程[3, 7]。核因子-κB (NF-κB )p65、總蛋白細胞周期蛋白D1(CyclinD1)、裂解的半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶-3(cleaved-caspse 3)是常用的NF-κB信號通路檢測指標。既往研究發現，TLR4在卵巢癌的發生、發展中可能發揮重要作用[7]，但其具體機制目前尚不明確。我們觀察了TLR4新型特異性選擇性拮抗劑TAK-242[8]對人卵巢癌細胞株SKOV-3增殖、凋亡的影響，并探討其可能作用機制。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人卵巢癌SKOV-3 細胞株購自中科院上海細胞所，RPMI1640培養基購自美國Gibco公司，MTT試劑盒購自美國Sigma公司，cleaved-caspase 3、H3、CyclinD1、p65和H3，β-actin的抗體均購自美國cell signaling公司。免疫印跡電泳裝置、凝膠成像儀均購自中國天能公司。

1.2 SKOV-3 細胞分組及TAK-242給藥方法 取人卵巢癌SKOV-3 細胞株，復蘇后接種于培養瓶中，培養基為含10%胎牛血清的RPMI1640培養液， 37 ℃飽和濕度、5% CO2的孵箱中培養， 24～48 h換液一次。取處于對數生長期SKOV-3細胞，按照5×105/100 μL的密度接種于96孔板中。培養24 h時將細胞分為A、B組、對照組及空白組，每組9個復孔，A、B組分別加入終濃度為20、40 nmol/L的 TAK-242培養(劑量選擇參照文獻[9])，對照組加入1% DMSO，空白組不做任何處理，將各組細胞置于37 ℃飽和濕度、5% CO2培養箱中培養，備用。

1.3 各組細胞增殖情況觀察 采用MTT比色法。分別取給藥24、48、72 h時各組細胞，PBS洗滌2次，接種于96孔板中，每組9個復孔。每孔加入50 mL 0.5 mg/mL MTT溶液，持續孵育4 h，吸除上清液，然后每孔加入150 μL的DMSO，在振蕩器上震蕩10 min。采用自動酶標儀檢測各組細胞在490 nm波長處的光密度值(OD)，取9個復孔的平均值。采用GraphPad Prism軟件計算各組細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率=(1-OD實驗組/OD空白組)×100%。

1.4 各組細胞凋亡情況觀察 采用Annexin-V/PI檢測各組細胞凋亡情況。分別取給藥24、48、72 h時各組細胞，PBS洗滌2次，不含有EDTA胰酶消化，冷PBS洗滌，收集細胞，加入100 μL的結合緩沖液懸浮細胞，5 μL的Annexin V-FITC并充分混勻，再加入5 μL的PI并混勻，室溫、避光條件下反應10 min后，用流式檢測專用的試管收集標本并上機檢測， 最后置于熒光顯微鏡下觀察各組細胞形態學變化：早期凋亡細胞呈現核濃縮伴隨染色加深，或核染色質呈新月形聚集于核膜一邊；晚期的凋亡細胞則表現為核碎裂成大小不等的圓形小體，并被細胞膜所包繞，即凋亡小體。凋亡率計算方法：在200×視野下隨機找5個視野觀測，每個視野計數200個細胞，以計算平均凋亡細胞數所占百分比作為細胞凋亡率，實驗重復5次，取平均值。

1.5 各組細胞NF-κB p65、總蛋白cyclin D1、cleaved-caspse 3蛋白檢測 采用Western blotting法。取給藥48 h對數生長期B組、對照組及空白組細胞，4 ℃預冷PBS洗滌3次，使用裂解液裂解細胞，1 500 r/min離心15 min,采用BCA法提取細胞總蛋白，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。以3∶1體積比與上樣緩沖液混合,取20μL蛋白樣品上樣。濃縮膠電泳電壓為80 V,分離膠為130 V,電泳4 h后用PVDF膜半干轉，轉膜1.5 h。然后PVDF膜用含5%脫脂奶粉的PBS液封閉1 h，H3、NF-κB p65、,CyclinD1、β-actin和cleaved-caspase 3抗體用5%牛奶稀釋(1∶1 000)后，4 ℃過夜，TBST洗膜，5%的牛奶稀釋的辣根過氧化物酶標記的兔抗羊二抗，洗膜，按照ECL說明書，1∶1配置發光工作液，超敏化學發光法顯色,凝膠分析系統分析記錄條帶光密度。用Image J軟件進行分析,以相應目的蛋白條帶的積分光密度值與β-actin或H3的比值表示檢測蛋白的相對表達量。實驗重復3次，取平均值。

2 結果

2.1 各組細胞增殖抑制率比較 不同給藥時間各組細胞增殖抑制率比較見表1。

表1 不同給藥時間各組細胞增殖抑制率比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05；與A組比較，&P<0.05；與前一給藥時間比較，△P<0.05。

2.2 各組細胞凋亡率比較 不同給藥時間各組細胞凋亡率比較見表2。

表2 不同給藥時間各組細胞凋亡率比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05；與A組比較，&P<0.05；與前一給藥時間比較，△P<0.05。

2.3 各組細胞NF-κB p65、cleaved-caspase 3及Cyclin D1蛋白相對表達量比較 前期實驗證實高劑量TAK-242對SKOV-3細胞增殖、凋亡的影響更明顯，僅用B組細胞進行機制探討。各組細胞p65、cleaved-caspase 3及cyclin D1蛋白相對表達量比較見表3。

表3 給藥48 h時各組細胞NF-κB p65、cleaved-caspase 3及cyclin D1蛋白相對表達量比較

注：與空白組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05。

3 討論

TLR4屬于一型跨膜蛋白[10]，在結構上由胞外區、跨膜區和胞內區三部分組成。隨著研究的深入，發現TLR4在促進細胞因子的合成與釋放，引發炎癥反應；促進免疫細胞膜表面表達相關免疫分子，促進免疫細胞的成熟和功能化；抗病毒感染；調節免疫應答；介導全身免疫病理損傷，以及其家族間的協同作用影響免疫應答等方面起到重要的作用。TLR4信號通路的傳導主要包括髓樣分化因子(MyD88)非依賴性和MyD88依賴性兩條信號通路，前者不依賴于MyD88蛋白的激活作用，主要通過IRF-3來延遲性激活NF-κB的活性；后者主要通過MyD88的激活，從而快速的上調NF-κB的活性。NF-κB是卵巢癌發病機制中的重要參與者，抑制NF-κB的活性可以抑制卵巢癌細胞的增殖和促進其凋亡[11]。在正常條件下，NF-κB主要通過與其抑制性亞單位IκBα結合存在于胞漿中，當TLR4介導的信號通路傳導至IκBα時，可以使IκBα發生泛素化降解，脫離IκBα束縛的NF-κB p65從胞漿中轉位至胞核內，并與特異的靶基因序列結合，從而調控下游相關目的基因cyclin D1和cleaved-caspase 3蛋白的表達[11]。在以往研究中發現，TLR4在卵巢癌腫瘤標本中的表達明顯升高，并與卵巢癌患者的病情進展存在顯著相關性[13]，使用抑制TLR4表達的藥物可以顯著抑制NF-κB的活性，從而抑制卵巢癌細胞的增殖和促進凋亡，提示TLR4有可能成為卵巢癌治療的重要靶點。TAK-242是TLR4的特異性抑制劑[14]，目前證實其在體外細胞培養實驗中具有抗腫瘤作用，但是對于其在卵巢癌細胞增殖和凋亡中的作用目前相關報道卻不多。

本研究結果表明，給藥24、48、72 h時，A、B組細胞增殖抑制率、凋亡率均高于對照組、空白組；給藥24、48、72 h時， B組細胞增殖抑制率均高于A組；隨給藥時間增加，B組細胞增值抑制率、凋亡率升高。說明TAK-242可抑制卵巢癌細胞的增殖、促進細胞凋亡，并呈現劑量依賴性。在后續研究中，本研究對其機制進行了進一步探討，研究結果表明，TAK-242可以顯著抑制核內轉錄因子p65蛋白的表達水平。caspase 3是卵巢癌發生細胞凋亡過程中的關鍵性調節蛋白[12]，caspase 3蛋白的表達受NF-κB的調節[13]，其主要通過裂解后的cleaved-caspase 3成熟體發揮作用，因此本研究進一步探討了TAK-242對于cleaved-caspase 3蛋白表達的影響，結果表明，TAK-242可以顯著增加cleaved-caspase 3蛋白的表達水平，這可能是其發揮促凋亡的機制之一。Cyclin D1是卵巢癌細胞增殖的關鍵調節蛋白[14]，其表達同樣受NF-κB的調節[15]。因此，本研究探討了TAK-242對cyclin D1蛋白表達的影響，結果表明，TAK-242可以顯著抑制cyclin D1蛋白的表達，提示這可能是TAK-242抑制卵巢癌細胞增殖的機制之一。

綜上所述，TAK-242可抑制人卵巢癌細胞的增殖、促進細胞凋亡，其機制可能為抑制NF-κB信號通路。但本研究僅為體外細胞培養實驗，未來需在動物實驗中進一步去驗證TAK-242對人卵巢癌細胞增殖、凋亡的影響。

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劉玉華(E-mail: weiweijudy@163.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.010

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A

1002-266X(2017)19-0037-03

2016-10-24)