長鏈非編碼RNA CCAT1對人宮頸癌細胞株HeLa增殖的影響及其機制

周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫院，貴州黔西南州562400)

·基礎研究·

長鏈非編碼RNA CCAT1對人宮頸癌細胞株HeLa增殖的影響及其機制

周白云，郭永利，王卓，王文琴

(黔西南州人民醫院，貴州黔西南州562400)

目的 觀察長鏈非編碼RNA (LncRNA)CCAT1對宮頸癌細胞株HeLa增殖的影響，并探討其可能作用機制。方法 ①過表達、抑制CCAT1表達對HeLa增殖的影響：取對數生長期HeLa細胞分為1、2、3、4組，分別轉染pcDNA3.1- CCAT1過表達慢病毒、pcDNA3.1對照慢病毒、siRNA、CCAT1-siRNA，別于轉染0、24、48 h時采用 CCK8法觀察各組細胞增殖情況。②HeLa細胞CCAT1互補microRNA分子分析：采用核質分離實驗分析CCAT1的細胞定位，網站預測并分析與CCAT1互補配對的microRNA分子。③LncRNA CCAT1靶向microRNA分子分析：取HeLa細胞分為A、B、C組，分別轉染亂序無意義序列、CCAT1-siRNA、pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒。轉染48 h采用熒光定量PCR方法檢測各組細胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543 。④細胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA檢測：取HeLa細胞，分為甲、乙、丙、丁、戊組，分別轉染亂序無意義序列、CCAT1-siRNA、CCAT1-siRNA+ miR-181a-5p inhibitor(miR-181a-5p抑制劑)、pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒、pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒+ miR-181a-5p mimic(miR-181a-5p類似物)。轉染48 h采用熒光定量PCR法檢測各組細胞RASSF1A 、cyclin D1 的RNA表達。結果 轉染24、48 h時，1組細胞增殖OD值小于2組,3組細胞增殖OD值高于4組(P均<0.05)。與CCAT1互補的前6位microRNA分別為miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543。轉染48 h時B組miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p相對表達量均高于A、C組，C組miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295相對表達量均低于A組(P均<0.05)。轉染48 h時，乙組RASSF1A相對表達量低于、cyclin D1 mRNA相對表達量高于甲組，丁組RASSF1A相對表達量高于、cyclin D1 mRNA相對表達量低于甲組(P均<0.05)；丙、丁、戊組RASSF1A相對表達量高于、cyclin D1 mRNA相對表達量低于乙組(P均<0.05)；丁組RASSF1A相對表達量高于、cyclin D1 mRNA相對表達量低于丙組(P均<0.05)；戊組RASSF1A相對表達量低于、cyclin D1 mRNA相對表達量高于丁組(P均<0.05)。結論 CCAT1可抑制HeLa細胞的增殖。其機制可能為CCAT1上調RASSF1A表達、抑制cyclin D1轉錄。CCAT1通過與miR-181a-5p互補配對調控RASSF1A、cyclin D1的表達。

宮頸腫瘤；宮頸癌；長鏈非編碼RNA；長鏈非編碼RNA CCAT1

宮頸癌是常見的婦科生殖道腫瘤之一，HPV持續感染被認為是宮頸癌的主要危險因素[1，2]。隨著宮頸癌篩查技術的進步及普及，全球宮頸癌病死率持續下降，但發展中國家的病死率仍位居女性癌癥病死率首位[3]。宮頸癌發病的具體機制尚不清楚，手術及放化療是其常用的治療方法，但效果均不佳。個體化治療是一種新興的腫瘤治療方法，使腫瘤基因、治療靶點成為目前的研究熱點。非編碼基因[4，5]主要分為microRNA、piRNA、tRNA、長鏈非編碼RNA(LncRNA)等[6，7]。目前關于宮頸癌相關的microRNA相關研究較多[8～10]，但關于LncRNA在宮頸癌中的相關報道較少。CCAT1是一種LncRNA，位于8號染色體8q24.21區，且在物種間具有較好的保守性，該區域具有眾多的染色體變異位點，并與前列腺癌[11～14]、結腸癌、淋巴系統腫瘤的發生發展有關。我們前期研究發現，宮頸癌組織中CCAT1低表達，但其在宮頸癌發生發展中的具體作用機制尚不明確。我們觀察了CCAT1對宮頸癌HeLa細胞增殖的影響，并探討其可能作用機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、試劑及儀器 人宮頸癌HeLa細胞株購自上海中科院生化細胞所細胞庫，培養基為DMEM basic 培養基+10%胎牛血清+雙抗，pcDNA3.1- CCAT1過表達慢病毒的啟動子采用CMV，由澤恒生物技術有限公司構建，CCAT1-siRNA由廣州銳博生物技術有限公司合成。 siRNA瞬時轉染均采用Invitrogen公司的Lipofectamine3000包裹。細胞CO2培養箱購Forma Scientific，熒光定量PCR的熒光染料采用TAKAT SYBR Green，熒光定量PCR儀采用Bio-Rad公司CFX96。Ki67抗體(abcam公司ab15580)，CCK8試劑盒(日本同仁公司JE603)，CCK8檢測酶標儀采(Bio-Rad公司Model 550)，核質分離試劑盒(碧云天核蛋白提取試劑盒P0028)，RNA提取采用TaKaRa公司TRIzol試劑，逆轉錄試劑盒購自TaKaRa公司，引物由上海生工生物技術有限公司合成。microRNA、inhibitor由廣州銳博公司合成。

1.2 CCAT1對HeLa細胞增殖的影響

1.2.1 促進CCAT1表達對HeLa細胞增殖的影響觀察 取對數生長期HeLa細胞株分為1、2組，培養至細胞密度約70%時換為無血清培養基饑餓2 h, 1、2組分別轉染pcDNA3.1- CCAT1過表達慢病毒、pcDNA3.1空載體慢病毒。將轉染后細胞置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。分別于轉染0、24、48 h時采用 CCK8法檢測兩組細胞增殖情況，采用熒光酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。

1.2.2 抑制CCAT1表達對HeLa細胞增殖的影響觀察 取對數生長期HeLa細胞株分為3、4組，培養至細胞密度約70%時換為無血清培養基饑餓2 h, 3、4組分別轉染CCAT1-siRNA、siRNA對照亂序。將轉染后細胞置于5% CO2、37 ℃培養箱中培養。分別于轉染0、24、48 h時采用 CCK8法檢測兩組細胞增殖情況，采用熒光酶標儀檢測450 nm處光密度(OD)值。

1.3 HeLa細胞CCAT1互補microRNA分子分析 采用核質分離實驗[15]分析CCAT1的細胞定位，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。采用starbase V2.0(http://starbase.sysu.edu.cn/)網站分析與CCAT1互補配對的microRNA分子。

1.4 LncRNA CCAT1靶向microRNA分子分析 取對數生長期HeLa細胞，分為A、B、C組，每組5個復孔。A組為空白對照組，轉染亂序無意義序列，B組轉染CCAT1-siRNA，C組轉染pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒。轉染48 h采用熒光定量PCR方法檢測各組細胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543 表達(“1.3”中與CCAT1互補配對的microRNA前6位),所有操作均嚴格按照使用說明書進行。

1.5 各組細胞的RASSF1A 、cyclin D1 的mRNA表達檢測 補救實驗證實CCAT1與miR-181a-5p存在互補配對結合，既往研究證實miR-181a-5p可通過靶向抑癌基因RASSF1A從而發揮促進腫瘤細胞增殖[16]。取對數生長期HeLa細胞，分為甲、乙、丙、丁、戊組，每組5個復孔。甲組為空白對照組，轉染亂序無意義序列，乙組采用Lipofectamine 3000TM包裹CCAT1-siRNA轉染，丙組轉染CCAT1-siRNA+ miR-181a-5p inhibitor(miR-181a-5p抑制劑)，丁組轉染pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒，戊組轉染pcDNA3.1- CCAT1過表達的慢病毒+ miR-181a-5p mimic(miR-181a-5p類似物)。轉染48 h采用熒光定量PCR法檢測各組RASSF1A 、cyclin D1 的mRNA表達，所有操作均嚴格按照使用說明書進行。用2-ΔΔCt表示目的基因的相對表達量。以GAPDH為內參，RASSF1A上游引物5′-GACCTCTGTGGCGACTTCAT-3′；下游引物5′-CTCCACAGGCTCGTCGC-3′；cyclin D1上游引物5′-TGAGGGACGCTTTGTCTGTC-3′；下游引物5′-GCCTTTGGCCTCTCGATACA-3′； GAPDH上游引物5′-AATGGGCAGCCGTTAGGAAA-3′；下游引物5′-GCGCCCAATACGACCAAATC-3′。20 μL體系進行反轉錄，反應條件為：37 ℃、30 min，85 ℃、5 s,4 ℃。PCR體系為：10 μL SYBR染液，上下游引物各0.8 μL，模板1 μL，其余采用DEPC水補齊。反應條件：92 ℃、3 min預變性，92 ℃、30 s,58 ℃、15 s，39個循環，72 ℃、1 min,4 ℃。

2 結果

2.1 各組細胞增殖情況比較 轉染0、24、48 h各組細胞增殖情況比較見表1。

表1 轉染0、24、48 h各組細胞OD值比較

注：與2組比較，*P<0.05；與4組比較，#P<0.05。

2.2 HeLa細胞CCAT1細胞定位及互補microRNA分子分析 核質分離實驗提示 約70%CCAT1位于細胞質中，30%位于細胞核中，主要定位于細胞質中。互補microRNA分子分析結果見表2。與CCAT1互補的前6位microRNA分別為miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543。

表2 與CCAT1互補的microRNA分子分析結果

2.3 各組細胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對表達量比較 各組細胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對表達量比較見表3。

2.4 各組細胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對表達量比較 各組細胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對表達量比較，見表4。

3 討論

非編碼RNA是一大類轉錄產物不翻譯成蛋白質的核酸分子，主要包括tRNA、piRNA、microRNA、LncRNA等。其中microRNA的研究相對較多，其發揮作用的主要方式是負性調控，LncRNA是一類長度超過200 bp的轉錄本，具有來源豐富、組織特異性好、部分序列保守等特點[17]。相較于micorRNA，LncRNA的作用方式更為復雜，具有順勢(cis)調控作用和反式調控(trans)等多種調控方式，其既能位于細胞核中，也能分布于細胞質內；既可以促進轉錄，也可以抑制轉錄；既能通過分子支架作用結合蛋白質，也能通過海綿作用吸附microRNA分子[11～13]。既可以修飾蛋白質，也可以影響mRNA的成熟和穩定；既可以結合核酸，也可以結合蛋白。例如HotAir可以與PRC2復合體互作，影響組蛋白H3K27表觀遺傳學改變[18]，在肝癌、食管癌、乳腺癌、胰腺癌等疾病中發揮關鍵作用；Xist同樣也可以通過募集PRC2復合體，介導X染色體失活[19]；而H19則可以作為分子篩發揮“海綿作用”吸附microRNA分子，最終影響對應microRNA的靶mRNA分子[20]。然而，宮頸癌相關的LncRNA研究，卻知之甚少。

表3 各組細胞miR-181a-5p、miR-181b-5p、miR-4295、miR-130a-5p、miR-148b-3p、miR-543相對表達量比較

注：與A組比較，*P<0.05；與C組比較，#P<0.05。

表4 各組細胞RASSF1A 、cyclin D1 mRNA相對表達量比較

注：與甲組比較，*P<0.05；與乙組比較，#P<0.05，與丙組比較，△P<0.05；與丁組比較，##P<0.05。

本研究發現CCAT1抑制人HeLa細胞增殖，其發揮作用可能是通過與miR-181a-5p互補配對，抑制miR-181a-5p表達從而上調miR-181a-5p靶分子RASSF1A表達，進而抑制cyclin D1轉錄，最終抑制HeLa細胞增殖。為研究CCAT1在宮頸癌中的是否具有作用，我們首先在HeLa細胞針對CCAT1進行了敲降，發現HeLa細胞的增殖能力顯著上調，而過表達CCAT1將抑制HeLa細胞增殖。核質分離實驗證實，CCAT1主要定位于細胞質中，而hotair、NEAT1主要位于細胞核中，這提示CCAT1可能與某些microRNA分子具有互補配對結合的可能，由此我們通過starbase V2.0網站分析發現，CCAT1與miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p、miR-148b-3p等microRNA分子具有序列互補配對，提示存在結合的可能。進一步研究發現，敲降CCAT1后，miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p表達均上調，而過表達CCAT1則抑制miR-181b-5p、miR-181a-5p、miR-4295、miR-130a-3p的表達，也即CCAT1與以上microRNA分子具有趨勢相反的表達。其中miR-181b-5p的變化最為顯著，遠超于其余三個microRNA分子，這提示CCAT1可能主要通過影響miR-181b-5p的分子功能，發揮抑癌作用。序列互補分析提示CCAT1與miR-181b-5p具有13個堿基的互補配對，強烈提示存在直接結合的可能。既往研究表明，miR-181b-5p可以通過與抑癌基因RASSF1A的mRNA 3′UTR結合[16]，下調其mRNA表達水平，反之促進RASSF1A下游基因周期蛋白cyclin D1轉錄，加速細胞增殖。為研究CCAT1是否通過miR-181b-5p發揮抑癌基因作用，我們通過補救實驗驗證猜想。結果提示：敲降CCAT1導致的RASSF1A下調和cyclin D1上調，在給予miR-181a-5p inhibitor后，均可得到逆轉；而過表達CCAT1導致的RASSF1A上調和cyclin D1下調，在給予miR-181a-5p mimic后，同樣得到了逆轉。

綜上所述，CCAT1可抑制HeLa細胞的增殖。其機制可能為CCAT1上調RASSF1A表達、抑制cyclin D1轉錄。CCAT1通過與miR-181a-5p互補配對調控RASSF1A、cyclin D1的表達。

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10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.009

R737.33

A

1002-266X(2017)19-0033-04

2016-10-26)