轉(zhuǎn)染VEGF小干擾RNA的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、侵襲能力變化及其機(jī)制

侯保輝

(德州市市立醫(yī)院，山東德州253012)

轉(zhuǎn)染VEGF小干擾RNA的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251增殖、侵襲能力變化及其機(jī)制

侯保輝

(德州市市立醫(yī)院，山東德州253012)

目的 觀察轉(zhuǎn)染VEGF小干擾RNA(VEGF- siRNA)的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲能力的變化，并探討及其機(jī)制。方法 將體外培養(yǎng)的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組和空白組，分別用VEGF- siRNA、siRNA-NC、空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染48 h后，用CCK-8法觀察各組細(xì)胞增殖情況(以O(shè)D490表示)，用Transwell 小室實(shí)驗(yàn)觀察各組細(xì)胞侵襲能力(以穿膜細(xì)胞數(shù)表示)，用Western blotting法檢測(cè)各組細(xì)胞中的VEGF、基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B(p-AKT)蛋白表達(dá)。結(jié)果 轉(zhuǎn)染48 h后觀察組、對(duì)照組、空白組細(xì)胞VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.161±0.040、0.649±0.032、0.656±0.026；OD490分別為0.226±0.018、0.449±0.035、0.454±0.038；穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(100.61±16.90)、(284.11±13.1)、(286.18±12.24)個(gè)。觀察組細(xì)胞VEGF相對(duì)表達(dá)量、OD490、穿膜細(xì)胞數(shù)均低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)。轉(zhuǎn)染48 h后觀察組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)；觀察組細(xì)胞AKT相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組和空白組相比，P均>0.01。結(jié)論 轉(zhuǎn)染VEGF- siRNA的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲能力下降，其機(jī)制是由于轉(zhuǎn)染VEGF- siRNA抑制U251細(xì)胞MMP-2、MMP-9、AKT、p-AKT表達(dá)。

微小RNA；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；腦膠質(zhì)瘤；細(xì)胞增殖；腫瘤侵襲；基質(zhì)金屬蛋白酶；蛋白激酶B

膠質(zhì)瘤的發(fā)病由多種原癌基因和抑癌基因的功能和結(jié)構(gòu)異常引起[1～3]。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)是一種具有高特異性可促進(jìn)血管生成的生物因子，通過與血管內(nèi)皮細(xì)胞上的受體結(jié)合發(fā)揮作用[4]。目前發(fā)現(xiàn)VEGF在胃癌、膀胱癌、肺癌等腫瘤中有不同程度的異常表達(dá)[5～7]，而且VEGF在胃癌中的高表達(dá)與胃癌的侵襲和預(yù)后有關(guān)[8]。但是VEGF在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲中的作用及其機(jī)制尚不明確。小干擾RNA可以特異性的抑制目的基因表達(dá)。本研究中觀察了轉(zhuǎn)染VEGF- siRNA的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲能力和基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)、蛋白激酶B(AKT)、磷酸化蛋白激酶B表達(dá)的變化，探討VEGF在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖和侵襲中的作用及其機(jī)制。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和主要試劑、儀器 人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞購(gòu)自上海細(xì)胞庫(kù)。siRNA-NC、VEGF-siRNA購(gòu)自上海生工生物工程有限公司。Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司。胎牛血清、胰蛋白酶、青鏈霉素、RPMI1640培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco公司。CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒和BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)于美國(guó)Promega生物技術(shù)有限公司。Transwell 小室和細(xì)胞培養(yǎng)板購(gòu)于美國(guó)CORNING公司。MMP-2、MMP-9、VEGF、AKT、p-AKT單克隆抗體及辣根過氧化物標(biāo)記的二抗均購(gòu)于美國(guó) Abcam公司。組織蛋白提取試劑盒購(gòu)自北京普利萊基因技術(shù)有限公司。PCR儀和酶標(biāo)儀均購(gòu)自美國(guó)BIO-RAD公司。倒置熒光顯微鏡購(gòu)于日本Olympus公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)SIM公司。

1.2 U251細(xì)胞培養(yǎng)、分組及VEGF- siRNA轉(zhuǎn)染 取出保存于液氮罐中的人腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞，迅速放入37 ℃水浴鍋中解凍，加入含有10%FBS、100 μg/mL鏈霉素和100 U/mL青霉素的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)基，1 200 r/min離心5 min，去除上清。向細(xì)胞沉淀中加入細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37 ℃，5% CO2，95%飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)滿皿底80%以上時(shí)，棄去培養(yǎng)液。用0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞2～3 min，細(xì)胞收縮變圓后加入完全培養(yǎng)基終止消化，傳代。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后用于實(shí)驗(yàn)。

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251細(xì)胞以1×106/mL的濃度接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔加2 mL細(xì)胞懸浮液，培養(yǎng)過夜。將U251細(xì)胞分為觀察組、對(duì)照組和空白組，每組3孔。分別加入100 nmol/L的VEGF- siRNA、100 nmol/L的siRNA-NC、100 nmol/L的空脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，更換細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.3 各組細(xì)胞增殖情況觀察 采用CCK-8法。取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，每孔加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育4 h后，酶標(biāo)儀在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定并記錄各組的OD490。

1.4 各組細(xì)胞侵襲能力觀察 采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)。用無血清培養(yǎng)液按照1∶10稀釋Matrige，取100 μL加入到Transwell小室中，包被小室底部膜的上室面，放在37 ℃環(huán)境中濕化反應(yīng)3 h。取轉(zhuǎn)染后的上述三組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，Transwell小室的上室接種100 μL單細(xì)胞懸液，下室加入含有10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基0.6 mL，每組均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h后，用棉簽輕輕拭掉膜上的細(xì)胞，95%甲醇固定、臺(tái)盼藍(lán)染色后隨機(jī)選擇5個(gè)視野，顯微鏡下拍照計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。每組重復(fù)3次取平均值。

1.5 各組細(xì)胞VEGF、MMP-2、MMP-9、AKT、p-AKT檢測(cè) 采用Western blotting法。 取轉(zhuǎn)染48 h的各組U251細(xì)胞，用組織蛋白提取試劑盒提取細(xì)胞蛋白，按照BCA試劑盒說明測(cè)定提取的蛋白濃度。配置12%分離膠10 mL和5%濃縮膠5 mL，將各組蛋白樣品與Loading buffer按照1∶1的比例充分混勻，100 ℃煮沸5 min變性，每孔50 μL加入到SDS-PAGE凝膠上樣孔中進(jìn)行電泳和轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗4 ℃過夜。TBST清洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶1 000稀釋)，37 ℃孵育2 h，TBST清洗后加入ECL發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。以GAPDH作為內(nèi)參，各組細(xì)胞VEGF、MMP-2、MMP-9、AKT、p-AKT相對(duì)表達(dá)量以相應(yīng)蛋白條帶灰度值和GAPDH條帶灰度值之比表示。

2 結(jié)果

轉(zhuǎn)染48 h后觀察組、對(duì)照組、空白組細(xì)胞VEGF蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.161±0.040、0.649±0.032、0.656±0.026。觀察組細(xì)胞VEGF相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)，對(duì)照組和空白組細(xì)胞VEGF相對(duì)表達(dá)量相比P>0.01。

2.1 各組細(xì)胞OD490比較 轉(zhuǎn)染48 h后觀察組、對(duì)照組、空白組細(xì)胞OD490分別為0.226±0.018、0.449±0.035、0.454±0.038。觀察組細(xì)胞OD490低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)，對(duì)照組和空白組細(xì)胞OD490相比P>0.01。

2.2 各組穿膜細(xì)胞數(shù)比較 轉(zhuǎn)染48 h后觀察組、對(duì)照組、空白組穿膜細(xì)胞數(shù)分別為(100.61±16.90)、(284.11±13.1)、(286.18±12.24)個(gè)。觀察組細(xì)胞侵襲數(shù)低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)，對(duì)照組和空白組細(xì)胞細(xì)胞侵襲數(shù)相比P>0.01。

2.3 各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT表達(dá)比較 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT相對(duì)表達(dá)量見表1。由表1可見，對(duì)照組和空白組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT相對(duì)表達(dá)量相比，P均>0.01；觀察組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照組和空白組(P均<0.01)；觀察組細(xì)胞AKT相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組和空白組相比，P均>0.01。

表1 轉(zhuǎn)染48 h后各組細(xì)胞MMP-2、MMP-9、p-AKT、AKT相對(duì)表達(dá)量比較

注：與對(duì)照組和觀察組相比，*P<0.01。

3 討論

膠質(zhì)瘤是常見的顱內(nèi)惡性腫瘤。雖然隨著醫(yī)療技術(shù)的改進(jìn)出現(xiàn)了很多膠質(zhì)瘤的治療方法，但治療效果并沒有顯著提高。目前普遍認(rèn)為膠質(zhì)瘤治療困難是由于其較高的增殖、遷移和侵襲能力[9]。因此，尋找與膠質(zhì)瘤增殖、遷移、侵襲能力相關(guān)的基因，從而尋找腦膠質(zhì)瘤的靶向治療藥物具有重要意義。

腫瘤是機(jī)體在各種致癌因素的作用下，局部組織的細(xì)胞在基因水平上失去了正常控制，導(dǎo)致異常增殖的結(jié)果。在這一過程中，誘導(dǎo)更多的血管生成是腫瘤生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移及浸潤(rùn)的前提[10]。VEGF是一種具有分泌特性的外分泌蛋白，其家族成員有VEGF A-E、PLGF和svVEGF，其中VEGF-A作用最強(qiáng)，也就是所說的VEGF，它能與特定的受體結(jié)合，引起多種信號(hào)通路的激活，從而促進(jìn)血管通透性增加、新生血管形成及血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，引起細(xì)胞的遷移[11,12]。在正常人體內(nèi)VEGF的作用是促進(jìn)組織和器官的發(fā)育，而在許多腫瘤中VEGF高表達(dá)卻加速了腫瘤的進(jìn)展[13]。研究顯示，VEGF在卵巢癌中高達(dá)，沉默VEGF的表達(dá)后可顯著抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡[14]。在膽管癌中抑制VEGF的表達(dá)能限制抑制膽管癌細(xì)胞的增殖和侵襲[15]。在腦膠質(zhì)瘤的研究中發(fā)現(xiàn)VEGF參與了腦膠質(zhì)瘤的血管生成和腦水腫的發(fā)生[16]，但VEGF與腦膠質(zhì)瘤的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移的關(guān)系目前尚不完全清楚。

RNA干擾是一種能使序列在特異性轉(zhuǎn)錄后沉默的技術(shù)，具有高度特異性、高效性、高穩(wěn)定性的特點(diǎn)。方法是通過將外源的雙鏈小分子RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞，通過與目的基因mRNA 特異性結(jié)合并使之降解，使目的基因表達(dá)下降，廣泛用于研究基因功能[17]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA的觀察組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF表達(dá)和細(xì)胞增殖、侵襲能力與對(duì)照組和空白組相比顯著降低。這說明轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA可以沉默腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞VEGF的表達(dá)，同時(shí)顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。

MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)中的各種蛋白成分，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲的組織學(xué)屏障被破壞，從而使腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移。在MMPs蛋白中，MMP-2和MMP-9與基底膜的降解直接相關(guān)，其能影響腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后[18,19]。AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，約含480個(gè)氨基酸殘基，又稱蛋白激酶B，是生物體內(nèi)重要的生存信號(hào)通路，是磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)下游的效用分子，與腫瘤的發(fā)生、增殖、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[20,21]。且有研究顯示，VEGF參與調(diào)控AKT信號(hào)通路，與腫瘤的生物學(xué)特性密切相關(guān)[22]。本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染VEGF-siRNA的觀察組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中VEGF、MMP-2、MMP-9、p-AKT表達(dá)均低于對(duì)照組和空白組，但是觀察組腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中AKT蛋白表達(dá)與對(duì)照組和空白組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這可能是p-AKT起了作用，因此，筆者推測(cè)MMP-2、MMP-9、p-AKT是VEGF調(diào)控腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、侵襲能力的中間分子。轉(zhuǎn)染VEGF- siRNA的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞增殖、侵襲能力下降的機(jī)制是由于轉(zhuǎn)染VEGF- siRNA抑制U251細(xì)胞VEGF表達(dá)，進(jìn)而下調(diào)MMP-2、MMP-9、AKT、p-AKT表達(dá)。

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Changes of proliferation and invasion of glioma U251 cells transfected with VEGF small interfering RNA

HOUBaohui

(DezhouMunicipalHospital,Dezhou253012,China)

Objective To investigate the changes of proliferation and invasion of glioma U251 cells transfected with vascular endothelial growth factor (VEGF) siRNA (VEGF-siRNA) and its mechanism. Methods Human glioma U251 cells were divided into the observation group, control group, and blank group which were transfected with VEGF-siRNA, siRNA-NC, and empty plasmid for 48 h, respectively. CCK-8 method was used to observe the proliferation of cells in each group (expressed in OD490), Transwell chamber was used to observe the invasion ability of each group (expressed as a number of transmembrane cells), Western blotting was used to detect the protein expression of matrix metalloproteinase 2 (MMP-2), matrix metalloproteinase 9 (MMP-9), protein kinase B (AKT) and phosphorylated protein kinase B (p-AKT). Results At 48 h after transfection, the observation group had significantly lower VEGF protein expression levels, OD490and smaller number of transmembrane cells than the control group and blank group (VEGF protein expression: 0.161±0.040 vs 0.649±0.032 and 0.656±0.026, OD490: 0.226±0.018 vs 0.449±0.035 and 0.454±0.038, the number of transmembrane cells: 100.61±16.90 vs 284.11±13.1 and 286.18±12.24; allP<0.01). The expression of MMP-2, MMP-9 and p-AKT in the observation group was lower than that of the control group and the blank group at 48 h after transfection (allP<0.01). No significant difference was found in the expression of AKT between the observation group and the control group, the blank group, allP>0.01.Conclusion The proliferation and invasion abilities of glioma U251 cells transfected with VEGF-siRNA decrease by inhibiting the expression of MMP-2, MMP-9, AKT, and p-AKT.

microRNA; vascular endothelial growth factor; glioma; cell proliferation; tumor invasion; matrix metalloproteinase; protein kinase B

侯保輝(1970-)，男，本科，副主任醫(yī)師，主要研究方向?yàn)樯窠?jīng)外科。郵箱：hod_689@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.008

R739.41

A

1002-266X(2017)19-0029-04

2016-11-11)