Matrigel三維細胞培養方法培養的原代乳腺癌細胞生長情況及對阿霉素敏感性觀察

張震，齊曉敏，張薇，張培，曹旭晨，肖春花

(1天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心,天津300060；2天津市“腫瘤防治”重點實驗室；3天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心；4乳腺癌防治教育部重點實驗室)

Matrigel三維細胞培養方法培養的原代乳腺癌細胞生長情況及對阿霉素敏感性觀察

張震1,2,3，齊曉敏1,2,3，張薇1,2,3，張培1,2,3，曹旭晨1,2,3，肖春花1,2,3

(1天津醫科大學腫瘤醫院，國家腫瘤臨床醫學研究中心,天津300060；2天津市“腫瘤防治”重點實驗室；3天津市惡性腫瘤臨床醫學研究中心；4乳腺癌防治教育部重點實驗室)

目的 觀察Matrigel三維細胞培養方法培養的原代乳腺癌細胞生長情況及其對阿霉素的敏感性。方法 分別采用二維單層培養法、Matrigel三維細胞培養方法培養原代乳腺癌細胞。在培養的第1、3、5、7天，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察二維單層培養及三維培養條件下的原代乳腺癌細胞形態， 采用CellTiter-Glo?發光法觀察細胞生長增殖情況及其對阿霉素的敏感性，繪制原代乳腺癌細胞生長曲線及藥敏曲線。結果 二維單層培養的原代乳腺癌細胞貼壁生長，癌細胞聚集成巢狀，呈多種形態。三維細胞培養的原代乳腺癌細胞聚集成緊密的多腫瘤細胞微球。二維單層培養第1、3、5、7天原代乳腺癌細胞的增殖倍數分別為1.00±0.00、1.39±0.29、2.08±0.25、3.26±0.41；三維培養第1、3、5、7天原代乳腺癌細胞的增殖倍數分別為1.00±0.00、1.25±0.08、1.79±0.10、1.58±0.02。隨阿霉素濃度升高，二維單層培養及三維培養下的原代乳腺癌細胞增殖抑制率增高。但三維細胞培養的原代乳腺癌細胞增殖抑制率均低于二維細胞培養。結論 Matrigel三維細胞培養的原代乳腺癌細胞可聚集成緊密的球形，細胞增殖速度變慢，對阿霉素的敏感性降低。Matrigel三維細胞培養原代乳腺癌細胞效果較好。

乳腺腫瘤；乳腺癌；Matrigel三維細胞培養方法；細胞形態；細胞增殖；藥物敏感性

乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤，病死率占女性癌癥死亡原因的15%[1]。對腫瘤組織進行藥物敏感性檢測，根據檢測結果對患者進行個體化用藥是目前的研究熱點。二維單層細胞培養是傳統的藥物敏感性檢測方法。人體組織和器官是以三維結構的形式存在并發揮功能。研究[2～4]證實，與人體組織中三維結構細胞相比，二維環境中培養形成的單層細胞的組織特異性結構、生物學行為、細胞間及細胞與胞外基質之間的相互作用明顯缺失。三維細胞培養技術是通過讓細胞聚集成細胞球或將細胞包裹到在成分及結構上類似于實體組織的細胞外基質中，一定程度模擬了細胞在生物體內的生存狀態[5, 6]，目前已經被用于腫瘤細胞系的生長及耐藥性研究中[7～9]。關于三維環境下培養的原代乳腺癌細胞的生長情況、藥物敏感性方面的相關報道較少。本研究觀察了Matrigel三維細胞培養方法培養的乳腺癌細胞的形態、增殖及藥物敏感性變化。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與材料 乳腺癌組織取自天津醫科大學腫瘤醫院經手術切除并病理確診的乳腺癌標本，患者術前均未經過放化療，DMEM培養基、青鏈霉、HEPES、Ⅰ型膠原酶、0.25%胰酶均購自美國Gibico公司，胎牛血清購自蘭州百靈公司，表皮生長因子購自R&D systems公司，Matrigel基質膠購自美國BD公司，CellTiter-Glo?發光法檢測試劑盒購自美國Promega公司。

1.2 原代乳腺癌細胞培養方法的建立及純化 取適量乳腺癌組織，用無菌手術剪刀將組織剪碎至1 mm3，PBS沖洗，棄上清，加入2% Ⅰ型膠原酶，37 ℃孵箱消化15 h。取消化后的組織，40 g 離心1 min，取上清，100 g離心2 min；棄上清，取下層沉淀用原代培養基重懸培養。此時腫瘤細胞和成纖維細胞混雜生長，腫瘤細胞呈巢狀分布。培養至細胞匯合度70%左右時0.05%胰酶消化約8 min，棄上清，加入10%原代培養基繼續培養，重復差異消化1次，得到純度約70%的原代乳腺癌細胞，備用。

1.3 原代乳腺癌細胞的Matrigel三維細胞培養方法 在冰盒上用預冷槍頭緩慢吸取30 μL Matrigel基質膠(4 ℃預冷過夜后解凍)，加入96孔板，37 ℃培養箱靜置30 min，使Matrigel凝固。取生長狀態良好的原代乳腺癌細胞，0.05%胰酶消化，原代培養基終止消化并反復吹打均勻，400目過濾網過濾3次，計數板行臺酚藍活細胞計數。調整細胞濃度至50 000/mL，吹打均勻后取100 μL細胞懸液，緩慢加入到凝固Matrigel基質膠上。37 ℃孵育30 min。將Matrigel基質膠與原代培養基按照體積比1∶10混合，輕柔混合均勻，將Matrigel-培養基混合物緩慢加至96孔板中。放入細胞培養箱培養。2天更換1次上層Matrigel-培養基混合物，備用。

1.4 細胞生長情況觀察

1.4.1 原代乳腺癌細胞形態觀察 在培養第3天時，分別取“1.2”中原代乳腺癌細胞、“1.3”中三維培養的原代乳腺癌細胞，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察細胞形態。

1.4.2 原代乳腺癌細胞增殖情況觀察 分別取“1.2”中純化的原代乳腺癌細胞、“1.3”中三維培養的原代乳腺癌細胞，調整細胞濃度至20 000/mL，各取96孔板，鋪12個復孔。每孔取100 μL細胞懸液，加入100 μL原代培養基培養。分別在第1、3、5、7天，各取3個復孔采用CellTiter-Glo?發光法測量原代乳腺癌細胞的增殖倍數。取出CellTiter靜置至室溫，室溫靜置30 min后取細胞，棄上清，每孔加入100 μL 10% DMEM，加入100 μL CellTiter試劑，震蕩2 min使其充分反應，靜置10 min，檢測RLU值(代表乳腺癌細胞增殖倍數)，并繪制原代乳腺癌細胞生長曲線。

1.5 原代乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性檢測 分別取“1.2”中純化的原代乳腺癌細胞、“1.3”中三維培養的原代乳腺癌細胞，取96孔板，分別將細胞分為A組、B組、C組、對照組，每組3個復孔，每孔加入100 μL細胞懸液。第2天向A、B、C組分別加入0.15 、1.5 、15 μg/mL的阿霉素，對照組加入100 μL原代培養基。置于培養箱中繼續培養48 h后，采用Olympus Ⅸ70倒置顯微鏡觀察各組細胞形態變化，采用CellTiter-Glo?發光法檢測不同患者來源的各組細胞增殖抑制率(代表原代乳腺癌細胞對其阿霉素的敏感性)，所有操作方法均嚴格按照使用說明書進行。

2 結果

2.1 原代乳腺癌細胞形態 在二維單層培養條件下，乳腺癌細胞貼壁生長，癌細胞聚集成巢狀，呈多種形態，包括梭形、多邊形、不規則形。三維環境中的乳腺癌細胞聚集成緊密的球形。見圖1。

注：A 原代乳腺癌細胞在二維單層培養條件下，細胞貼壁生長，呈梭形、多邊形、不規則形。B原代乳腺癌細胞在三維培養條件下，細胞聚集并增殖形成緊密的球形。

圖1 二維單層培養及三維培養條件下的原代乳腺癌細胞形態

2.2 原代乳腺癌細胞增殖情況比較 二維單層培養第1、3、5、7天原代乳腺癌細胞的增殖倍數分別為1.00±0.00、1.39±0.29、2.08±0.25、3.26±0.41；三維培養第1、3、5、7天原代乳腺癌細胞的增殖倍數分別為1.00±0.00、1.25±0.08、1.79±0.10、1.58±0.02。二維單層培養及三維培養條件下的原代乳腺癌細胞生長曲線見圖2。

圖2 二維單層培養及三維培養條件下的原代乳腺癌細胞生長曲線

2.3 原代乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性比較 二維和三維培養條件下原代乳腺癌細胞的細胞形態改變見圖3。納入乳腺癌標本最終僅培養成功4例份。培養48 h各組細胞增殖抑制率比較見表2。

3 討論

在1983年，有學者[10]首次將體外藥物敏感實驗同患者對藥物的反應進行了前瞻性實驗，由于當時的培養條件限制及患者例數的不足，藥敏實驗的假陰性率及假陽性率均較高。然而，人們對于腫瘤組織藥物敏感性檢測的探索從未停止，試圖通過體外藥敏結果指導患者的臨床用藥，進行個體化治療，減少患者不必要的經濟損失及健康損害。當前，我們對藥物敏感性檢測主要基于兩種模式——二維條件下的細胞培養以及動物模型實驗。雖然動物實驗是公認的體外藥敏檢測的金標準，但因其周期長和倫理問題等原因在預測患者藥物敏感性的應用中受到限制。傳統的二維單層細胞培養，細胞在培養皿中貼壁生長，不能真正反映組織生理狀態下的復雜性，以此為基礎的細胞學功能試驗一定程度上錯誤的評估了組織的特異性應答反應。二維環境下的單層細胞主要是進行細胞去分化的細胞增殖，喪失了細胞本來的功能[11,12]。相反，在三維環境中培養的細胞在細胞增殖、分化、形態及功能等方面表現出與體內更高的相似性，從而替代一些動物實驗[13]，搭建了二維細胞培養與動物實驗之間的橋梁。

注：A 二維單層培養對照組細胞貼壁生長，呈多邊形、梭形；B 二維單層培養A組癌細胞匯合度低；C二維單層培養B組癌細胞大量死亡，僅有少量細胞存活，且細胞形態不規則，細胞活力差；D二維單層培養中C組細胞大量死亡，細胞結構消失，失去細胞形態；E 三維培養對照組細胞聚集成球狀；F三維培養A組三維乳腺癌多細胞球的形態、大小及數量變化不明顯；G三維培養B組癌細胞球結構變得松散，呈葡萄狀；H三維培養C組多細胞球結構更加松散，細胞離散，可見細胞碎片。

圖3 二維和三維培養條件下原代乳腺癌細胞形態改變

表2 培養48 h各組細胞增殖抑制率比較

本研究構建了原代乳腺癌細胞的二維單層培養及Matrigel三維培養的方法，原代乳腺癌細胞在三維環境中形成緊密的細胞球，生長緩慢。研究認為，三維環境下細胞聚集成多腫瘤細胞微球體(MCTS)，處于快速增殖期的癌細胞位于微球體最外層，而微球體中心則出現缺氧及營養物質供應不充分，中心的細胞主要處于靜止期，甚至為壞死細胞[14]。我們的結果發現，三維環境中細胞在初始階段緩慢增長，隨著培養時間的延長，細胞數量出現下降趨勢。我們認為這是由于在三維環境中腫瘤細胞形成緊密的細胞球，隨著培養時間的延長，細胞增殖細胞球體積增大，處于多細胞球中心的細胞則由于缺少氧氣及營養物質，發生壞死，從而引起活細胞數減少。這與體內的腫瘤組織中的微環境非常相似，尤其是在腫瘤發生的早期血管生成之前的階段，腫瘤組織中心的癌細胞處于缺血缺氧的狀態，營養物質及氧氣供應不充分，代謝廢物排出障礙，局部微環境不適宜細胞生存，細胞生長緩慢甚至發生壞死，處于腫瘤組織與正常組織交界處的腫瘤細胞則生長最活躍。此外，對卵巢癌的31個細胞系進行三維培養發現，三維環境下主要可以形成三種形態：大的致密球形、大的疏松球形、小的聚集物，且結構不同可能影響細胞對藥物的敏感性。

本研究結果采用CellTiter-Glo?發光法進行原代乳腺癌細胞的藥物敏感性檢測，比傳統的MTT法、CCK8法更靈敏，適用于二維單層細胞及三維細胞球。結果顯示，同傳統二維單層細胞培養條件相比，三維環境下原代乳腺癌細胞對阿霉素的敏感性下降，表現出對阿霉素耐受性增加。Lee等[15]報道，1847AD、FUOV1、OV2008等細胞系在三維環境中對藥物耐受性增加，同時發現三維培養環境下形成的多腫瘤細胞微球中，腫瘤細胞的分化程度與腫瘤組織相似性更高，認為三維環境中的藥物敏感性檢測的實驗結果能更真實的反應活體內細胞的藥物耐受性。對于三維環境中腫瘤細胞對藥物耐受性增加的機制，目前還不是十分清楚，但是已經引起了廣泛地關注，已有文獻報道可能同基因的改變、缺氧、細胞外基質的調控等有關[16]，其具體機制還有待后續進一步研究探索。

綜上所述，Matrigel三維細胞培養的原代乳腺癌細胞可聚集成緊密的球形，細胞增殖速度變慢，對阿霉素的敏感性降低。Matrigel三維細胞培養原代乳腺癌細胞效果較好。

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Growth of primary breast cancer cells cultured by Matrigel three-dimensional cell culture method and its sensitivity to adriamycin

ZHANGZhen1,QIXiaomin,ZHANGWei,ZHANGPei,CAOXuchen,XIAOChunhua

(1TianjinMedicalUniversityCancerInstituteandHospital,NationalClinicalResearchCenterforCancer,Tianjin300060,China)

Objective To observe the growth of primary breast cancer cells cultured in Matrigel three-dimensional cell culture method and its sensitivity to adriamycin. Methods The primary breast cancer cells were cultured by two-dimensional monolayer culture and Matrigel three-dimensional cell culture methods. On the 1st, 3rd, 5th and 7th day of culture, Olympus IX70 inverted microscope was used to observe the morphology of primary breast cancer cells under the condition of two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture. CellTiter-Glo?Luminescent Cell Viability Assay was applied to observe the cell proliferation and its sensitivity to adriamycin. Primary breast cancer cell growth curve and drug sensitivity curve were drawn based on the observation results. Results The primary breast cancer cells with two-dimensional monolayer culture were in adherent growth, and the cancer cells gathered like a nest, with a variety of forms. The primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture gathered into close multi-tumor cell microspheres. The proliferation of primary breast cancer cells cultured by two-dimensional monolayer culture on the 1st, 3rd, 5th and 7th day was 1.00±0.00, 1.39±0.29, 2.08±0.25 and 3.26±0.41. The proliferation of primary breast cancer cells cultured by Matrigel three-dimensional cell culture was 1.00±0.00, 1.25±0.08, 1.79±0.10 and 1.58±0.02. With the increase of adriamycin concentration, the inhibition rate of proliferation of primary breast cancer cells increased under two-dimensional monolayer culture and three-dimensional culture. But the proliferation inhibition rate of primary breast cancer cells with three-dimensional cell culture was lower than that with two-dimensional cell culture. Conclusion The primary breast cancer cells with Matrigel three-dimensional cell culture can gather into close spheres, the cell proliferation rate slows down, and the sensitivity of adriamycin decreases. Matrigel three-dimensional cell culture is better for culturing primary breast cancer cells.

breast neoplasms; breast carcinama; Matrigel three-dimensional cell culture method; cell morphology; cell proliferation; drug sensitivity

中國醫學基金會腫瘤預防與科研項目(314.2222)。

張震(1990-)，男，碩士研究生在讀，主要研究方向為乳腺腫瘤外科。E-mail: zzhen2015@163.com

肖春花(1971-)，女，碩士研究生導師，主任醫師，主要研究方向為乳腺腫瘤外科、乳腺疾病早期診斷及乳腺癌保乳手術和一期乳房重建手術。E-mail: xxcchh2002@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.005

R734.2

A

1002-266X(2017)19-0017-04

2016-10-18)