參杞強精膠囊灌胃對大鼠生精功能損傷的治療作用觀察

劉倩，田元春，賓彬，陸海旺

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧530023)

參杞強精膠囊灌胃對大鼠生精功能損傷的治療作用觀察

劉倩，田元春，賓彬，陸海旺

(廣西中醫藥大學第一附屬醫院，南寧530023)

目的 觀察參杞強精膠囊灌胃對大鼠生精功能損傷的治療作用，并探討其可能作用機制。方法 取40只SPF級雄性大鼠，隨機分為A、B、C及對照組，每組各10只。A組予奧硝唑 800 mg/kg+參杞強精膠囊1 600 mg/kg，B組予奧硝唑 800 mg/kg+生精膠囊1 000 mg/kg，C組予奧硝唑 800 mg/kg制作大鼠生精功能損傷模型，對照組予等體積生理鹽水，各組均灌胃1次/d，共給藥28 d。給藥結束后第1天觀察各組大鼠體質量增長情況，計算體質量增加率；摘除大鼠雙側睪丸，計算大鼠睪丸系數；取單側附睪，檢測各組大鼠附睪精子濃度，計算精子活動率；檢測睪丸組織Bcl-2、Bax蛋白。結果 給藥結束后第1天，C組睪丸系數小于對照組(P<0.05)，A、B組睪丸系數均高于C組(P均<0.05)。給藥結束后第1天，A、B、C組附睪精子濃度、附睪精子活動率明顯低于對照組(P均<0.05)，A、B組大鼠附睪精子濃度、附睪精子活動率明顯高于C組(P均<0.05)。A、B組大鼠睪丸組織Bcl-2平均光密度均高于C組(P均<0.05)而Bax平均光密度均低于C組(P均<0.05)。結論 參杞強精膠囊對大鼠生精功能損傷具有治療作用;其機制可能與抑制睪丸組織中Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達，從而抑制睪丸生精細胞凋亡有關。

參杞強精膠囊；生精功能損傷；精子活動率；B淋巴細胞瘤-2；凋亡相關基因

多數研究[1,2]顯示，我國正常生育力男性精子密度和精子數量呈下降趨勢。少、弱精子癥是男性不育的常見類型，其發病率逐年上升。近年來國內采用中藥制劑治療少、弱精子癥取得了顯著療效[3,4]。大量的臨床研究發現，中藥強精煎可以有效治療男性精子質量差，活性不高等癥狀，主要用于治療脾腎兩虛型少、弱精子癥，能有效提高患者精子密度、活力及活率[5,6]。參杞強精膠囊是在強精煎基礎上改進的院內制劑，我們觀察了參杞強精膠囊灌胃對大鼠生精功能損傷的治療作用，并探討其可能作用機制。現將結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑及儀器 8周齡的SPF級雄性成熟SD大鼠40只，體質量200～250 g，購自廣西醫科大學實驗動物中心，許可證號：SCXK桂2009-0002。飼養于廣西醫科大學實驗動物中心，分籠飼養，自由進食、飲水。參杞強精膠囊由黃芪、黨參、益母草、當歸、枸杞、菟絲子、五味子、川續斷等中草藥構成，由廣西中醫藥大學第一附屬醫院制劑室統一配制和提供，批號：20131112，藥品質量符合2010年版《中華人民共和國藥典》中關于膠囊劑的配制要求，0.4 g/粒，其中五味子醇甲含量≥0.2 mg，4 粒/次，3次/d。生精膠囊(0.4 g/粒，批號：20130801)，4 粒/次，3次/d。奧硝唑原料藥(批號：1401004)用2%羧甲基纖維素鈉溶液配制成混懸液，現配現用。羧甲基纖維素鈉(批號：20140113)。即用型Bcl-2和Bax大鼠抗小鼠單克隆抗體，SABC免疫組化染色試劑盒，底物DAB顯色試劑盒均購自武漢博士德生物工程有限公司。SC-15數控超級恒溫槽購自寧波新芝生物科技股份有限公司，MACRO精子計數板購自上海微圖儀器科技發展有限公司，BX53型正置四色熒光顯微鏡購自日本OLYMPUS公司，EL204-IC型電子天平購自瑞士METTLER TOLEDO公司，TS-1型脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造有限公司，GZX-DH·500-S-Ⅱ型電熱恒溫干燥箱購自上海躍進醫療器械廠。LEICA-RM2235型石蠟切片機購自德國LEICA公司，TEC-2601(Water Bath)型病理組織漂片儀購自常州市郝思琳醫用儀器有限公司。

1.2 大鼠分組及參杞強精膠囊給藥方法 將40只雄性大鼠適應性飼養7 d，按照盲選法隨機分為A、B、C及對照組，每組各10只。采用奧硝唑 800 mg/kg灌胃制作大鼠生精功能損傷模型[7]。A組予奧硝唑 800 mg/kg+參杞強精膠囊1 600 mg/kg[8]，B組予奧硝唑 800 mg/kg+生精膠囊1 000 mg/kg，C組予奧硝唑 800 mg/kg[9]，對照組不做特殊藥物處理，予等體積生理鹽水，各組均1次/d灌胃，共給藥28 d。每7 d根據大鼠體質量變化適時調整藥物用量。

1.3 大鼠睪丸系數、附睪精子濃度與附睪精子活動率檢測 給藥結束后第1天稱重大鼠后，10%水合氯醛麻醉大鼠，摘除大鼠雙側睪丸，吸出睪丸表面體液后稱重，計算大鼠睪丸系數，睪丸系數=睪丸重量/體質量×100%。取各組大鼠單側附睪，置于生理鹽水中剪碎并37 ℃溫育，待精子充分游離后，用精子計數板檢測各組大鼠附睪精子濃度，并計算精子活動率。灌胃期間每日觀察大鼠毛色、步態、日常活動及大鼠死亡情況，每7 d稱重大鼠體質量，末次灌胃24 h內再次稱重，計算各組大鼠體質量增長情況，計算體質量增加率，體質量增加率=(截止周體質量-起始周體質量)/起始周體質量×100%。

1.4 大鼠睪丸組織病理形態觀察 取各組大鼠睪丸組織，以Bouin液固定，脫水處理后用包埋機制成蠟塊，將蠟塊切成4 μm切片，并做HE染色，置于光學顯微鏡下(×400)觀察各組睪丸組織。

1.5 大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax檢測 采用免疫組化SABC法檢測各組大鼠睪丸組織Bcl-2、Bax。所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。于顯微鏡下觀察到細胞核與(或)細胞質呈棕黃色則表明Bcl-2、Bax染色陽性。將每張切片置于高倍鏡下(×200)隨機檢測5個視野，計算陽性區域的平均光密度。

2 結果

2. 1 大鼠睪丸系數、附睪精子濃度與附睪精子活動率比較 給藥結束后第1天各組大鼠睪丸系數、附睪精子濃度與活動率比較見表1。灌胃第1周A、B、C組大鼠出現體質量下降，活動減少，精神不佳，反應遲鈍、畏寒蜷縮、體毛疏松，食欲不振，尿頻等癥狀，以C組最為嚴重，隨灌胃時間延長，A、B組大鼠癥狀逐漸緩解。給藥結束后第1天A、B、C及對照組大鼠體質量增加率分別為20.91%±1.54%、18.42%±2.10%、8.80%±1.38%、32.66%±1.42%，C組大鼠體質量增加率明顯低于對照組(P<0.05),A、B組大鼠體質量增加率明顯高于C組(P均<0.05)。

表1 給藥結束后第1天各組大鼠睪丸系數、附睪精子濃度與附睪精子活動率比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與C組比較,△P<0.05。

2.2 大鼠睪丸組織病理形態 鏡下可見D組大鼠睪丸細胞層次明顯，各級生精細胞排列有序，細胞增殖活躍，管腔內血管豐富，細胞形態規則，發育較好，可見大量成熟精子；C組大鼠睪丸組織中上皮細胞厚度降低，細胞層次界限不清，生精細胞排列紊亂，數量銳減，管腔內的成熟精子的數量減少，間質細胞的排列疏松，間隙增大，血管減少；A組大鼠細胞形態和精子質量類似D組，B組大鼠的睪丸病理損傷的恢復程度較A組稍差。見圖1。

圖1 給藥結束后第1天各組大鼠睪丸組織病理形態

2.3 大鼠睪丸組織Bcl-2和Bax蛋白比較 給藥結束后第1天各組大鼠睪丸組織Bcl-2和Bax平均光密度比較見表2。

表2 給藥結束后第1天各組大鼠睪丸組織Bcl-2和Bax平均光密度比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與C組比較，△P<0.05。

3 討論

奧硝唑是第三代硝基咪唑類衍生物，研究發現，應用奧硝唑每日800 mg/kg劑量時，精子計數、精子活動率與精子存活率均顯著降低[10]。另有研究發現，當奧硝唑每日給藥劑量達到800 mg/kg時, 可致睪丸重量顯著減輕, 精子細胞明顯減少, 各級生精細胞大片脫落，精子日產量也顯著減少[7], 睪丸組織及其生精功能都受到了嚴重的損傷。因此，本研究使用該藥持續灌胃誘導出少、弱精子癥大鼠模型。

男性生殖能力主要取決于生殖細胞的活性與功能，病理狀態下生殖功能的喪失與生殖細胞的凋亡密切相關。細胞凋亡是受多種基因調控的細胞主動死亡過程，其中與睪丸生殖細胞表達、凋亡密切相關的基因有Bcl-2[11]和Bax[12]，Bcl-2是目前公認的細胞凋亡抑制基因，可促進睪丸生殖細胞存活，Bax的主要作用則是加速細胞凋亡。二者蛋白量的表達多少決定了細胞凋亡與否，若Bcl-2蛋白表達多于Bax蛋白，則傾向于形成異源二聚體，可以抑制細胞凋亡；若Bax蛋白的表達量較多，則傾向于同種蛋白相結合，形成更加穩定的Bax-Bax蛋白，即所謂的同源二聚體，從而誘導生殖細胞發生凋亡[13,14]。實驗結果顯示，睪丸生精細胞凋亡增多的同時Bax蛋白表達增高，而Bcl-2蛋白表達降低，二者比例失調從而導致細胞凋亡。不同組別的大鼠生殖細胞中，Bcl-2的表達情況不同，其中C組的平均光密度降低，其余三組的平均光密度相對較高；而Bax在C組的平均光密度增多，其余三組的平均光密度相對較低，這表明參杞強精膠囊具有明顯促進生精功能損傷大鼠睪丸中Bcl-2蛋白表達，抑制生精細胞凋亡，使其修復而基本達到對照組大鼠睪丸表達水平，使Bax蛋白表達減少，接近對照組大鼠睪丸的表達水平，通過影響Bcl-2和Bax的表達率以及二者之間的比例，減少了生精細胞的凋亡，以利于睪丸生精功能的恢復。經參杞強精膠囊治療后的大鼠附睪精子濃度、附睪精子活動率以及睪丸組織病理損傷的恢復程度均接近對照組大鼠水平，其機制可能通過調節細胞凋亡基因蛋白，使抑制凋亡與促進凋亡的基因表達達到動態平衡，清除變異衰老細胞并促進新生細胞的發育成熟，以達到基因的穩定。

我院男科根據多年臨床實踐，形成獨特的辯證論治體系，認為精子質量低下所致的男性不育癥應從調理脾腎入手，確立了“脾腎兩虛”為現代男性不育癥的基本病理，并以此理論為指導組成健脾益腎法中藥驗方強精煎治療男性不育之少、弱精子癥，臨床觀察療效顯著[5,6]；實驗研究發現，強精煎能夠降低環磷酰胺所致脾腎兩虛型睪丸生精障礙模型小鼠的生精細胞調亡率，修復睪丸的病理損傷，恢復其生精功能[15,16]。參杞強精膠囊即在強精煎基礎上改進的院內制劑，方中重用枸杞補腎生精，黃芪益氣健脾，為君；菟絲子、五味子、川續斷生精固精，黨參健脾益氣，為臣；牡蠣潛陽固精、軟堅散結，益母草兼具活血、清熱、利濕之功而一物多用，當歸活血養血，為佐；神曲入脾、胃經，消食助運，以利受納，為使。諸藥合用，具有補腎健脾、活血養血、清熱利濕的作用，共奏生精強精之功效。本研究造模動物表現出了脾腎兩虛的癥狀，大鼠的精神狀態較差，體質量增加不明顯，而經參杞強精膠囊治療后的大鼠各項生命體征均有好轉；除對照組外，其余三組大鼠經造模后睪丸均出現重量下降的情況，經過中藥制劑參杞強精膠囊治療后，睪丸重量逐步恢復，這表明該藥對機體全身狀況有所改善。

綜上所述，參杞強精膠囊對大鼠生精功能損傷具有治療作用，其機制可能與抑制睪丸組織中Bax蛋白表達、促進Bcl-2蛋白表達，從而抑制睪丸生精細胞凋亡有關。但其具體作用機制尚有待進一步深入研究。

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摘自《中國學術期刊(光盤版)檢索與評價數據規范》(修訂版CAJ-CD B/T 1-2006)

Therapeutic effect of Shenqi Qiangjing capsule on spermatogenic function injury in rats by gavage

LIUQian,TIANYuanchun,BINBin,LUHaiwang

(TheFirstAffiliatedHospitalofGuangxiUniversityofChineseMedicine,Nanning530023,China)

Objective To observe the therapeutic effect of Shenqi Qiangjing capsule on spermatogenic function injury in rats by gavage, and to explore its possible mechanism.Methods Forty SPF male rats were assigned into four groups: groups A, B, C, and the control group, with 10 rats in each group. Rats in the group A were given 800 mg/kg ornidazole and 1 600 mg/kg Shenqi Qiangjing capsule, rats in the group B were given 800 mg/kg ornidazole and 1 000 mg/kg Shengjing capsule, rats in the group C were given 800 mg/kg ornidazole to make the models with spermatogenic function injury, and rats in the control group were given the same volume of normal saline. All groups were fed by intragastric administration once a day for continuous 28 days. Then, we observed the growth of rats′ weight in each group, calculated the increase rate of weight, calculated the testis coefficient, tested the sperm concentration and motility rate in rats′ epididymis, and detected the expression of Bcl-2 and Bax protein in rats′ testes. Results On day one after the administration, the testis coefficient of group C was lower than that of the control group (P<0.05). The testis coefficients of group A and group B were higher than that of group C (bothP<0.05). On day one after the administration, the sperm concentrations and the sperm motility rates of group A, group B and group C were significantly lower than that of the control group (allP<0.05); the sperm concentrations and the sperm motility rates of group A and group B were significantly higher than that of group C (allP<0.05). The Bcl-2 average optical densities of group A and group B were higher but the Bax average optical densities were lower than that of group C (allP<0.05).Conclusions Shenqi Qiangjing capsule has a good therapeutic effect on spermatogenic function injury in rats. Its mechanism may be related to inhibiting the expression of Bax protein, promoting the expression of Bcl-2 protein and thus inhibiting the apoptosis of spermatogenic cells in testes.

Shenqi Qiangjing capsule; spermatogenic function injury; sperm motility rate; B-cell lymphoma; apoptosis-related gene

廣西自然科學基金項目(2013GXNSFBA019134)；廣西壯族自治區衛生廳中醫藥醫院制劑類課題(GZYZ-10-05)；廣西壯族自治區中醫藥管理局中醫藥科技專項課題(GZYZ1101)。

劉倩(1981-)，女，碩士，副主任藥師，主要研究方向為醫院藥學與臨床藥學。E-mail: lq200431@163.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2017.19.004

R285

A

1002-266X(2017)19-0013-04

2016-11-21)

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