藥物治療后腎癌EMT相關基因表達譜分析及對預后的影響

南 寧 寨 旭 王 宇 陳 琦

藥物治療后腎癌EMT相關基因表達譜分析及對預后的影響

南 寧 寨 旭 王 宇 陳 琦

目的 通過對相關數據庫數據分析，探究EMT相關調節因子的異常表達與腎癌的相關性。方法 對NCBI中GEO數據庫中的若干數據集數據進行表達量分析、生存分析和相關性分析。結果 ①研究分析表明，Snai1等EMT相關調節因子在腎癌中存在明顯的高表達，而E-cadherin(CDH1)等則表現為明顯的低表達。②Twist1等的高表達會導致腎癌患者的總生存率和無疾病生存率明顯降低(P=0.0186;P<0.0015)。③VIM和SIP1在藥物治療后的腎癌患者中有明顯的高表達情況(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和TJP1在藥物治療后的腎癌患者中則表現為低表達(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)。④VIM和SIP1在腎癌患者中的表達情況呈正相關(P<0.0001，γ=0.573)；而其與OCLN呈負相關(P=0.0017，γ=-0.3316)。結論 通過對EMT指標在腎癌患者中的表達相關性分析表明，EMT調節因子的異常表達與腎癌患者疾病的發展存在一定的相關性，并且對其藥物耐受和預后都有一定的影響。

腎癌；表達譜；EMT；預后

(ThePracticalJournalofCancer,2017,32:548～552)

腎癌是常見的致死率位于前十的惡性腫瘤之一，其患者仍然在逐年增加[1]。約有30%的腎癌患者在診斷初期就已經發生了轉移，且由于耐藥性的存在，轉移性腎癌患者5年生存率僅為5%[2]。雖然目前一些靶向治療藥物可以在一定程度上改善預后，但對于很多惡性腎癌仍然無法治愈[3]。所以鑒定驅動腎癌生長轉移的分子生物學事件對于發展最佳的治療策略是至關重要的。

上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是一種上皮樣細胞向間質樣的細胞轉分化的過程，與上皮細胞惡性腫瘤的發生發展關系密切[4]。實驗證據表明EMT在多種癌癥的原發性浸潤和繼發性轉移中起著舉足輕重的作用[5],其相關基因的表達還對于腫瘤的耐藥起著非常重要的作用[6]。有研究提示EMT相關的基因，如Twist的表達與腎癌的轉移以及耐藥有著密切的關系[7]。而完整的EMT信號網絡是由細胞外信號觸發，如轉化生長因子(transforming growth factor β，TGF-β)信號[8-9]，這些轉錄因子同腫瘤的侵襲和轉移以及腫瘤耐藥性的發展密切關聯[10]。目前仍沒有研究直接證明他們之間的聯系，故在本研究中我們探究了腎癌病例中相關EMT調節因子的異常表達情況，并分析了EMT調節因子的異常表達與腎癌耐藥的相關性及對腎癌預后及生存的影響。

1 材料與方法

1.1 研究材料

本研究所用到的材料均來自于NCBI的GEO數據庫，具體信息如下。

表1 研究中所用到的GES數據集

1.2 方法

1.2.1 表達量分析 基于數據庫特定研究樣本數據集中特定目標基因的表達量的相對值進行表達量的分析，所有數據都經過對數轉換和中位數中心化處理。根據表達量處理后數據進行聚類和差異分析。文中熱圖由HemI軟件制作，比較差異分析圖由GraphPad Prism 5軟件制作。(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001表示差異有統計學意義)。

1.2.2 生存分析 基于數據庫特定研究樣本數據集中特定目標基因的表達量的相對值及對應樣本的總生存(OS)和無疾病生存(DFS)信息進行生存分析，所有數據都經過對數轉換和中位數中心化處理，并采用Kaplan-Meier分析方法進行分析。

1.2.3 相關性分析 基于數據庫特定研究樣本數據集中特定目標基因的表達量的相對值進行相關性分析，所有數據都經過對數轉換和中位數中心化處理。(P<0.05表示差異有統計學意義，γ<0表示負相關，γ>0表示正相關)。

2 結果

2.1 EMT相關指標在腎癌患者中的表達分析

為了評估EMT與腎癌發生發展的關系，我們選取了6個EMT相關的調節因子，分別為Snai1、Twist1、vi mentin(VIM)、SIP1、E-cadherin(CDH1)和occludin (OCLN)，據以往的相關研究表明，其中Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在EMT的過程中表達量上調，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)在EMT的過程中表達量下調。據此，我們對研究數據集中的腎癌樣本和正常腎組織樣本的相關基因的表達進行了表達譜的聚類分析，結果表明Snai1、Twist1、VIM和SIP1在腎癌樣本中均存在高表達，而E-cadherin和occludin在腎癌中均表現為低表達，這也與以往的類似研究結果相一致，表明EMT對于腎癌的發生發展有著重要的作用。

2.2 EMT相關指標對腎癌患者生存及預后的影響

據以往的研究報道，EMT過程對于腎癌的發生發展以及腎癌患者的生存狀態具有重要作用。所以，為了進一步探究EMT相關調節因子的表達對腎癌患者的生存狀態的影響，我們對上述部分基因進行了相關研究，結果表明，在腎癌患者中，SANI1的高表達會導致腎癌患者的總生存率明顯降低(P<0.0001)，并且在腎癌患者中，SANI1的高表達也同樣會導致腎癌患者的無疾病生存率明顯降低(P=0.0071)。與此類似，我們也在同樣的數據集中對Twist1的高表達對非小細胞肺癌患者的總生存率和無疾病生存率進行了分析，結果表明，Twist1的高表達同樣也會導致腎癌患者的總生存率和無疾病生存率明顯降低(P=0.0186;P<0.0015)(圖1)。

2.3 EMT相關指標在藥物治療后腎癌患者中的表達分析

在上述的研究中，我們分析了EMT相關指標在腎癌患者中的表達異常情況，以及部分基因的高表達對腎癌患者總生存率和無疾病生存率的影響。為了研究藥物治療后腎癌患者中EMT相關調節因子的表達情況，我們在相關數據集中對部分上述高表達(VIM和SIP1)和低表達(CDH1和OCLN)的基因進行了表達量的比較分析。結果表明，與在腎癌患者中的表達情況相似，VIM和SIP1在藥物治療后的腎癌患者中也有明顯的高表達情況(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021)，而CDH1和OCLN在藥物治療后的腎癌患者中則同樣表現為低表達(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001)(圖2)。這一結果說明，EMT過程不僅對腎癌的發生發展有著重要的影響，而且其在藥物治療后腎癌患者中也表現出同樣差異表達情況，暗示其在腎癌的耐藥性發展過程中也發揮著同樣重要的作用。

圖1 EMT相關調節因子的表達與腎癌患者生存狀態的分析

圖2 EMT相關調節因子在耐藥性腎癌患者中的表達差異比較

2.4 EMT相關指標在腎癌患者中表達的相關性分析

為了進一步探究，EMT的相關基因的差異表達與腎癌耐藥發展的相關性，我們在耐藥性腎癌患者樣本中進行了EMT的相關基因的表達的相關性分析。結果表明，VIM和SIP1在腎癌患者中的表達情況呈正相關(P<0.0001，γ=0.573)；而其與OCLN的相關性分析顯示呈負相關(P=0.0017，γ=-0.3316)(圖3)。這一結果進一步說明，EMT的相關調節因子在耐藥性腎癌患者中的差異表達是有關聯的，而且這一關聯與腎癌耐藥性的發展也有著密切的關系，很可能EMT就是腎癌轉移乃至產生藥物耐受的關鍵性步驟，通過EMT來促進腎癌的發展惡化，并影響患者的生存及預后。

圖3 EMT相關指標在耐藥性腎癌患者中的表達相關性分析

3 討論

EMT過程的進行由多個步驟組成，該過程的實現對于惡性腫瘤的多種惡化事件都具有促進作用，包括腫瘤生成、腫瘤浸潤、腫瘤轉移和腫瘤的藥物耐受等。因此，一些包括表皮標志物、間質標志物和轉錄因子在內的調節因子均參與這一過程[11]。而且這些調節因子對于EMT的調控存在著不同的模式，這與EMT在惡性腫瘤的早期階段所存在的時間和空間上的異質性有關[12]，因此，腫瘤EMT相關的調節因子的鑒定和研究是必要的。目前關于 EMT 的研究逐漸深入，其在腎癌中發揮的作用不斷地被發現，EMT 發生的分子機制也不斷地被揭示[13]。在該研究中，我們著重于6個已知的EMT相關調節因子在腎癌組織中表達的研究，這些調節因子對于腎癌的發生發展、轉移耐藥及預后生存都有著重要的作用，探究它們與腎癌的關系，對于腎癌的診斷和治療都具有重要的意義。

我們的研究分析表明，Snai1、Twist1、vimentin(VIM)和SIP1在腎癌患者中存在明顯的高表達，而E-cadherin(CDH1)和occludin(OCLN)則表現為明顯的低表達，且這些基因的表達異常與腎癌患者的生存及預后有著密切的關系，這一結果也與以往的一些研究結果相一致?；诖耍覀冇謱δ退幮阅I癌病例樣本進行分析，發現部分EMT相關的基因在耐藥性腎癌患者中也表現出明顯的表達異常，該結果證明多因子調控的EMT過程，不僅對于腎癌的發生發展有著重要的促進作用，而且對于腎癌的耐藥性也具有一定的作用。

最后，通過對EMT相關調節因子在腎癌患者中的相關性分析表明，EMT調節因子的異常表達之間存在明顯的相關性，某些促進EMT進程的調節因子會抑制某些促凋亡因子的表達，同時促進某些促增殖因子的表達。隨后，我們比較分析了EMT相關調節因子的異常表達對腎癌患者預后生存的影響。單一變量分析顯示，Twist和vimentin等EMT正向調控因子的高表達降低了腎癌患者的總的生存期，同時促進了腎癌患者的治療后疾病的復發。盡管沒有研究表明Twist與腎癌患者預后相關，但是Twist作為一個重要的細胞內轉錄因子，通過轉錄抑制E-cadherin的表達，從而使得E-cadherin所介導的細胞間連接缺失，促進細胞運動轉移[14]。我們的研究分析結果同樣也與這一結論相一致，包括Twist在內的部分EMT相關調節因子對于腎癌的轉移和惡化都存在促進的作用。最終，我們提出部分EMT相關調節因子的高表達會導致腎癌患者總生存期降低，同時也會使得患者的無復發生存期降低。

通過對本研究結果的分析討論，我們評估了多種參與EMT過程的調節因子在腎癌中的重要性，同時也在一定程度上揭示了多因子調控的EMT過程與腎癌的發生發展以及腎癌患者的預后生存等存在著密切的聯系。這將為腎癌相關標志物的選擇和腎癌患者的診斷治療提供一定理論基礎。

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(編輯：甘 艷)

Analysis of EMT-related Gene Expression Profile and Prognosis of Renal Cell Carcinoma after Drug Treatment

NANNing，ZHAIXu，WANGYu，etal.

TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity，Xi'an,710004

Objective To study relevant database data analysis,and explore the correlation of the abnormal expression of EMT related factors and renal cell carcinoma.Methods Based on some data sets of GEO in the NCBI database,to perform express analysis,survival analysis and correlation analysis.Results ①The results showed that Snail1 and other EMT-related regulatory factors in renal cell carcinoma patients were significantly higher expression,while the E-cadherin(CDH1)and so the performance was significantly lower expression.②Twist1 and other high expression of renal cancer patients will lead to the overall survival and disease-free survival was significantly reduced(P=0.0186;P<0.0015).③VIM and SIP1 were significantly higher in patients with renal cancer after drug treatment(VIM，P<0.001；SIP1，P=0.0021),while CDH1 and TJP1 showed low expression in renal cancer patients after drug treatment(CDH1，P<0.0002；OCLN，P<0.0001).④There was a positive correlation between the expression of VIM and SIP1 in renal cell carcinoma(P<0.0001,γ=0.573)and negative correlation with OCLN(P=0.0017,γ=-0.3316).Conclusion The correlation analysis between the EMT index and the expression of RCC in RCC patients showed that the abnormal expression of EMT regulatory factor is correlated with the development of RCC and has certain influence on drug tolerance and prognosis.

Kidney cancer;Expression profile;EMT;Prognosis

710004 西安交通大學第二附屬醫院

陳 琦

10.3969/j.issn.1001-5930.2017.04.008

R737.11

A

1001-5930(2017)04-0548-05

2016-11-09

2017-03-12)