苦瓜多糖鐵的制備及其對小鼠降血糖活性研究

杜國豐,陳紅漫,闞國仕，高 爽，郭龍偉

(1.營口理工學院化學與材料工程系,遼寧營口 115014; 2.沈陽農業大學生物科學技術學院,遼寧沈陽 110866；3.朝陽市食品檢驗檢測所，遼寧朝陽 122000)

苦瓜多糖鐵的制備及其對小鼠降血糖活性研究

杜國豐1,陳紅漫2,闞國仕2，高 爽1，郭龍偉3

(1.營口理工學院化學與材料工程系,遼寧營口 115014; 2.沈陽農業大學生物科學技術學院,遼寧沈陽 110866；3.朝陽市食品檢驗檢測所，遼寧朝陽 122000)

為研究絡合效應對多糖生物活性的影響,從苦瓜中提取水溶性苦瓜多糖,制備苦瓜多糖鐵絡合物,用紅外光譜法對苦瓜多糖及其鐵絡合物分別進行表征,對比苦瓜多糖及其鐵絡合物對四氧嘧啶致高血糖小鼠模型的降血糖作用,利用光鏡對小鼠胰尾組織石蠟切片進行胰島細胞形態學觀察。結果表明,經鐵離子絡合后,苦瓜多糖的紅外譜圖基本骨架未發生較大變化,只是在局部吸收峰向高波數移動,在3407.6 cm-1處吸收峰增強;苦瓜多糖及其鐵絡合物給藥組都能顯著降低高血糖模型小鼠的血糖水平,且苦瓜多糖鐵降血糖效果更顯著;苦瓜多糖鐵對β-細胞具有較好的保護和修復作用,可促進β-細胞內β-顆粒和線粒體再生,提高β-細胞釋放胰島素的能力。

多糖,苦瓜多糖鐵絡合物,降血糖活性,胰島細胞

隨著現代經濟發展和生活方式的改變,以高血糖及糖尿病為代表的代謝綜合癥已成為影響人類健康的非傳染性疾病之一[1],且患病趨勢逐年上升。目前糖尿病治療藥物主要為注射型胰島素制劑和化學合成藥物。尋找新型高效、低毒,具有類胰島素效果的抗糖尿病化合物是研究者關注的熱點[2]。

多糖是一種高分子量的生物活性物質,其降血糖作用已為眾多學者所證實,動物實驗研究表明,植物多糖可通過修復胰島細胞的形態,促進肝臟、肌肉等外周組織和靶器官對糖的利用達到降糖效果[3-5]。多糖是一種含多羥基的聚糖,羥基中含有的孤對電子可以與金屬離子發生配合作用,形成多糖金屬絡合物,多糖金屬絡合物可使多糖生物活性增效[6-7]。水溶性苦瓜多糖是一種從苦瓜果肉中提取出的酸性多糖,主要由阿拉伯糖、半乳糖醛酸、鼠李糖、木糖組成,我們的前期研究及相關實驗表明,具有抗氧化活性的苦瓜多糖可降低糖尿病小鼠的血糖水平[8-9]。本研究在利用金屬絡合法制備小分子量苦瓜多糖鐵絡合物的基礎上,對其降血糖活性進行了比較研究,對苦瓜多糖鐵絡合物的應用研究提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

苦瓜 市售;昆明系小鼠 雄性,體重(23±2) g，由中國醫科大學動物實驗中心提供。

纖維素酶 諾維信(中國)生物技術有限公司;SephadexG-100凝膠 Sigma公司；檸檬酸鈉 沈陽市遠東試劑廠;3-氨丙基-3-乙氧基硅烷(APES)武漢博士德生物工程有限公司;氫氧化鈉 天津市瑞金特化學品有限公司;三氯化鐵 天津市瑞金特化學品有限公司;溴化鉀 臨沂正衡化波儀器有限公司;四氧嘧啶 上海如吉生物科技發展有限公司;多聚甲醛 臨沂市利恒化工有限公司;格列本脲片 上海華源長富藥業集團旌德制藥有限公司。

SXT-1型血糖測試儀 三諾；葡萄糖凝膠柱層析裝置(玻璃層析柱Φ20 mm×600 mm) 上海青浦滬西儀器廠；ALPHA 2-4LD冷凍干燥機 德國CHRIST公司;N-1001旋轉蒸發儀 東京理化器械株式會社;Nicolet Nexus 5DXC FT-IR紅外光譜掃描儀 美國 Nicolet公司;SpectrAA-220型原子吸收分光亮度計 美國Varian公司。

1.2 苦瓜多糖的制備

將市售鮮苦瓜切片后于50 ℃烘箱內烘干,粉碎,稱取苦瓜干粉10 g,加入40倍的蒸餾水,30 mg纖維素酶,50 ℃條件下浸提5 h。收集提取液,5000 r/min離心15 min,上清液再減壓濃縮至原體積的1/3,加入3倍體積的95%乙醇,靜置過夜后5000 r/min離心10 min。將沉淀冷凍干燥后用蒸餾水復溶,采用Sevag法脫蛋白后冷凍干燥。根據以下公式計算多糖得率，多糖得率(%)=冷凍干燥后多糖質量(g)/苦瓜質量(g)×100。采用sephadexG-100凝膠分離粗多糖，選用其中活性較高組分用于苦瓜多糖鐵的制備。

1.3 苦瓜多糖鐵的制備

稱取1.2中分離到的苦瓜多糖0.5 g,溶解于30 mL蒸餾水中,并加入0.5 g的檸檬酸鈉作為催化劑,在60 ℃恒溫水浴的條件下不斷的攪拌,與此同時,滴加2 mol/L FeCl3溶液和20%的NaOH溶液,反應液控制在pH8。當反應中滴入的FeCl3溶液產生的紅褐色沉淀,經攪拌在2 min之內不再出現先沉淀后溶解現象,繼而有少量搖之不溶的紅褐色沉淀時,停止滴加FeCl3和NaOH溶液,繼續在60 ℃水浴條件下攪拌1 h。待反應液冷卻后,5000 r/min離心10 min取上清液,然后經透析、濃縮、冷凍干燥,即制得苦瓜多糖鐵絡合物。

1.4 金屬離子的取代度測定

準確稱量苦瓜多糖絡合物樣品20 mg于干燥的坩堝中,放入高溫馬弗爐中,于500～550 ℃下灰化2 h,冷卻。用無機酸洗去灰分,去離子水定容后,用原子吸收光譜法對其進行測定,并采用GB1191-89中方法確定鐵的取代度,苦瓜多糖鐵絡合物得率(%)=苦瓜多糖鐵絡合物絡合物(凍干粉)/苦瓜多糖凍干粉×100。

1.5 傅立葉紅外光譜分析

采用溴化鉀壓片法,無水樣品20 mg與溴化鉀混勻,研磨后壓片,在400～4000 cm-1區間掃描。

1.6 苦瓜多糖及苦瓜多糖鐵絡合物降血糖活性

1.6.1 糖尿病小鼠模型構建 選用健康的昆明系雄性小鼠(體重23±2 g),適應性喂養3 d后,禁食24 h,按劑量為200 mg/kg·d-1腹腔注射四氧嘧啶(快速注射,以免四氧嘧啶分解失效),繼續進行喂養3 d后,禁食12 h,測定其血糖值,血糖值>15 mmol/L即造模成功,以此為糖尿病動物模型。

1.6.2 實驗設計 取未經處理的健康小鼠作為正常對照組,造模成功的小鼠分成4組,分別為:四氧嘧啶組、格列本脲組(藥物組)、苦瓜多糖組及苦瓜多糖鐵絡合物組,每組12只。分別灌胃生理鹽水(正常對照組25 mg/kg·d-1、四氧嘧啶組25 mg/kg·d-1)、格列本脲(25 mg/kg·d-1)、苦瓜多糖(250 mg/kg·d-1)、苦瓜多糖鐵絡合物(250 mg/kg·d-1),連續灌胃28 d,分別測定14 d和28 d灌胃5 h后的血糖值。

1.6.3 血糖測定 小鼠尾靜脈血取血,用SXT-1型血糖測試儀及專用試紙測定血糖。

1.7 免疫組織化學標本制備和SP法染色

取小鼠胰尾組織,放于4%多聚甲醛液24 h,常規石蠟包埋,連續切片,厚度為6 μm,每隔20張取1片蠟帶,裱于涂有APES的載玻片上,進行免疫組織化學染色,用于電鏡觀察,放大倍數為200倍。

1.8 數據統計處理及分析

2 結果與分析

2.1 苦瓜多糖的分離提取

苦瓜粉經過Sevag洗脫蛋白，濃縮、醇沉、洗滌及冷凍干燥后，質地比較膨松，便于后續溶解操作。實驗中白色粗多糖得率為9.6%。粗多糖經過Sephadex G-100凝膠分離后得到一種活性較高的組分苦瓜多糖MCPⅡa。

2.2 苦瓜多糖鐵的制備

苦瓜多糖分子中存在大量羧基、羥基等活性基團,具有良好的金屬絡合能力。按方法1.3所述制備的苦瓜多糖鐵絡合物MCPⅡa-Fe(Ⅲ),其得率為12.58%,取代度為49.08%,在滴加FeCl3和NaOH溶液的過程中，要在恒溫下持續攪拌溶液，使得Fe3+能夠得到充分的絡合，絡合后及時進行透析及冷凍干燥盡快降低所得苦瓜多糖鐵產品的水分活度。

2.3 苦瓜多糖及其鐵絡合物的紅外光譜

苦瓜多糖及其鐵絡合物紅外掃描圖譜如圖1所示,與苦瓜多糖MCPⅡa的紅外掃描圖譜相比較,鐵絡合物圖譜的基本骨架沒有發生很大的變化。MCPⅡa在3500～3200 cm-1區域內出現的3407.6 cm-1處的O—H的伸縮振動吸收峰,在鐵絡合物中移向高波數3419.4 cm-1,分析是因為鐵離子與MCP的羥基配位后,使得-OH的氫鍵締合作用減弱,因此在3407.6 cm-1處的吸收峰增強;MCPⅡa在1700～1550 cm-1區域內出現的1621.6 cm-1處的C=O的非對稱伸縮振動吸收峰[10],在鐵絡合物中移向高波數1623.7 cm-1,說明C=O可能參與了配位;MCPⅡa在1500～1380 cm-1區域內1424.1 cm-1處的吸收峰,在鐵絡合物中移向1424.8 cm-1;MCPⅡa在1390～1200 cm-1區域內1337.1 cm-1處的—OH的變形吸收峰,在鐵絡合物中向高波數移動[11-12]。

圖1 苦瓜多糖、苦瓜多糖鐵絡合物的紅外光譜Fig.1 Infrared spectra of MCPⅡa and MCPⅡa-Fe(Ⅲ)

2.4 苦瓜多糖與苦瓜多糖鐵絡合物對小鼠血糖值的影響

苦瓜多糖(MCPⅡa)及其鐵絡合物(MCPⅡa-Fe(Ⅲ))對糖尿病小鼠血糖的影響如圖2所示。由圖2可知,建模后與正常對照組比較,糖尿病小鼠的血糖明顯升高,說明造模成功。在灌胃14 d后,各組小鼠的空腹血糖值都明顯低于四氧嘧啶組,其中MCPⅡa-Fe(Ⅲ)組的血糖值較MCPⅡa組降低了2.03 mmol/L,而MCPⅡa-Fe(Ⅲ)與格列苯脲組差異不顯著。苦瓜多糖鐵絡合物與苦瓜多糖組小鼠血糖濃度分別為14.04 mmol/L和12.26 mmol/L,與給藥前相比,血糖濃度分別降低了39.13%和47.17%,陽性對照組則為52.13%;在灌胃28 d后,血糖濃度降低百分數與給藥前相比則分別為36.95%、65.6%及69.5%,各組小鼠的空腹血糖值依然與四氧嘧啶組差異十分顯著,其中MCPⅡa-Fe(Ⅲ)的血糖值明顯低于MCPⅡa,但與格列苯脲組沒有明顯差異,且降糖效果呈量效關系。結果表明,相同劑量下MCPⅡa-Fe(Ⅲ)比MCPⅡa的降血糖效果好。

圖2 苦瓜多糖及其鐵絡合物對糖尿病小鼠血糖的影響Fig.2 Effect of MCPⅡa and MCPⅡa-Fe(Ⅲ) on blood glucose in diabetic mice注:a:與糖尿病模型組對照(p<0.01); b:與糖尿病模型組對照(p<0.05); c:與正常組對照(p<0.01);d:與正常組對照(p<0.05)。

2.5 苦瓜多糖對糖尿病小鼠修復胰島損傷的影響

在光鏡下觀察不同處理小鼠胰島形態及變化,結果如圖3(a)～(e)所示。正常對照組小鼠(a)胰島為橢圓狀,胰島內細胞排列整齊,核呈圓形或橢圓形,染色質豐富分布均勻。模型對照組小鼠(b)胰島損傷情況嚴重,胰島形態不規則,胰島內有較大空虛區域;胰島內細胞有顯著的壞死特征,數量明顯減少;細胞核出現凝縮現象,染色質分布不均,且染色較淺。與模型對照組相比,陽性對照組(c)的胰島雖外形仍為不規則形狀,但內部細胞數量明顯增多;核凝縮現象未得到較好的恢復,核染色較深,但染色質分布仍不均。經苦瓜多糖及苦瓜多糖鐵絡合物灌胃治療后的糖尿病小鼠胰島形態均向正常狀態轉變,但組間存在差異。苦瓜多糖鐵絡合物組(d)胰島外形規整,內部幾乎無壞死細胞,核多為橢圓形,染色質較豐富且分布均勻,且細胞排列較整齊,胰島形態基本恢復正常狀態。苦瓜多糖組(e)胰島邊緣較整齊,胰島內壞死細胞得到恢復,細胞數量明顯增多,但呈不規則排列;核凝縮現象得到緩解,染色質分布較均勻,著色卻較淺。通過形態學觀察可知，苦瓜多糖對于壞死的胰島細胞有一定的修復作用，而多糖組分通過Fe3+的絡合修飾后，修復作用有了很大的提高，胰島細胞的內部形態與正常細胞非常接近。

圖3 不同處理組小鼠的胰島微細結構(×200)Fig.3 Microstructure of pancreas in different treatment groups of diabetic mice(×200)注:a正常對照組小鼠胰島微細結構;b模型對照組小鼠胰島微細結構;c陽性對照組小鼠胰島微細結構;d 苦瓜多糖鐵絡合物組小鼠胰島微細結構;e苦瓜多糖組小鼠胰島微細結構。

3 結論與討論

目前植物多糖的研究主要集中在提取分離純化、構型構象分析和藥理活性篩選等方面,但利用金屬離子修飾多糖制備金屬絡合物的研究比較少[13-17]。多糖因糖鏈結構復雜且含有較多羥基,易與水分子鍵合形成膠體,很難獲得相應的晶體,因此絡合反應之后,不能直接確定絡合的部位以及最終的結構式,因此我們利用IR推測其可能的絡合部位。本實驗將苦瓜多糖經Sevage法排除蛋白質干擾后與三價鐵離子制備苦瓜多糖鐵絡合物,從IR數據的變化基本可以推測三價鐵和苦瓜多糖羥基發生配位引起波數和波長的位移[18]。對糖尿病模型小鼠胰島細胞觀察顯示,隨著血糖的增高,β細胞結構受損加重,胞漿中分泌顆粒明顯減少,甚至較多的細胞呈現凋亡早期改變:β細胞體積變小,核染色質邊集,核固縮,出現許多畸形細胞核,線粒體數量減少破壞,內質網擴張脫顆粒,這都提示細胞凋亡的發生和合成胰島素能力下降。而在苦瓜多糖鐵絡合物及苦瓜多糖的干預下,一定量的β細胞得到恢復,也保證了足夠胰島素量的維持,β細胞合成分泌胰島素的功能趨向正常。綜上所述,苦瓜多糖與苦瓜多糖鐵絡合物均能使糖尿病小鼠血糖水平下降,其中苦瓜多糖鐵絡合物調控血糖效果優于苦瓜多糖,這可能是由于多糖與金屬離子絡合后,空間結構發生了變化,使得配位部分與暴露的活性基團協同作用的結果出現[19]。因此,根據以上的實驗結果我們初步認為,苦瓜多糖鐵作為降糖活性物質具有潛在開發價值。

[1]R Jayawardena,P Ranasinghe,P Galappatthy,et al. Effects of zinc supplementation on diabetes mellitus:a systematic review and meta-analysis[J].Diabetology & Metabolic Syndrome,2012,4(1):1-12.

[2]Jian-Ya Qian,Ye-Yu Bai,Jing Tang,et al. Antioxidation andα-glucosidase inhibitory activities of barley polysaccharides modified with sulfation[J]. LWT-Food Science and Technology,2015,64:104-111.

[3]S A Moussa. Oxidative Stress in Diabetes Mellitus[J]. Romanian J Biophys,2008,18(3):225-236.

[4]SP Li,GH Zhang,Q Zeng,et al. Hypoglycemic activity of polysaccharide,with antioxidation,isolated from cultured Cordyceps mycelia[J].Phytomedicine,2006,13(6):428-433.

[5]Yupin Li,Takeki Hamasaki,Noboru Nakamichi,et al. Suppressive effects of electrolyzed reduced water on alloxan-induced apoptosis and type 1 diabetes mellitus[J].

Cytotechnology,2011,63(2):119-131.

[6]張曉茹,賈繼龍,張書圣.糖-金屬配合物的研究進展[J]. 合成化學,2006,14(1):1-6.

[7]李軍平,于淑娟. 糖類物質與金屬離子絡合物的研究進展[J].中國生化藥物雜志,2005,26(1):59-61.

[8]Wang huihui,Zhang shaozai,Chen hongman. Study on Correlation between Antioxidant and Hypoglycemic activity Polysaccharide isolation from Momordica charantia[J]. Bothalia Journal,2013,43(11):117-128.

[9]宋金平.苦瓜多糖對糖尿病小鼠的降血糖作用和胰島素水平的影響[J].中國實用醫藥,2012,7(3):250-251.

[10]Mao wenjun,Li bafang,Gu qianqun,et al. Preliminary studies on the chemical characterization and antihyper lipidemic activity of polysaccharide from the brown alga Sargassum fusiforme[J]. Hydrobiologia,2004,512:263-266.

[11]Kacurakova M,Capek P,Sasinkova V,et al. FT-IR study of plant cell wall model compounds:pectic polysaccharides and hemicelluloses[J]. Carbohydrate Polymers,2000,43(2):195-203.

[12]楊麗敏,翁詩甫,楊魯勤,等.幾種單雙糖及其部分固態金屬糖絡合物的遠紅外光譜研究[J].光譜學與光譜分析,2000,20(2):189-191.

[13]Hromádková Z,Paulsen B S,Polovka M,et al. Structural features of two heteroxylan polysaccharide fractions from wheat bran with anti-complementary and antioxidant activities[J]. Carbohydrate Polymers,2013,93(1):22-30

[14]Wijesekara I,Pangestuti R,Kim S K. Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae[J]. Carbohydrate Polymers,2011,84(1):14-21.

[15]Costa L S,Fidelis G P,Cordeiro S L,et al. Biological activities of sulfated polysaccharides from tropical seaweeds[J]. Biomedicine & Pharmacotherapy,2010,64(1):21-28.

[16]Jiao guangling,Yu guangli,Zhang junzeng,et al. Chemical structures and bioactivities of sulfated polysaccharides from marine algae[J]. Marine Drugs,2011,9(2):196-223.

[17]王兆梅,李琳,郭杞遠,等.多糖結構修飾研究進展[J].中國醫藥工業雜志,2002,33(12):616-620.

[18]茹翌,徐光勛,趙歡,等.苦瓜多糖的分子修飾及抗氧化活性研究[J].食品安全質量檢測學報,2015,6(8):2917-2923.

[19]Bao xingfeng,Liu guiping,Fang jinian,et al. Structural and immunological studies of a major polysaccharide from spores of Ganoderma lucidum(Fr.)Karst[J]. Carbohydrate Research,2001,332(1):67-74.

Study on preparation ofMomordicacharantiapolysaccharide-iron complex and its hypoglycemic activities in diabetic mice

DU Guo-feng1,CHEN Hong-man2,KAN Guo-shi2,GAO Shuang1,GUO Long-wei3

(1.Department of Chemical and Material Engineering,Yingkou Institute of Technology,Yingkou 115014,China; 2.College of Bioscience and Biotechnology,Shenyang Agricultural University,Shenyang 110866,China; 3.Chaoyang Institute for Food Control,Chaoyang 122000,China)

In order to study the effect of complexation on the biological activity of polysaccharide,the polysaccharide was extracted fromMomordicacharantiato prepare the polysaccharide-iron complex.The polysaccharide and its iron complex were characterized by infrared spectroscopy.The effects of the polysaccharide and its iron complex on blood levels of the diabetic mice induced by alloxan were contrasted.Morphology of pancreatic islet cells in paraffin sections of diabetic mice pancreatic tissue were observed by light microscopy.Results showed that the basic framework of the infrared spectrum of the polysaccharide fromMomordicacharantiadid not change much after the complexation of iron(Ⅲ),but the local absorption peak moved to the high wave number,and the absorption peak increased at 3407.6 cm-1. The prepared polysaccharides-iron complex can significantly reduce the blood glucose of the diabetic mice in comparison with those polysaccharides before administration(p<0.05). The complex of polysaccharide-iron has better effects on reducing blood glucose than those of polysaccharides alone,and they could protect and restoreβcell,promote the regeneration ofβparticles and mitochondrial,and improve the ability ofβcells to release insulin.

polysaccharide;Momordicacharantiapolysaccharide-iron complex;hypoglycemic activities;islet cell

2016-12-02

杜國豐(1984-)，男，碩士，實驗師，研究方向：食品生物化學，E-mail：duguofeng885624@163.com。

國家自然科學基金(31271842)。

TS201.4

A

1002-0306(2017)09-0353-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.060