呋喃唑酮代謝物間接競爭化學發光酶免疫法的建立

黃登宇,高文靜,黃種乾,高麗霞,馮 敏,楊秀松

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西大學食品藥品快檢技術中心,山西太原 030006；3.國家食品藥品監督管理總局高級研修學院,北京 100073)

呋喃唑酮代謝物間接競爭化學發光酶免疫法的建立

黃登宇1,2,高文靜1,黃種乾1,高麗霞1,馮 敏1,楊秀松3,*

(1.山西大學生命科學學院,山西太原 030006; 2.山西大學食品藥品快檢技術中心,山西太原 030006；3.國家食品藥品監督管理總局高級研修學院,北京 100073)

建立快速檢測動物源性食品中呋喃唑酮代謝物AOZ的間接競爭化學發光酶免疫法。利用對醛基苯甲酸(4-CBA)將AOZ衍生化為CPAOZ,利用活化酯法將CPAOZ與卵清蛋白(OVA)偶聯,生成完全抗原CPAOZ-OVA。對包被原與抗體的最佳稀釋倍數、封閉液濃度、競爭時間、酶標二抗稀釋倍數進行優化,建立標準曲線,同時對方法的特異性進行評價。結果表明:包被抗原最佳稀釋倍數為2000倍,抗體的最佳稀釋倍數為20000倍、封閉液為2%脫脂乳粉、競爭時間為2 h、二抗最佳稀釋倍數為4000倍;線性范圍是0.075～7.396 ng/mL,半抑制濃度IC50為0.74 ng/mL,對呋喃唑酮原藥的交叉反應率為23.4%,與其他結構類似物及衍生化試劑的交叉反應率均小于0.1%。該方法靈敏度高、特異性好,可為監管部門對于快速檢測動物源性食品中AOZ提供依據。

呋喃唑酮,間接競爭化學發光酶免疫法,動物源性食品,快速檢測

呋喃唑酮為硝基呋喃類藥物[1],是一種廣泛用在人類和動物中的抗菌藥物[2],動物服用之后,迅速代謝為3-氨基-2-惡唑烷酮(3-amino-2-oxazolidinone,AOZ),AOZ長期穩定存在于動物體內[3-4]。由于其對人體有潛在的致癌、致突變作用[5],美國、歐盟和日本等國家禁止在動物源食品中檢測出呋喃唑酮[6],2002年至今我國農業部公告第235號文件《動物性食品中獸藥最高殘留限量》也將呋喃唑酮列入禁用名單。但是由于此類藥物使用效果好,價格低廉,仍然被不法商販使用[7]。

目前呋喃唑酮代謝物AOZ的檢測多采用儀器分析法,如液相色譜-紫外聯用法(LC-UV)、液相色譜-串聯質譜法(LC-MS、LC-MS/MS)[8],有較高的準確性和靈敏度[9-10],但是前處理復雜,價格昂貴,無法對樣品大量快速篩查[11]。而免疫分析法如膠體金免疫層析法[12]、酶聯免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)[13]和化學發光酶免疫分析法(chemiluminescence enzyme immunoassay,CLEIA)[14-15]操作簡便,分析時間短,具有較高的選擇性和靈敏度,在獸藥殘留分析中具有十分廣闊的前景[16]。其中CLEIA法將具有高靈敏度的化學發光測定技術與高特異性的免疫反應相結合,與ELISA相比,靈敏度更高[17]。近幾年CLEIA法在食品安全方面得到應用,但此方法易受實際樣品干擾、在小分子檢測過程中精密度有限[18],迄今為止市面上在銷試劑盒仍舊沒有統一的標準,因此對于此方法的優化研究很有必要。

本實驗人工合成并檢測得到衍生化半抗原CPAOZ、包被抗原CPAOZ-OVA,建立了用于檢測AOZ間接競爭CLEIA法,為開發AOZ快速檢測試劑盒奠定了良好的基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

3-氨基-2-惡唑烷酮(AOZ)、卵清蛋白(OVA)、辣根過氧化物酶(HRP)、二甲基甲酰胺(DMF)、N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)、N,N-二環乙基碳酰亞胺(DCC)、3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(NPAOZ)、2-硝基苯亞甲基-氨基脲(NPSEM)、5-(4-嗎啉基)-3-(2-硝基苯亞甲基)-氨基-2-惡唑烷酮(NPAMOZ)、1-(2-硝基苯亞甲基)-氨基乙內酰脲(NPAHD)、魯米諾 美國Sigma公司;AOZ單克隆抗體 北京艾旗斯德科技有限公司;脫脂乳粉 伊利乳業;對醛基苯甲酸(4-CBA) 國藥集團;其他化學試劑均為國產分析純。

UV-1600PC紫外分光光度計 上海美譜達儀器有限公司;AVANCE 600 MHZ超導核磁共振波譜儀 德國Bruker公司;透析袋(截留分子量8000～14000) 北京索萊寶科技有限公司;INFINITE M200 PRO酶標儀 瑞士Tecan公司;96孔可拆卸化學發光板、PowerDry PL3000冷凍干燥機 美國Thermo公司;高速離心機 珠海博邁杰生物科技有限公司;8道微量可調移液器 德國Eppendorf公司;BSD-100恒溫培養箱 上海博迅實業有限公司。

化學發光液(現用現配):5 mL Tris-鹽酸緩沖液、3.5 mL對碘苯酚溶液、200 μL魯米諾溶液和50 μL過氧化氫脲溶液混勻[19]。

1.2 實驗方法

1.2.1 合成半抗原CPAOZ 利用對醛基苯甲酸(4-CBA)將AOZ衍生化為半抗原CPAOZ。取70 mg AOZ快速溶解于1 mL 1 mol/L HCl中,為A液;65 mg 4-CBA加入2 mL超純水,逐漸加入DMF,直至4-CBA完全溶解,為B液;將A、B液混勻,室溫反應48 h。5000 r/min離心10 min,棄上清,將沉淀用乙醇洗滌三次,每次洗滌后重復上述離心。將沉淀物-80 ℃冷凍12 h,真空干燥,得到白色粉末CPAOZ。通過核磁共振法對CPAOZ進行鑒定[20]。

圖1 半抗原CPAOZ的合成示意圖Fig.1 The symthesis process of CPAOZ

1.2.2 合成包被原CPAOZ-OVA 利用活化酯法將CPAOZ與卵清蛋白(OVA)偶聯,合成包被抗原CPAOZ-OVA[21]。取4.0 mg CPAOZ,2.1 mg NHS,4.2 mg DCC,溶解于300 μL DMF,4 ℃反應過夜,5000 r/min離心10 min,取上清,為A液;30.0 mg OVA溶解于5 mL 0.01 mol/L pH7.4 PBS中,為B液;將A、B液混勻,4 ℃反應8 h,5000 r/min離心10 min,取上清。將上清透析5 d,每8 h換一次PBS透析液。透析結束后,5000 r/min離心10 min,取上清,加入等體積甘油于-20 ℃下保存備用。通過UV-Vis法鑒定。

1.2.3 AOZ間接競爭CLEIA法操作步驟 用碳酸鹽緩沖液(pH9.6,0.05 mol/L)將包被原CPAOZ-OVA稀釋,每孔100 μL加入到化學發光板中,孵育一定時間;將各孔包被液甩出,用PBST溶液(含0.05% Tween-20,pH7.4,0.01 mol/L的PBS)洗滌2 min,洗滌5次,每次甩干后拍干;每孔加入200 μL脫脂乳粉,37 ℃封閉2 h,洗板3次;每孔加入50 μL梯度稀釋的標品NPAOZ溶液和50 μL稀釋后單克隆抗體,每個濃度做三個平行;空白對照組,用標品稀釋液PBS代替,37 ℃孵育,洗版3次;每孔加入100 μL稀釋后的酶標二抗,37 ℃反應1 h,洗板4次;每孔加入現配發光液100 μL,室溫下避光反應4 min,用酶標儀檢測各孔化學發光強度(relative unit,RLU)[22]。

1.2.4 間接競爭CLEIA 法條件優化 包被原與抗體的最佳稀釋倍數由棋盤法來確定。設置包被原稀釋倍數為1000、2000、4000、8000、16000、32000,抗體稀釋倍數為10000、20000、40000、80000、160000、320000,封閉液用1%的脫脂乳粉,封閉時間2 h,競爭藥物NPAOZ的濃度為100 ng/mL,競爭時間為1 h,酶標二抗稀釋倍數為4000倍,按照1.2.3節的步驟測定RLU值,同時做陰性對照(不加標品NPAOZ),每個實驗做3組平行,取平均值,通過考察添加標品NPAOZ的RLU值(B)與不添加標品NPAOZ的RLU值(B0)的比值(B/B0)確定最佳稀釋倍數。

通過單因素實驗確定封閉液濃度、競爭時間、酶標二抗稀釋倍數。分別設置0.5%、1%和2%脫脂乳粉3種不同封閉液;3組不同的競爭時間:0.5、1、2 h;3個不同的酶標二抗稀釋倍數:4000、6000、8000倍,按照1.2.3節的步驟分別測定化學發光強度RLU值,每組做3個平行,競爭物NPAOZ系列濃度梯度為100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL。

1.2.5 建立標準曲線 根據上述實驗確定的最佳反應條件,按照1.2.3節的步驟在濃度梯度為100、20、4、0.8、0.16、0.032 ng/mL的NPAOZ溶液下進行操作,測定RLU值,每個質量濃度做3組平行,繪制標準曲線,得出線性方程,計算IC50(IC50為B/B0為0.5時相對應的NPAOZ質量濃度)和線性范圍(IC20～IC80)[23]。

1.2.6 方法特異性 特異性的強弱可通過酶標抗原(或特異性抗原)和結構類似物在與抗體結合時的交叉程度來反映,以交叉反應率(cross reactivity,CR)衡量,CR越小,該方法的特異性越好。利用呋喃唑酮原藥、AOZ衍生物NPAOZ及其他代謝物衍生物NPSEM、NPAMOZ、NPAHD作為競爭藥品,分別采用間接競爭CLEIA和間接競爭ELISA方法進行交叉實驗,并按照下式計算各個藥品的交叉率CR。

表1 不同包被原和抗體稀釋倍數下的B/B0值

1.3 數據分析

以NPAOZ濃度的對數值為橫坐標,以B/B0值為縱坐標,利用excel軟件分別繪制各條件下標準曲線,取標準曲線中線性范圍較好的一段得出線性方程,計算每條曲線的IC50和RLUmax/IC50(RLUmax為每一條件下不同NPAOZ濃度中最大化學發光值)。利用origin軟件畫出每個條件下的IC50和RLUmax/IC50雙縱軸線,以IC50和RLUmax/IC50作為確定最佳條件的依據,雙縱軸線中IC50越小,RLUmax/IC50越大,靈敏度越高[23-24]。

2 結果及分析

2.1 鑒定半抗原CPAOZ

1H NMR(600 Hz,DMSO-d6)(13.07(s,1H),8.01(d,J=8.4 Hz,2H),7.89(s,1H),7.84(d,J=8.4 Hz,2H),4.52(t,J=7.8 Hz,2H),3.97(t,J=7.8 Hz,2H)。說明合成了半抗原CPAOZ。

圖2 CPAOZ的1H NMR譜圖Fig.2 The 1H NMR spectrum of CPAOZ

2.2 鑒定包被原CPAOZ-OVA

由圖3可見,載體蛋白OVA的最大紫外吸收峰在280 nm處,半抗原CPAOZ的最大紫外吸收峰在293 nm處,包被原 CPAOZ-OVA的最大吸收峰在283 nm處。包被原CPAOZ-OVA相對于載體蛋白OVA和半抗原CPAOZ的最大吸收峰發生了明顯的偏移,且吸收曲線同時也發生了變化,說明包被原CPAOZ-OVA合成成功。

圖3 CPAOZ、OVA和CPAOZ-OVA紫外掃描圖譜 Fig.3 The UV spectrum of CPAOZ,OVA and CPAOZ-OVA

2.3 確定最優條件

2.3.1 確定包被原與抗體稀釋倍數 由表1可見，包被原稀釋倍數為2000倍，抗體稀釋倍數為20000倍時，B/B0最小，為0.20×10-2。在競爭化學發光酶免疫反應中，B/B0越小，靈敏度越高，所以最后選擇包被原稀釋倍數為2000倍，抗體稀釋倍數為20000倍。

2.3.2 確定封閉液 由圖4中三條曲線的線性方程算出各自的IC50值,進而計算出各自的RLUmax/IC50值,計算結果如圖5。2%脫脂乳粉的IC50值小于1%脫脂乳粉和0.5%脫脂乳粉,同時2%脫脂乳粉的RLUmax/IC50值最大,根據IC50越小,RLUmax/IC50越大,靈敏度越高,選擇最佳封閉液為2%的脫脂乳粉。

圖4 AOZ ic-CLEIA封閉液優化Fig.4 Optimization of blocking liquid for ic-CLEIA of AOZ

圖5 封閉液優化實驗IC50與RLUmax/IC50結果Fig.5 The result of IC50 and RLUmax/IC50in the blocking buffer optimal experiment

2.3.3 確定競爭時間 同理,由圖6和圖7可知,競爭2 h的IC50值小于1 h和0.5 h的,同時競爭2 h的RLUmax/IC50值最大,因此,選擇最佳競爭時間為2 h。

圖6 AOZ ic-CLEIA競爭時間優化Fig.6 Optimization of competitive reaction time for ic-CLEIA of AOZ

圖7 競爭時間優化實驗IC50與RLUmax/IC50結果Fig.7 The result of IC50 and RLUmax/IC50in the competitive reaction time optimal experiment

2.3.4 確定酶標二抗稀釋倍數 同理,由圖8和圖9可知,稀釋4000倍、6000倍與8000倍的IC50值差距不大,但稀釋4000倍的RLUmax/IC50最大,因此,選擇二抗最佳稀釋倍數為4000倍。

圖8 AOZ ic-CLEIA酶標二抗稀釋倍數優化Fig.8 Optimization of second antibody for ic-CLEIA of AOZ

圖9 酶標二抗稀釋倍數優化實驗IC50與RLUmax/IC50結果Fig.9 The result of IC50 and RLUmax/IC50in the dilution multiple of second antibody optimal experiment

2.4 方法學評價

2.4.1 建立標準曲線 繪制出的標準曲線為免疫法典型的倒“S”曲線,如圖10所示,線性方程為y=-0.30082x+1.364,R2=0.91428,得出的IC50為0.74 ng/mL,線性范圍是0.075～7.396 ng/mL。

圖10 AOZ ic-CLEIA標準曲線Fig.10 Standard curve of AOZ by ic-CLEIA

2.4.2 特異性測定結果 由表2可知,AOZ間接競爭CLEIA法對呋喃唑酮原藥的CR為23.4%,AOZ間接競爭ELISA法對呋喃唑酮原藥的CR為32.1%,兩種方法與其他結構類似物均交叉反應率小于0.1%,但是呋喃唑酮進入動物組織后,迅速代謝為AOZ,因此動物體內并無呋喃唑酮原藥與抗體競爭,所以兩種方法的特異性都比較強。

表2 ic-CLEIA法與ic-ELISA法的特異性測定結果

3 結論

本實驗成功合成了包被原CPAOZ-OVA,為間接競爭CLEIA法的建立提供基礎。通過對包被原與抗體稀釋倍數、封閉液濃度、競爭時間、酶標二抗稀釋倍數等條件進行優化,最終確定此方法的靈敏度IC50為0.74 ng/mL,線性范圍是0.075～7.396 ng/mL,達到相關檢測限量要求[24],最后通過交叉反應驗證了該方法特異性強。根據丁鍇[14]建立的此方法得出,該方法批間回收率范圍在83%～103%之間,批內回收率范圍在78%～113%之間,批間變異系數在5%～27%之間,批內變異系數在4%～18%之間,從而說明該方法的重復性好,準確度和精密度高。

雖然本實驗靈敏度與任海濤[25]等建立的間接競爭ELISA方法相比并沒有顯著提高,間接競爭CLEIA方法的研究也比較常見,但是由于目前國內對此方法以及試劑盒的研制仍然沒有統一的標準,需要學者們更加深入研究下去。本實驗從人工抗原的合成到間接競爭CLEIA方法的建立組成了一個比較完整的體系,因此,可作為呋喃唑酮代謝物檢測的理論基礎,為研制快速檢測試劑盒提供依據。

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Synthesis of furazolidone metabolite artificial antigen and development of indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay

HUANG Deng-yu1,2,GAO Wen-jing1,HUANG Zhong-qian1,GAO Li-xia1,FENG Min1,YANG Xiu-song3,*

(1.School of Life Science,Shanxi University,Taiyuan 030006,China; 2.Food and Drug Fast Inspection Center of Shanxi University,Taiyuan 030006,China; 3.China Food and Drug Administration Institute of Executive Development,Beijing 100073,China)

An indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay(ic-CLEIA)was used for determination and identification of the furazolidone metabolite in animal-derived food. AOZ can be translated into hapten CPAOZ by derivative reaction. CPAOZ-OVA,as the coating antigen,was prepared by activated ester method. After optimizing the dilution multiple of coating antigen and anti-body,blocking buffer,competitive reaction time and the dilution multiple of second antibody,a standard curve was established,and finally the specificity of the method was evaluated. The results indicated that,the optimum dilution multiple of coating antigen was 2000-fold,the anti-body was 20000-fold. Blocking buffer was dried skim milk at the concentration of 2%. The competitive reaction time was 2 h,and the ideal dilution multiple of secondary antibody was 4000-fold. The linearity range was 0.075～7.396 ng/mL,and half-inhibitory concentration(IC50)value was 0.74 ng/mL. The cross-reactivity value between AOZ and furazolidone original drug was 23.4%,and cross reactivity value with other analogues and derivatives was <0.1%. The method with demonstrated excellent sensitivity and specificity can provide the basis for rapid detection of AOZ content in animal-derived food for supervision department.

furazolidone;indirect competitive chemiluminescence enzyme immunoassay;animal-derived food;rapid detection

2016-11-18

黃登宇(1968-),男,博士,副教授,研究方向：食品安全檢測,E-mail:Huangdy1110@126.com。

*通訊作者:楊秀松(1975-),男,碩士,副教授,研究方向：食品科學與食品安全,E-mail:yxs@cfdaied.org。

TS207.3

A

1002-0306(2017)09-0294-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.048