基于納米金標記-適配體識別對魚中磺胺二甲氧嘧啶的定量檢測

劉秀英,李伊涵,李巧素,朱力杰,高 雪,湯軼偉,勵建榮

(渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

基于納米金標記-適配體識別對魚中磺胺二甲氧嘧啶的定量檢測

劉秀英,李伊涵,李巧素,朱力杰,高 雪,湯軼偉,勵建榮

(渤海大學食品科學與工程學院 遼寧省食品安全重點實驗室 生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心,遼寧錦州 121013)

納米金因具有獨特的光學效應,已成為極具應用前景的標記材料。適配體對目標分子具有較強特異識別能力,被廣泛應用于分析檢測領域。本文利用納米金標記適配體,構建了一種磺胺二甲氧嘧啶的可視化檢測新方法。利用該方法對磺胺二甲氧嘧啶進行定量分析,在添加水平分別為2、7 ng/mL下,測得回收率為89.86%和85.64%,日內日間相對標準偏差分別為4.00%、5.28%和5.88%、6.67%。方法的檢測線性范圍為1～10 ng/mL,檢測限為1 ng/mL。以上結果表明該方法準確度高,精密度好,將其應用于鱸魚、鯰魚等實際水產樣品中磺胺二甲氧嘧啶的定量分析具有可行性。

適配體,納米金,磺胺二甲氧嘧啶,定量檢測,水產品

磺胺二甲氧嘧啶(Sulfadimethoxine,SDM),化學結構見圖1。該藥物屬于人工合成的廣譜抗菌藥,是磺胺類藥物中殘留超標的主要品種,廣泛應用于水產養殖中。長期低劑量攝入該藥物,可導致慢性中毒,影響機體的泌尿和免疫系統,甚至誘發甲狀腺癌,嚴重威脅人類健康[1-2]。隨著SDM的廣泛使用,國際上許多國家和地區都制定了相應的標準,并且對最高殘留限量的要求也越來越嚴格[3-4]。

目前國內外對SDM的檢測手段包括HPLC、HPLC-MS等儀器法[5-8],但這些方法所需設備昂貴、對操作技術人員要求較高,不能滿足快速檢測的需求。近年來免疫分析方法也有報道[9],但傳統生物抗體生產周期較長,且保存條件嚴格,在一定程度上制約了該技術的應用。適配體(Aptamer)是利用體外篩選技術從核酸分子文庫中得到的一類單鏈寡核苷酸片段(DNA或RNA)。與抗體相比,適配體具備篩選化學穩定性好,易于修飾、合成成本低等優點。更重要的是,其能與靶分子發生特異性結合,且親和力高、特異性強[10-11]。作為一種新型生物分子探針,適配體在醫學、生命科學以及生物分析等領域獲得了快速應用和發展[12-15]。此外,納米金具有制備過程簡單、生物相容性好、易于標記等諸多優點。特別是納米金的粒子間距光學效應,在分散狀態下呈紅色,發生凝聚后變為藍色,且該效應可見度極高,使其在比色分析領域發展迅速[16-19]。研究中利用納米金特有的粒子間距光學效應為傳感信號,以SDM-aptamer為識別元件,構建一種高靈敏比色檢測法用于SDM的定量測定。所構建方法檢測速度快、操作簡單,與儀器法和免疫分析法相比,檢測成本低,為SDM的高靈敏度檢測提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

研究中所用的鱸魚和鯰魚 均購自于當地的水產市場；SDM-aptamer 委托上海生物工程有限公司合成,序列為:GAGGGCA ACGAGTGTTTATAGA[20]。氯金酸 成都格雷西亞化學技術有限公司;磺胺二甲氧嘧啶(CAS:122-11-2,純度 99%) 上海阿拉丁試劑有限公司;檸檬酸鈉、氯化鈉等化學試劑均為國產分析純。

TU-1801型紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;DF-101D型集熱式磁力加熱攪拌器 河南鞏義市予華儀器廠。

1.2 檢測原理

檢測原理如圖2所示。本研究中的納米金是采用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備得到的,因此在納米金粒子表面存在大量的檸檬酸根離子,由于靜電排斥力作用,納米金不會發生凝聚而呈現紅色[21]。而高濃度鹽溶液會破壞納米金溶液的穩定性,使其發生凝聚,由于納米金的顏色具有光距離依賴特性,粒子間距縮小導致溶液顏色發生變化,由紅色變為藍色。單鏈DNA能夠附著在納米金表面,進而可以有效防止納米金顆粒在高濃度鹽溶液中發生凝聚,使溶液保持紅色[22]。因此,在向反應體系加入氯化鈉溶液之前,預先加入SDM-aptamer,可以有效防止溶液顏色發生變化。然而當反應體系中存在被測物SDM時,由于SDM能夠與 SDM-aptamer特異性識別結合,同時SDM-aptamer的空間結構發生改變,使SDM-aptamer從納米金表面脫落。部分納米金失去SDM-aptamer保護后,暴露于氯化鈉溶液中,發生聚集,顏色由紅色變為藍色。加入的靶標分子的濃度不同,納米金聚集的程度不同,導致納米金呈現不同顏色的變化,從而實現可視化的定量檢測。

圖2 檢測原理示意圖Fig.2 Schematic diagram of detection principle

1.3 納米金的制備

參考MAYE等的方法稍作改進[23]。具體步驟:將50 mL濃度為2 mmol/L的氯金酸溶液置于100 ℃集熱式磁力攪拌器中加熱10 min后,加入5 mL濃度為38.8 mmol/L檸檬酸鈉溶液,繼續在100 ℃下劇烈攪拌反應20 min,溶液變紅,取出反應液室溫放冷,得到納米金溶液。

1.4 磺胺二甲氧嘧啶的檢測

分別取100 μL SDM-aptamer與50 μL不同濃度的SDM溶液,室溫下孵育5 min后,加入100 μL納米金溶液,繼續反應5 min后,加入10 μL濃度為1 mol/L氯化鈉溶液,充分混合后再孵育5 min,最后吸取最終反應液200 μL于微量比色皿中,用紫外分光光度計進行測定。根據450～700 nm波長范圍內吸光度值的變化計算SDM的濃度。

1.5 實際水產樣品的測定

樣品前處理參照農業部958號公告-12-2007的方法并進行了一定改進[24]。稱取一定量樣品于離心管中,加乙酸乙酯,渦旋提取10 min,4000 r/min離心5 min,收集上清液,重復提取一次,合并兩次提取液。將提取液濃縮至5 mL。向濃縮后的樣品溶液中加入正己烷5 mL,渦旋混和30 s,3000 r/min離心5 min,棄正己烷,取下層液備用。樣品具體測定過程按照1.4磺胺二甲氧嘧啶的檢測中步驟進行。

1.6 方法學考察

研究對所建立方法的線性范圍進行考察,并通過回收率、相對標準偏差的測定對方法的準確度與精密度進行評價。數據主要是通過Origin8軟件進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 納米金的表征

納米金隨其直徑大小不同可以呈現紅色至藍色的不同顏色變化,因此合成粒徑均勻的金納米粒子是關鍵。本研究利用掃描電子顯微技術對合成的納米金粒子進行表征,結果見圖3。由圖可知,在放大倍率為2萬倍時觀察發現,制備得到的納米金是具有單分散性的近正圓形納米顆粒。此外,隨機選取10個顆粒測定其粒徑,計算金納米粒子的平均粒徑為(0.24±0.05) μm。

表1 SDM定量測定的準確度和精密度評價

圖3 納米金的掃描電鏡圖像Fig.3 SEM image of gold nanoparticle

注：測得量用平均值±SD表示。2.2 SDM的定量測定

2.2.1 線性范圍 當體系中含有目標分子SDM,SDM-aptamer優先與SDM結合,使部分納米金失去SDM-aptamer的保護而發生凝聚。SDM的濃度不同,導致納米金凝聚程度也不同。如圖4所示,在波長530 nm處的特征峰值最大的光譜曲線為未加入SDM時納米金(Aunp)的掃描結果。隨著加入SDM的濃度不斷增大(從上至下分別為1、2、4、7、10 ng/mL),納米金凝聚程度也越大,在波長530 nm處的特征峰值逐漸減小,且吸光值之比隨著SDM的濃度的增加呈現規律性地變化。以加入的SDM的濃度為橫坐標,以納米金溶液與對應反應液在波長530 nm處的吸光值之比為縱坐標,繪制標準曲線。得到該方法的線性范圍為1～10 ng/mL,線性回歸方程為y=0.2114x+1.3078 (R2=0.9909),線性關系良好,檢測限為1 ng/mL。

圖4 不同濃度下體系的紫外光譜圖Fig.4 Ultraviolet spectrogram under differdent concentration注:插圖為標準曲線。

2.2.2 方法的準確度 準確度是定量測定的必要條件。為了更好的了解方法的準確性,研究中還利用添加回收實驗測定了不同加標水平下SDM的回收率值,每個水平進行6次重復測定。結果如表1所示,在添加水平分別為2、7 ng/mL下,得到樣品的回收率值分別為89.86%和85.64%。說明本研究中所建立的方法準確度良好。

2.2.3 方法的精密度 研究中還通過計算相對標準偏差(RSD)對方法的日內和日間精密度進行了評價。日內精密度選取2、7 ng/mL兩種濃度樣品,每種濃度的樣品均進行6次平行實驗,根據重復測定的結果計算日內RSD值。結果如表1所示,兩種濃度水平的日內RSD值分別為4.00%和5.28%。日間精密度同樣選取2、7 ng/mL兩種濃度樣品,每種濃度配制6份,置冰箱中冷藏,自配制樣品之日開始,按研究中所建立的方法操作,每天取出一份測定,計算每種濃度樣品的RSD值。兩種濃度水平的日間RSD值分別為5.88%和6.67%。日內和日間精密度實驗所得RSD值均在10%以內,說明研究中所建立的方法精密度良好。

2.3 實際樣品的測定

因為SDM作為細菌性疾病的治療藥物,被廣泛應用于水產養殖中。像魚類等水產樣品基質較復雜,為了進一步考察該方法檢測實際樣品時的基質效應,選取鱸魚和鯰魚兩種市場上常見魚類作為樣品,利用研究中所建立的方法進行實際樣品檢測。測定結果如表2所示,鱸魚和鯰魚的添加回收分析得到的回收率分別為82.41%和76.96%,RSD值為4.95%和2.80%,說明本方法可用于實際水產樣品中SDM的檢測分析。

表2 實際樣品中SDM的定量分析

注：測得量用平均值±SD表示。

3 結論

本研究將適配體識別技術與納米金粒子間距光學效應相結合,建立一種新型SDM檢測方法,并綜合考察了該方法的線性范圍、準確度、精密度。結果表明所建立方法線性范圍為1～10 ng/mL。通過對兩種實際水產樣品鱸魚和鯰魚中SDM進行定量分析,得到回收率為82.41%和76.96%,RSD值為4.95%和2.80%,證明該方法應用于水產樣品中SDM的檢測分析具有可行性。將適配體與納米金相結合的分析研究雖已有報道,但多集中于醫學領域分析,如對溶血酶等目標分子進行測定,應用于食品分析領域中抗菌劑測定的相關報道很少。本研究中所建立的方法為水產品中SDM簡單、高效、低成本、可視化的定量分析提供了一種全新而且可行的思路。

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Quantitative detection of sulfadimethoxine in fish based on the recognition of gold nanoparticles labeled aptamers

LIU Xiu-ying,LI Yi-han,LI Qiao-su,ZHU Li-jie,GAO Xue,TANG Yi-wei,LI Jian-rong

(College of Food Science and Technology,Bohai University;Food Safety Key Lab of Liaoning Province; National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China)

Gold nanoparticles(Aunps)have been investigated as novel marking materials for their unique luminescent properties. Aptamer is a type of recognition materials with specific binding ability to capture target molecules and have been widely applied in the field of analysis and detection. In our study,a novel detection method for quantitative analysis of sulfadimethoxine was developed based on AuNPs and aptamer. The proposed method was applied to the analysis of real samples. The recoveries were 85.64% and 89.86%,and the relative standard deviation(RSD)values were 4.00%,5.28%,and 5.88%,6.67%,for intra-and inter-day tests,respectively. The linear range of the method was 1～10 ng/mL,and the detection limit was 1 ng/mL. The above results suggested that the proposed method was highly accurate,and precise,and was feasible for the quantification of target sulfadimethoxine in aquatic product.

aptamer;gold nanoparticles;sulfadimethoxine;quantitative detection;aquatic product

2016-10-28

劉秀英(1987-)，女，博士，講師，研究方向：食品質量與安全，E-mail:xiuyingliu727@126.com。

國家自然科學基金項目(31601510)；遼寧省農業領域青年科技創新人才培養計劃(2015001)。

TS207.3

A

1002-0306(2017)09-0281-04

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.045