響應面法優化黑果枸杞中原花青素提取工藝

趙文娟,宋 揚,李文婧,楊洪江,*

(1.工業微生物教育部重點實驗室,天津科技大學生物工程學院,天津 300457; 2.齊魯工業大學生物工程學院,山東濟南 250353; 3.山東省食品發酵工業研究設計院,山東濟南 250013)

響應面法優化黑果枸杞中原花青素提取工藝

趙文娟1,宋 揚2,李文婧3,楊洪江1,*

(1.工業微生物教育部重點實驗室,天津科技大學生物工程學院,天津 300457; 2.齊魯工業大學生物工程學院,山東濟南 250353; 3.山東省食品發酵工業研究設計院,山東濟南 250013)

為了提高原花青素的得率,在單因素實驗的基礎上,采用響應面實驗設計優化從黑果枸杞中提取原花青素的工藝。通過考察乙醇體積分數、提取溫度、提取時間三個因素及其交互作用對原花青素得率的影響,建立了該工藝的二次多項數學模型。實驗表明,曲面回歸方程擬合性良好,乙醇體積分數、提取溫度、提取時間對響應值均有極顯著影響,在乙醇體積分數56%、提取溫度46 ℃、提取時間48 min的條件下,黑果枸杞原花青素得率為4.315%,與響應面預測值相比,相對誤差為1.5%,說明本研究方法是一種適合于從黑果枸杞中提取原花青素的方法。

黑果枸杞,原花青素,提取,響應面

黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr.)是茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)多年生耐鹽、抗旱植物,天然生長于我國西北荒漠區,有極強的抗旱、抗寒、耐鹽堿特性[1]。黑果枸杞的果實中含有大量的原花青素、花青素、多糖、維生素等成分,素有“軟黃金”之稱[2]。《晶珠本草》記錄,黑果枸杞可用于治療心熱病、心臟病、月經不調等病癥[3];《維吾爾藥志》記載,其果實及根皮對尿道結石、癬疥、齒齦出血等疾病治療效果顯著,民間多用其作滋補強壯、明目降壓之用[4]。汪洋等人研究表明黑果枸杞烘干果實中的原花青素含量高達1.426%～9.024%,遠遠高于其花青素含量0.069%～0.840%[5]。原花青素(Proanthocyanidins)是一種由黃烷-3-醇單體縮合而成的聚多酚類物質,廣泛地存在于植物的核、皮或籽中,有水溶、無毒、安全性好等優點,有保護心血管、抗輻射、抗疲勞、清除自由基等作用,應用前景廣泛[6]。葡萄籽和葡萄皮渣是葡萄酒生產的副產品,是提取原花青素的主要原料[7],已有以葡萄籽、葡萄皮渣中為原料提取原花青素的研究報道[8-9]。黑果枸杞中含有豐富的原花青素,孫楠等人對黑枸杞、枸杞、黑加侖中的原花青素含量進行比較,發現黑枸杞中的原花青素含量遠高于紅枸杞和黑加侖,黑枸杞是提取原花青素的理想資源[10]。隨后張巖波等人[11]對比檢測了不同產地,不同種植方式的黑果枸杞中的原花青素含量,表明產自青海和新疆地區的黑果枸杞中的原花青素含量較高,同時人工種植方式收獲的黑果枸杞中也含有較多的原花青素,進一步證實了其研究和開發價值。任曉娜等人[12]利用正交實驗法對黑果枸杞中的原花青素提取工藝進行優化,但是得率僅達到2.99%,本研究以新疆產黑果枸杞為原料,利用響應面設計優化了原花青素的提取工藝,旨在獲得更高的原花青素得率,為黑枸杞的綜合開發利用打下基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

天然黑果枸杞 購于新疆烏魯木齊市場,自然晾干,實測水分含量為7.9%,密封、干燥、低溫、避光儲存;兒茶素(Cas:154-23-4)標準品 購自上海哈靈生物科技有限公司;無水乙醇,甲醇、香草醛均為分析純 購自國藥集團化學試劑有限公司;濃鹽酸為分析純 購自萊陽經濟技術開發區精細化工廠。

FW80型高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器有限公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限公司;SHA-C型水浴恒溫震蕩器 金壇市開發區吉特實驗儀器廠;GB204型分析天平 Mettler-Toledo公司;XW-80A型旋渦混合器 上海青滬浦西儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準曲線的繪制 準確稱取兒茶素標準品25 mg,用甲醇定容至25 mL,混合均勻后靜置,得到 1 mg/mL 的兒茶素標準品儲備液,備用。從上述儲備液中分別移取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mL加入10 mL的比色管中,并用甲醇定容。使用濃鹽酸-香草醛法進行原花青素含量檢測和標準曲線的繪制[9]。分別吸取上述濃度梯度的樣品1 mL,并依次添加4%的香草醛-甲醇溶液3 mL、濃鹽酸1.5 mL,將此反應體系置于40 ℃水浴鍋內避光反應30 min,并以1 mL甲醇替代兒茶素溶液作為空白,于500 nm波長下測定吸光度,繪制標準曲線。

1.2.2 黑果枸杞原花青素的提取 用粉碎機將黑果枸杞粉碎至40目用于原花青素提取實驗。稱取0.3 g已經粉碎好的黑果枸杞置于比色管中,按照一定料液比加入一定體積分數的乙醇溶液,蓋上比色管口,并迅速用錫箔紙包住比色管外壁避免光照。將比色管內料液混勻后置于電熱恒溫水浴震蕩箱中,在一定溫度和時間下進行震蕩提取,轉速為60 r/min。提取結束后,過濾并收集清液,濾渣在同樣的條件下重復提取一次后合并濾液并定容至100 mL作為提取液,使用濃鹽酸-香草醛法檢測提取液中的原花青素的含量,并計算黑果枸杞中的原花青素得率。

原花青素得率(%)=提取液的原花青素濃度×提取液體積/黑果枸杞的質量×(1-黑果枸杞的水分含量)

1.2.3 單因素實驗 采用1.2.2方法提取黑果枸杞中的原花青素,提取條件為:固化反應條件為料液比1∶30 g/mL,提取溫度40 ℃、提取時間90 min,考察不同體積分數的乙醇對原花青素得率的影響(0、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%);固化反應條件為料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數50%,提取時間90 min,考察不同溫度(30、40、50、60、70 ℃)對原花青素得率的影響;固化反應條件為料液比1∶30 g/mL、乙醇體積分數50%、提取溫度50 ℃,考察不同的提取時間(15、30、45、60、75、90 min)對原花青素得率的影響;固化每次反應條件為乙醇體積分數50%,提取溫度50 ℃、提取時間2 h,考察不同料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30 g/mL)對原花青素得率的影響。

1.2.4 Box-Behnken中心組合實驗設計 在單因素實驗的基礎上,每個因素選取三個對原花青素得率影響較大的水平,建立三因素三水平的Box-Behken中心組合實驗,以原花青素得率為響應值,各因素的三個水平采用-1、0、1進行編碼,如表1。

表1 響應曲面設計實驗因素水平和編碼

2 結果與分析

2.1 兒茶素標準曲線的繪制

實驗得到回歸方程為Y=0.0033X+0.0302,相關系數R2=0.9993,表明原花青素在0～400 μg/mL濃度范圍內與吸光度值呈現良好的線性關系。以兒茶素濃度為橫坐標,對應吸光度值為縱坐標建立標準曲線,如圖1所示。

圖1 兒茶素標準曲線Fig.1 Standurd curve of catechin

2.2 單因素實驗

2.2.1 乙醇體積分數對原花青素得率的影響 從圖2中可以看出,隨著乙醇體積分數的不斷增大原花青素得率呈先升高再下降趨勢,當乙醇體積分數為50%時,得率最高。根據有機溶劑“相似相溶原理”,原花青素的溶出度與溶劑的極性和原花青素本身的極性相關,極性相似可達到最大溶出度。根據單因素實驗結果,選擇最佳的乙醇體積分數為50%。根據曲線變化規律,在Box-Behnken中心組合實驗設計中,乙醇體積分數選取40%～60%范圍。

圖2 乙醇體積分數對原花青素得率的影響Fig. 2 Effect of alcohol concentration on yield of proanthocyanidins

2.2.2 提取溫度對原花青素得率的影響 從圖3中可以看出,溫度在50 ℃以下時,原花青素得率呈現上升的趨勢,后隨著溫度的增加,得率逐漸下降。這是因為高溫雖然能促進物質的溶出,但同時也會使原花青素失活。溫度在50 ℃時得率最高,在Box-Behnken中心組合實驗設計中選取40～60 ℃為實驗溫度范圍。

圖3 提取溫度對原花青素得率的影響Fig.3 Effect of temperature on yield of proanthocyanidins

2.2.3 提取時間對原花青素得率的影響 由圖4可知,在初始階段,原花青素得率隨時間的延長而增加,提取時間在30～60 min時得率達到最高水平范圍,此后繼續延長提取時間,原花青素的提取量略有下降并趨于平穩。產生此結果的原因在于時間過短原花青素不能充分提取,時間過長導致原花青素酚羥基結構破壞,影響得率,且不夠經濟。為了充分提取出原料中所含的原花青素,提高原花青素得率,在Box-Behnken中心組合實驗設計中選取提取時間為40～60 min。

圖4 提取時間對原花青素得率的影響Fig.4 Effect of time on extraction yield of proanthocyanidins

2.2.4 料液比對原花青素得率的影響 由圖5可知,原花青素得率先隨著料液比的增加而升高,但是料液比達到1∶20 g/mL時,原花青素得率變化極其緩慢,并在此后呈現較平穩趨勢,這是隨著料液比增加,浸提物與提取液的接觸面積增大,從而使提取結束之后殘留在料渣中的原花青素損失越來越少,當料液比達到一定數值后,這種損失會維持在較低水平并且較難繼續降低而不再呈現明顯的函數變化關系,不屬于提取參數優化的顯著性因素。因此,綜合考慮料液比的增加帶來效果、造成的資源和能源消耗等因素,最終選取料液比為1∶25 g/mL進行實驗。

圖5 料液比對原花青素得率的影響Fig.5 Effect of ratios of water to material on yield of proanthocyanidins

2.3 Box-Behnken實驗設計(BBD)結果及數據分析

2.3.1 BBD實驗結果 根據單因素實驗結果,由Minitab 17統計分析軟件設計出的實驗方案及實驗結果如表2所示,以原花青素得率為響應值,以乙醇體積分數,提取溫度,提取時間為自變量,建立三因素三水平中心組合實驗設計共包括15個實驗方案,其中12個析因實驗,3個中心點實驗,用以計算實驗誤差。

表2 響應面實驗設計及原花青素得率

2.3.2 回歸方程擬合及方差分析 采用Minitab17對所得數據進行回歸分析,結果見表3,對各因素擬合后得到回歸方程:

Y(%)=4.2107+0.1223A-0.0455B+0.0673C-0.1536A2-0.1251B2-0.2216C2-0.0210AB-0.1705AC+0.1840BC

表3 回歸模型及方差分析

表4 回歸方程系數顯著性檢驗表

由表4可知,一次項和二次項的影響顯著,交互項AC和BC對響應值影響也顯著,這說明實驗因子對響應值的影響不是直接線性關系,同時各因素對響應值顯著性的排序為A>C>B。

2.3.3 響應面圖分析 響應面是優化存在多因素影響實驗條件的尋優方法,通過固定數量的實驗次數可以連續的對實驗因素進行分析,并得到直觀的3D曲面圖進而評估各因素間的交互作用。根據軟件Minitab17獲得響應值的3D曲面,分析各因素對原花青素得率的影響及各因素間的相互作用。圖6～圖8中所示為當乙醇的體積分數(A)、提取溫度(B)、提取時間(C)中任意一個因素為零水平時,其余兩個因素間的交互作用對原花青素得率的影響。

圖6 Y=f(A,B)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.6 Response surface plots of variable parameters A and B on the yield of proanthocyanidins

圖7 Y=f(A,C)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.7 Response surface plots of variable parameters A and C on the yield of proanthocyanidins

圖8 Y=f(B,C)的響應面立體分析及其等高線圖Fig.8 Response surface plots of variable parameters B and C on the yield of proanthocyanidins

根據回歸方程得出不同因素的響應面結果見圖6～圖8,從該組圖可以分析出多個自變量對響應值的影響。在響應面圖中,曲面越陡峭,則該因素對響應值的影響越顯著。同時,在控制兩個自變量之外的因素不變的情況下,兩個有交互的自變量對響應值的影響也可以從響應面圖的曲面上看出。圖6所示為固定提取時間為零水平,乙醇體積分數和提取溫度對原花青素得率的影響和兩者之間的交互作用。乙醇體積分數較低時,得率隨提取溫度增加呈先上升后下降的趨勢;乙醇體積分數較高時,得率隨提取溫度呈下降趨勢,溫度越高,下降幅度越大。雖然乙醇的體積分數和提取溫度對響應值而言都具有顯著影響,但是二者交互對響應值的影響不顯著(p=0.269)。

圖7所示為固定提取溫度為零水平,乙醇體積分數和提取時間對原花青素得率的影響和兩者之間的交互作用。在乙醇體積分數較低時,原花青素得率隨提取時間延長呈上升趨勢;隨著乙醇體積分數的提高,原花青素得率轉為下降的趨勢,并且乙醇體積分數和提取時間的交互對響應值的影響極顯著(p<0.001)。

圖8所示為固定乙醇體積分數為零水平,提取溫度和提取時間對原花青素得率的影響和兩者之間的交互作用。在實驗的提取溫度范圍內,隨著提取時間的延長原花青素的得率呈先升高后下降的趨勢,這是因為在較低溫度條件下,黑果枸杞中原花青素穩定性較好;隨著溫度的升高和時間的延長,原花青素穩定性逐漸降低,其含量檢測結果呈降低趨勢,且溫度越高,含量檢測結果降低越快,因此提取溫度和提取時間的交互會對原花青素的活性形成影響[13]。

2.3.4 驗證實驗 對回歸方程求解,得率達到最大值時的提取條件為乙醇體積分數為55.60%,提取溫度為45.77 ℃,提取時間為47.612 min,最高原花青素得率達到4.250%,為方便實際操作將實驗條件定為乙醇體積分數為56%,提取溫度為46 ℃,提取時間為48 min。取三等份黑果枸杞進行原花青素提取平行驗證實驗,驗證實驗所得得率分別為4.308%、4.312%、4.325%,平均得率為4.315%,與預測值相對誤差為1.5%,結果表明,經過響應回歸方程擬合出的理論值與實際值偏差小,證明用響應面法對優化黑果枸杞原花青素的提取工藝有指導意義。

3 結論

采用單因素-響應面法建立了原花青素得率的二次多項擬合方程及三維響應面圖,由該模型優化的原花青素提取條件為:乙醇體積分數為56%,提取溫度為46 ℃,提取時間為48 min,在此條件下黑果枸杞原花青素得率可達4.315%,RSD為1.5%,高于前期提取工藝優化后2.990%的得率[12]。優化后的工藝安全、操作簡單,為黑果枸杞中原花青素的提取工業化提供了重要的參考依據。

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Optimization of extraction of proanthocyanidins fromLyciumruthenicumMurr. by response surface analysis

ZHAO Wen-juan1,SONG Yang2,LI Wen-jing3,YANG Hong-jiang1,*

(1.Key Lab of Industrial Fermenting Microbiology,Ministry of Education, Tianjin University of Science and Technology,Tianjin 300457,China; 2.College of Biotechnology,Qilu University of Technology,Jinan 250353,China; 3.Research & Design Institute of Food and Fermentation Industry of Shandong Province,Jinan 250013,China)

In order to improve the yield,based on the single factor experiments,the response surface methodology was employed to optimize the extraction conditions of proanthocynidins fromLyciumruthenicumMurr.. The process of quadric polynomial mathematics model was established by investigating the effect of ethanol concentration,extraction temperature,extraction time and their interaction on proanthocyanidins. Experiments showed that regression equation fit well with experimental data and the effect of investigated parameters were extremely significant. The optimal of extraction conditions including ethanol concentration,extraction temperature,extraction time were 56%,46 ℃ and 48 min respectively. The content of proanthocyanidins extracted fromLyciumruthenicumMurr. under the conditions was 4.315%. Compared with the predicted value of response surface,the error was 1.5%,which indicates that it is suitable for proanthocyanidins extracts fromLyciumruthenicumMurr.

LyciumruthenicumMurr.;proanthocyanidins;extraction;response surface

2016-12-08

趙文娟(1982-)，女，在讀博士研究生，高級工程師，研究方向：發酵工程,E-mail:15550033656@163.com。

*通訊作者:楊洪江(1966-)，男，博士，教授，研究方向：微生物學,E-mail:hongjiangyang@tust.edu.cn。

山東省優秀中青年科學家科研獎勵基金(2014BSB01118)。

TS255.1

B

1002-0306(2017)09-0252-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.039