響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑豆中皂苷的提取工藝及其抗氧化性研究

李 霄,薛成虎,弓 瑩,高立國,李改琴,王二榮

(榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院 榆林市農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室,陜西榆林 719000)

響應(yīng)面分析法優(yōu)化黑豆中皂苷的提取工藝及其抗氧化性研究

李 霄,薛成虎,弓 瑩,高立國,李改琴,王二榮

(榆林學(xué)院化學(xué)與化工學(xué)院 榆林市農(nóng)產(chǎn)品深加工重點實驗室,陜西榆林 719000)

以黑豆為原料,對黑豆皂苷的提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化。通過單因素實驗,分別考察了提取劑、溶劑濃度、料液比、提取溫度、提取時間、原料顆粒度、pH等因素對皂苷得率的影響。并在單因素的基礎(chǔ)上,采用Box-Behnken響應(yīng)面法對黑豆皂苷提取工藝進(jìn)行優(yōu)化,建立了二次多項式回歸方程的預(yù)測模型。研究結(jié)果表明,黑豆皂苷的最佳提取工藝是80% 乙醇、提取溫度80 ℃、料液比1∶45 (g/mL)、提取時間150 min、原料粒徑40 目、pH9,皂苷得率為0.72%?？寡趸钚匝芯勘砻骱诙乖碥諏PPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子自由基均有良好的清除能力,IC50值分別為0.0506,0.148,0.172 mg/mL。由響應(yīng)面法優(yōu)化得到的黑豆皂苷的提取工藝方便可行,得到的黑豆皂苷具有較強的抗氧化活性,值得進(jìn)一步開發(fā)利用。

黑豆,皂苷,提取工藝,響應(yīng)面法,抗氧化性

黑豆為豆科植物大豆(Glycinemax(L.)merr)的黑色種子。黑豆?fàn)I養(yǎng)豐富,富含粗蛋白、不飽和脂肪酸和人體必需氨基酸,還含有對人體健康有益的多種生理活性物質(zhì),如低聚糖、皂苷、異黃酮等[1-3]。植物皂苷是一種天然生物活性物質(zhì),由糖和皂苷元構(gòu)成,既有藥療又有食用功效,并且具有良好的抗氧化活性,能抑制細(xì)胞膜上的脂質(zhì)過氧化反應(yīng)、保護(hù)機(jī)體生物大分子[4-5],還可以有效清除生物體內(nèi)自由基。據(jù)報道,大豆皂苷具有抗病毒、抗氧化[6-8]、抗腫瘤[9-11]、溶血[12-13]、降血脂[14-15]和免疫調(diào)節(jié)作用[16],還可以作為穩(wěn)定劑、乳化劑和風(fēng)味改良劑、發(fā)泡劑和表面活性劑等,廣泛用作食品、藥品以及化妝品的添加劑。另外還有報道稱大豆皂苷可防止動脈粥樣硬化,延緩細(xì)胞衰老,延長生命等作用。

目前對黑豆的研究主要集中于對黑豆多酚[17]、黃酮[18]、異黃酮[19-20]、黑豆色素[21]等成分的提取工藝和抗氧化性的研究,以及黑豆的發(fā)酵工藝的研究[22-23],對于黑豆皂苷的提取工藝以及其抗氧化活性報道極少。本實驗采用響應(yīng)面法優(yōu)化黑豆皂苷的最佳提取工藝,并在多種體系中研究皂苷的體外抗氧化活性,旨在為黑豆皂苷的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑豆 榆林市市售;齊墩果酸標(biāo)樣:純度98% 西安匯林生物科技有限公司;鄰二氮菲、鄰苯三酚、硫酸亞鐵銨、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、三羥甲基氨基甲烷、DPPH(二苯基苦基苯肼)、硫代硫酸鈉、雙氧水、碘化鉀、可溶性淀粉、抗壞血酸(VC)、焦性沒食子酸、冰乙酸、鹽酸(36%～38%)、無水乙醇、甲醇、丙酮、石油醚、乙腈、乙酸乙酯等均為分析純 購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司和國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JH722S可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司;KQ2200DV型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;202-O臺式電熱干燥箱 中國天津泰斯特儀器有限公司;SZCL-2數(shù)顯智能控溫磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限公司;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市科瑞儀器有限公司;HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海亞榮生化儀器廠;WK-200B小型高速粉碎機(jī) 濰坊市北方制藥設(shè)備制造有限公司;ESG60-4型電子天平 沈陽龍騰電子有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 皂苷標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 先準(zhǔn)確稱取齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)品10 mg,然后把它倒入100 mL容量瓶中,用95%的乙醇溶解并定容到刻度線,配制成0.1 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液,分別準(zhǔn)確量取0、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL于1～6號的6個10 mL的具塞試管中,在70 ℃恒溫水浴鍋上面蒸干,然后在試管中加入剛配好的0.2 mL的5%的香草醛-冰醋酸溶液,0.8 mL高氯酸,在60 ℃的恒溫水浴鍋上加熱顯色15 min,然后放到冰水中冷卻,最后加5 mL冰醋酸,充分搖勻,以空白試劑為對照,在最佳的波長下測定2～6號顯色溶液的吸光度A,然后以溶液濃度為橫坐標(biāo),顯色溶液的吸光度A為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 皂苷的提取及含量測定 準(zhǔn)確量取0.1 mL皂苷提取液于10 mL具塞試管中,在70 ℃恒溫水浴鍋上面蒸干,然后在試管中加入剛配好的0.2 mL的5%的香草醛-冰醋酸溶液,0.8 mL高氯酸,在60 ℃的恒溫水浴鍋上加熱顯色15 min,然后放到冰水中冷卻,最后加5 mL冰醋酸,充分搖勻,以空白試劑為對照,在最佳波長下測定吸光度,根據(jù)回歸方程計算樣品溶液中皂苷的含量,根據(jù)如下公式計算黑豆中皂苷得率[24-25]。

黑豆中皂苷得率(%)=CV/W÷1000×100

其中,C為樣品溶液中總皂苷含量(mg/mL),V為樣品溶液的總體積(mL),W為黑豆質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實驗

1.2.3.1 提取劑對皂苷得率的影響 分別稱取5.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于7個200 mL的兩口燒瓶中,料液比1∶20 g/mL,分別采用蒸餾水、99.5%丙酮、99.5%乙酸乙酯、99.7%無水乙醇、99.5%甲醇、99.9%乙腈、99.9%石油醚,溫度為80 ℃,pH7,回流60 min,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.2 乙醇濃度對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于6個200 mL的兩口燒瓶中,料液比1∶40 g/mL,分別采用乙醇濃度分別為50%、60%、70%、80%、90%、99.5%，溫度80 ℃,pH7,回流60 min的條件下,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.3 料液比對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于6個200 mL的兩口燒瓶中,料液比分別為1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60 g/mL,溫度80 ℃,80%乙醇，pH7,回流60 min的條件下,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.4 提取溫度對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于6個200 mL的兩口燒瓶中,料液比為1∶40 g/mL,溫度分別在40、50、60、70、80、90 ℃,80%乙醇，pH7,回流60 min的條件下,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.5 原料粒徑對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑分別為20、40、60、80、100 目的黑豆粉,置于5個200 mL的兩口燒瓶中,料液比為1∶40 g/mL,溫度分別為80 ℃,80%乙醇，pH7,回流60 min的條件下,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.6 提取時間對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于6個200 mL的兩口燒瓶中,料液比為1∶40 g/mL,溫度為80 ℃,80%乙醇，pH7,分別回流60、90、120、150、180、210 min,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.3.7 提取劑pH對皂苷得率的影響 分別稱取2.0 g粒徑為40 目的黑豆粉,置于6個200 mL的兩口燒瓶中,料液比為1∶40 g/mL,回流150 min,溫度為80 ℃的條件下,80%的乙醇溶液的pH分別為1、3、5、7、9、11,對黑豆中皂苷進(jìn)行提取,按照1.2.2方法測定皂苷得率。

1.2.4 響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝 應(yīng)用Box-Behnken中心組合設(shè)計原理,優(yōu)化黑豆皂苷提取工藝[26],在單因素實驗結(jié)果的基礎(chǔ)上,采用40 目的黑豆為原料,提取劑pH9,提取時間為150 min,以黑豆總皂苷得率為響應(yīng)值Y,以乙醇濃度(X1)、料液比(X2)、提取溫度(X3)作為自變量,設(shè)計中心組合實驗。實驗因素和水平見表1。

表1 響應(yīng)面實驗因素水平表

1.2.5 黑豆皂苷的抗氧化能力測定

1.2.5.1 羥自由基的生成及清除率的測定 取8支50 mL具塞試管,依次加入1.0 mL 7.5 mmol/L的鄰二氮菲,2.0 mL的PBS緩沖溶液(pH為7.4,下同)和1.0 mL 7.5 mmol/L的FeSO4,邊加邊搖勻后,加入1.0 mL 0.1% H2O2,再用蒸餾水定容至50 mL刻度線,置37 ℃恒溫水浴鍋反應(yīng)60 min,在510 nm處測其吸光度A3,按上述操作步驟,用蒸餾水代替1.0 mL 0.1% H2O2,定容至50 mL刻度線,置37 ℃水浴鍋反應(yīng)60 min,在510 nm處測其吸光度A2,在測損傷組的基礎(chǔ)上再加不同體積的皂苷提取液,按上述步驟一樣,PBS緩沖溶液作為參比,在510 nm處測其吸光度A1;以VC作對照[27]。

清除率(%)=(A1-A3)/(A2-A3)×100

式中:A1-樣品組吸光值;A2-未損傷組吸光值;A3-損傷組吸光值。

1.2.5.2 超氧陰離子的生成及清除率測定 吸取4.4 mL 0.05 mol/L pH為8.2的Tris-HCl緩沖溶液,置于25 ℃恒溫水浴中預(yù)熱20 min,分別加入0.1 mL不同濃度的樣品溶液,再加入已在25 ℃恒溫水浴中預(yù)熱的2.5 mmol/L的鄰苯三酚5.5 mL開始反應(yīng),混勻后繼續(xù)置于25 ℃水浴反應(yīng)4 min后,加入濃度為10.0 mol/L的HCl溶液2滴終止反應(yīng),用蒸餾水作參比,于325 nm處測定吸光值,再以相同濃度的VC作對照實驗[28]。超氧陰離子清除率按如下公式計算:

清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]×100

其中:A0-不含樣品溶液的吸光值；A1-含有樣品溶液的吸光值；A2-含樣品溶液但不含鄰苯三酚的吸光值。

1.2.5.3 DPPH·的生成及清除率測定 準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液3.0 mL,分別與2.0 mL 2.00×10-4mol/L DPPH·溶液混合,搖勻后避光放置30 min。以相對應(yīng)的溶劑(2.0 mL蒸餾水與2.0 mL無水乙醇的混合溶液)為對照,用分光光度計分別測定上述溶液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)i,以相同濃度的VC溶液做對照。準(zhǔn)確吸取不同濃度的樣品溶液3.0 mL,分別與2.0 mL蒸餾水混合均勻后,以蒸餾水為對照,用分光光度計分別測定各混合液在波長517 nm處的吸光度值A(chǔ)j,以相同濃度的VC溶液做對照。準(zhǔn)確吸取2.00×10-4mol/L DPPH溶液2.0 mL,與水混合均勻后,以相對應(yīng)的溶劑(2.0 mL蒸餾水與2.0 mL無水乙醇的混合溶液)為對照,用分光光度計測定上述溶液在517 nm處的吸光度值A(chǔ)0

將以上數(shù)據(jù)代入下列公式計算其清除率[29]。

清除率(%)=[(A0-Ai+Aj)/A0]×100

其中:Ai為皂苷樣品溶液和VC溶液與等體積DPPH·溶液混合后在波長517 nm處的吸光度值;Aj為皂苷樣品溶液和VC溶液與等體積溶劑混合后在波長517 nm處的吸光度值;A0為DPPH溶液與等體積溶劑混合后在波長517 nm處的吸光度值。

清除率為50%時,所需抗氧化劑的濃度即為半數(shù)抑制率IC50值(mg/mL)。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示,回歸方程為:y=14.114x-0.0679,相關(guān)系數(shù)R2為0.9992。黑豆中皂苷溶液在0.0067～0.02 mg/mL濃度范圍內(nèi),呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系,可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線計算黑豆皂苷的含量。

圖1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Oleanolic acid standard curve

2.2 各因素對黑豆皂苷得率的影響

2.2.1 提取劑對皂苷得率的影響 以皂苷得率比較不同提取劑的效果如圖2所示。實驗結(jié)果表明:提取劑類型對總皂苷得率影響比較大,其中無水乙醇的提取效果最好。因此,以下實驗均采用無水乙醇作為提取劑。

圖2 提取劑的選擇Fig.2 Selection of extracting solvents

2.2.2 乙醇濃度對皂苷得率影響 如圖3所示,結(jié)果表明:總皂苷得率隨乙醇濃度的升高而升高,乙醇濃度達(dá)80%時皂苷得率達(dá)最大值。乙醇濃度進(jìn)一步增大,皂苷含量反而下降,這可能是由于高濃度的乙醇會增加其中蛋白質(zhì)和糖類等雜質(zhì)的溶出,與皂苷類化合物競爭乙醇,從而導(dǎo)致皂苷類化合物的得率下降,因此,本實驗選80%的乙醇作為提取皂苷的最佳提取濃度,并選定乙醇濃度在70%、80%、90%作為響應(yīng)面實驗的水平。

圖3 乙醇濃度對皂苷得率的影響Fig.3 Effect of ethanol concentration on extraction rate of saponins

2.2.3 料液比對皂苷得率的影響 如圖4所示,結(jié)果表明:隨著溶劑比例的增加,黑豆中皂苷的得率逐漸增大,當(dāng)料液比達(dá)到1∶40 g/mL時,皂苷得率達(dá)最高,進(jìn)一步增加溶劑比例,皂苷得率反而下降?？赡苁怯捎谌軇┝康脑黾邮刮锪吓c溶劑接觸面積、溶劑傳質(zhì)推動力均增大,有利于總皂苷的溶出,從而皂苷溶出速度和得率變大,當(dāng)料液比一定時,得率達(dá)最高,溶劑比例繼續(xù)增加,溶劑體積增加使得物料吸附溶劑的量也逐漸變大,從而導(dǎo)致總皂苷被物料吸附而不易溶出。故選取1∶40 g/mL作為提取黑豆皂苷的最佳料液比。并選定料液比1∶30、1∶40、1∶50 g/mL作為響應(yīng)面實驗的水平。

圖4 料液比對皂苷得率的影響Fig.4 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of saponins

2.2.4 提取溫度對皂苷得率的影響 比較提取溫度對皂苷得率的影響如圖5所示,結(jié)果表明:黑豆中皂苷的得率隨著提取溫度的升高而增大,當(dāng)溫度達(dá)到80 ℃時,皂苷得率達(dá)到最大值,提取溫度進(jìn)一步升高,皂苷得率反而下降,因為過高的溫度破壞黑豆中活性成分,并且雜質(zhì)溶出量增大,所以黑豆皂苷得率下降。選擇提取溫度為80 ℃,并選定溫度70、80、90 ℃為響應(yīng)面實驗水平。

圖5 提取溫度對皂苷得率的影響Fig.5 Effect of temperature on extraction rate of saponins

2.2.5 黑豆粒徑對皂苷得率的影響 如圖6所示,實驗結(jié)果表明:原料粒徑大小對皂苷得率影響明顯,隨著粒徑的減小,皂苷得率先增大后減小,在40目時達(dá)到最高,這是因為隨著粒徑逐漸減小,雜質(zhì)逐漸被分出,原料可以與溶劑充分混合,使得率明顯增加,但是,粒徑進(jìn)一步減小,提取液粘度增加,不利于黑豆皂苷的溶出,且部分黑豆顆粒也被阻隔,造成極大的浪費,綜合考慮,原料粒徑為40目是皂苷提取的最佳粒徑。

圖6 粒徑目數(shù)對皂苷得率的影響Fig.6 Effect of sieve mesh on extraction rate of saponins

2.2.6 提取時間對皂苷得率的影響 如圖7所示,實驗結(jié)果表明:隨著提取時間的延長,黑豆中皂苷的得率逐漸增大,在150 min時皂苷得率最高,但150 min以后,皂苷得率有所下降?？赡苁且驗殡S著浸提時間的增長,脂溶性物質(zhì)增加,溶液變粘稠,阻止黑豆皂苷的溶出,從而導(dǎo)致皂苷得率的下降。因此,皂苷提取的最佳提取時間為150 min。

圖7 提取時間對皂苷得率的影響Fig.7 Effect of time on extraction rate of saponins

圖8 pH對皂苷得率的影響Fig.8 Effect of pH on extraction rate of saponins

2.2.7 提取劑pH對皂苷得率的影響 以皂苷得率比較不同酸堿度的提取劑對皂苷得率的影響,如圖8所示,實驗結(jié)果表明:提取劑在酸性條件下,皂苷得率明顯低于提取劑在堿性條件下的得率,且在堿性范圍內(nèi),隨著pH的增大,皂苷得率逐漸增大,在pH9時達(dá)到最大,進(jìn)一步增大pH,皂苷得率反而下降。可能的原因是在酸性條件下皂苷的結(jié)構(gòu)容易被破壞,而在弱堿性條件下皂苷穩(wěn)定。因此提取劑最佳的pH為9。

表3 回歸模型的方差分析

注：p<0.0100表示該指標(biāo)極顯著;p<0.0500表示該指標(biāo)顯著;p>0.0500表示該指標(biāo)不顯著。

2.3 響應(yīng)面法分析

2.3.1 實驗設(shè)計與結(jié)果 在單因素實驗的基礎(chǔ)上,確定以顆粒度為40目的黑豆為原料,溶劑pH為9,提取時間為150 min,以乙醇濃度、料液比、提取溫度為考察因素,以黑豆皂苷得率為實驗指標(biāo),根據(jù)Box-Behnken組合實驗設(shè)計原理,設(shè)計3因素3水平響應(yīng)面實驗,結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken組合實驗設(shè)計及結(jié)果

2.3.2 方差分析及二次回歸模型的擬合 應(yīng)用Design Expert軟件對表2中實驗結(jié)果進(jìn)行分析,方差分析結(jié)果如表3所示。各因素對黑豆皂苷得率的影響并非簡單的線性關(guān)系,采用軟件對黑豆皂苷得率進(jìn)行二次多項回歸模型擬合,回歸方程為:

Y(%)=0.71-0.019X1+0.046X2+0.022X3+0.012X1X2+0.015X1X3-(5.000E-003)X2X3-0.30X12-0.048X22-0.13X32。

方程的顯著性分析得F=141.28,相應(yīng)的概率值p<0.01,表明該方程模型極顯著,不同處理間的差異高度顯著。失擬項p為0.5110,不顯著,表明非實驗因素對實驗結(jié)果影響不大,說明該模型適合黑豆皂苷提取條件的篩選。

在一次項中,料液比X2對提取物得率影響達(dá)到極顯著水平(p<0.01),在二次項中,乙醇濃度X12,料液比X22,溫度X32均達(dá)到了極顯著水平(p<0.01)。這表明,三個因素與黑豆皂苷得率有直接的關(guān)系,是主要的限制因素,其較小變化都會引起得率顯著的變化。由p值的大小比較可得提取的影響因素的順序為:料液比>溫度>乙醇濃度。

2.3.3 提取工藝的響應(yīng)面分析與優(yōu)化 響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值皂苷得率對應(yīng)于實驗因素乙醇濃度、料液比、溫度所構(gòu)成的三維空間曲面圖,可以直觀反映各個實驗因素之間的交互作用對黑豆皂苷得率的影響。圖9顯示,皂苷得率與乙醇濃度和溫度的等高線呈圓形,二者沒有明顯的交互作用,溫度較低時,得率隨乙醇濃度的增大而增大,隨著溫度的升高,增加幅度減小甚至下降。表明不同的溫度下,乙醇濃度對得率的影響不同;由圖10可以看出,乙醇濃度和料液比沒有明顯的交互作用,得率隨乙醇濃度增大先增加后減小;圖11顯示,料液比和溫度沒有明顯的交互作用,較低溫度下,隨著液料比的增大,黑豆皂苷得率增加,較高溫度,得率隨液料比增大而減小。

圖9 乙醇濃度和溫度對皂苷得率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.9 Response surface diagram for extraction yield of saponin as a synergetic function of ethanol concentration and temperature

圖10 乙醇濃度和料液比對皂苷得率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.10 Response surface diagram for extraction yield of saponin as a synergetic function of ethanol concentration and solid-liquid ratio

圖11 料液比和溫度對皂苷得率交互影響的響應(yīng)面圖Fig.11 Response surface diagram for extraction yield of saponin as a synergetic function of solid-liquid ratio and temperature

2.3.4 最佳工藝條件的確定及驗證實驗 利用Design Expert軟件對實驗?zāi)Ｐ瓦M(jìn)行典型性分析,得到黑豆中皂苷的最優(yōu)提取條件:以顆粒度為40 目的黑豆粉為原料,溶劑pH為9,提取150 min,乙醇濃度為79.81%,提取溫度為80.77 ℃,料液比為1∶44.72 g/mL,黑豆皂苷得率預(yù)測值為0.74%。為了驗證響應(yīng)面法的可行性,采用獲得的最佳提取工藝條件,考慮到實際操作的便利,按照乙醇濃度為80%,提取溫度為80 ℃,料液比為1∶45 g/mL,進(jìn)行黑豆皂苷的提取實驗,重復(fù)三次,求平均得率為0.72%。結(jié)果表明,黑豆皂苷在優(yōu)化后的得率與最大得率的預(yù)測值很接近,實際值與預(yù)測值有很好的擬合性。充分驗證了所建模型的有效性,說明回歸方程可以反映各因素對皂苷得率的影響。

2.4 黑豆皂苷的抗氧化活性研究

2.4.1 黑豆中皂苷對DPPH·的清除作用 由圖12可以看出,黑豆中皂苷對DPPH·清除率隨著皂苷濃度的增加而增強,當(dāng)皂苷濃度為0.057 mg/mL時清除率為70.46%;而隨著VC濃度的增加,VC清除率逐漸增加,當(dāng)VC濃度為0.057 mg/mL時,清除率為73.39%。結(jié)果表明,黑豆中皂苷對DPPH·清除率與VC相比略低,但皂苷濃度越高,清除率越好。黑豆皂苷的IC50值為0.0506 mg/mL。

圖12 皂苷對DPPH·的清除作用Fig.12 Scavenging effect of saponins on DPPH radicals

2.4.2 黑豆中皂苷對羥自由基的清除作用 由圖13可知,隨著黑豆中皂苷濃度的增加,對羥基自由基的清除率增加,當(dāng)皂苷濃度為0.16 mg/mL時對羥基自由基的清除率為51.38%,相同濃度的VC,對羥基自由基的清除率為55.56%。說明皂苷濃度在0～0.16 mg/mL范圍內(nèi),對羥基自由基的清除能力與VC相比略低,但濃度越大越接近,黑豆皂苷的IC50值為0.148 mg/mL。

圖13 皂苷對羥基自由基的清除作用Fig.13 Scavenging effect of saponins on hydroxyl radicals

圖14 皂苷對超氧陰離子的清除作用Fig.14 Scavenging effect of saponins on superoxide anion radicals

3 結(jié)論

根據(jù)Box-Behnken組合實驗設(shè)計原理和響應(yīng)面法可知,各因素對黑豆皂苷得率的影響并不是簡單的線性關(guān)系,而是一個多元二次的復(fù)雜關(guān)系,黑豆皂苷的最佳提取條件組合為:以顆粒度為40目的黑豆粉為原料,80%的乙醇為提取劑,溶劑pH為9,料液比為1∶45 g/mL,提取溫度為80 ℃,提取150 min,在此條件下黑豆皂苷的得率為0.72%,這種優(yōu)化的提取方法可以為黑豆皂苷的工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的技術(shù)指導(dǎo)。

黑豆皂苷清除DPPH自由基、羥基自由基和超氧陰離子的IC50分別是0.0506,0.148,0.172 mg/mL,清除效果表明,黑豆皂苷具有良好的清除自由基的能力,且抗氧化能力與皂苷質(zhì)量濃度有關(guān)。本研究為黑豆皂苷的開發(fā)提供一定的參考依據(jù)。

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Optimization of extraction technology by response surface methodology and inoxidizability of saponins from black bean

LI Xiao,XUE Cheng-hu,GONG Ying,GAO Li-guo,LI Gai-qin,WANG Er-rong

(Yulin Civic Key Laboratory of Further Processing of Agricultural Products,School of Chemistry and Chemical Engineering,Yulin University,Yulin 719000,China)

In this paper,black beans as raw material,the response surface methodology(RSM)was used to optimize the extraction process of saponins from black bean. Based on one-factor-at-a-time experiments,extract yield of the saponins was used as response for establishing a quadratic regression model. The effects of solvent and solvent concentration,solid-liquid ratio,extraction temperature and time,particle size,pH on the yield of saponins from black beans were investigated. The study results showed that the optimum conditions for extraction of saponin from black bean as follows:extraction solvent 80% ethanol,extraction temperature 80 ℃,solid-liquid ratio 1∶45(g/mL),extract for 150 min,particle size 40 mesh of raw materials,pH9,the yield of saponins from black beans was 0.72%. The antioxidant activity study showed that abilities of saponins in black beans to scavenge DPPH and hydroxyl radical and superoxide anion were good and the half-scavenging concentration(IC50)were 0.0506,0.148,0.172 mg/mL respectively. Optimization of the extraction process by RSM of saponins of black bean is convenient and feasible. Saponins of black bean has good antioxidant activity and is worth to develop for application.

black beans;saponins;extraction technology;response surface;oxidation resistance

2016-10-28

李霄(1983-)，女，碩士，實驗師，主要從事天然產(chǎn)物的提取與分析，E-mail：lixiaoylxy2010@163.com。

榆林市科技局計劃項目(2014 cxy-01)。

TS201.2

B

1002-0306(2017)09-0235-07

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.036