鐵皮石斛多糖液態(tài)發(fā)酵工藝及其抗氧化活性研究

薛 燕,李 麗,劉光榮,王笑月,王巧娥,董銀卯，*

(1.北京市植物資源重點實驗室,北京工商大學(xué),北京 100048; 2.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510623)

鐵皮石斛多糖液態(tài)發(fā)酵工藝及其抗氧化活性研究

薛 燕1,李 麗1,劉光榮2,王笑月1,王巧娥1,董銀卯1，*

(1.北京市植物資源重點實驗室,北京工商大學(xué),北京 100048; 2.無限極(中國)有限公司,廣東廣州 510623)

探討液態(tài)發(fā)酵鐵皮石斛多糖的最佳工藝及其抗氧化活性。采用單因素及正交實驗研究了發(fā)酵溫度、轉(zhuǎn)速、pH和發(fā)酵時間對發(fā)酵工藝的影響,得到了液態(tài)發(fā)酵的最優(yōu)條件:發(fā)酵溫度28 ℃,pH4.5,轉(zhuǎn)速170 r/min,發(fā)酵時間54 h;發(fā)酵后鐵皮石斛水提多糖的總抗氧化能力、清除DPPH及ABTS自由基能力均有所提高,而且均具有很強的量效關(guān)系;發(fā)酵后石斛多糖的平均分子量由4.234×105降為1.077×105,推測發(fā)酵多糖抗氧化能力的提高可能與微生物發(fā)酵過程導(dǎo)致石斛多糖分子量的減小有關(guān)。

鐵皮石斛,水提法,液態(tài)發(fā)酵法,多糖,抗氧化活性

鐵皮石斛(DendrobiumofficinaleKimuraetMigo)是蘭科石斛屬多年生附生草本植物的干燥莖[1],為我國傳統(tǒng)的名貴中藥材,是石斛中的極品,民間稱作“救命仙草”,國際藥用植物界稱其為“藥界大熊貓”。鐵皮石斛具有益胃生津、滋陰清熱、免疫調(diào)節(jié)、延緩衰老等功效,用于治療陰傷津虧,口干煩渴,食少干嘔,病后虛熱,目暗不明等[2]。鐵皮石斛中主要含有多糖、生物堿、芳香族化合物以及小分子物質(zhì)等,其中多糖是其主要的功效物質(zhì)。現(xiàn)有研究表明,鐵皮石斛多糖具有調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤、調(diào)節(jié)血糖、抗氧化及抑菌等功效[3-7],在醫(yī)療方面應(yīng)用較為廣泛。對于鐵皮石斛中多糖成分的提取方法,文獻報道較多的有水提法、超聲法和酶解法等。鐵皮石斛作為我國名貴中藥材,如何更高效的利用鐵皮石斛是目前研究中應(yīng)該解決的問題。在中藥發(fā)酵過程中,由于微生物的生長代謝和生命活動具有強大分解轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力,并能產(chǎn)生多種次生代謝產(chǎn)物,可以比一般的物理或化學(xué)手段更大幅度地改變藥性,產(chǎn)生新的化學(xué)成分或活性更強的先導(dǎo)化合物[8-9],達到提高藥效、改變藥性、降低毒副作用等目的[10],因此,本研究旨在探討液態(tài)發(fā)酵法制備鐵皮石斛多糖的最佳工藝,并對比發(fā)酵前后多糖抗氧化活性及分子量變化,以提高鐵皮石斛多糖的抗氧化活性,并初步探討多糖抗氧化活性差異的原因,為鐵皮石斛的進一步開發(fā)利用提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鐵皮石斛 采購于云南普洱,粉碎成粉末,30目過篩;釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) 編號:2.3880,分離源:殼斗科植物樹皮,109CFU/mL，購于中國普通微生物菌種保藏中心；葡萄糖(生物試劑)、蛋白胨(生物試劑)、酵母膏(生物試劑)、抗壞血酸 北京百靈威試劑公司；DPPH(1,1-二苯基-2-三硝基苯肼)及ABTS[2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽] sigma試劑公司;TPTz(2,4,6-三吡啶基三嗪) 阿達瑪斯試劑公司;過二硫酸鉀、三水合醋酸鈉、醋酸、六水合氯化鐵、亞硫酸鐵、鹽酸苯酚、濃硫酸、無水乙醇 均為分析純。

空氣恒溫?fù)u床 上海福瑪實驗設(shè)備有限公司;TECAN酶標(biāo)儀 奧地利TACAN有限公司;磁力攪拌電熱套 天津市泰斯特儀器有限公司;雷磁PHS-3C型pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;潔凈工作臺 北京世安科林凈化技術(shù)有限公司;立式壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業(yè)有限公司;真空冷凍干燥機 美國Virtis公司;凝膠色譜儀e2695 美國Waters公司;十八角度激光光散射儀 美國Wyatt技術(shù)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖含量測定方法 采用苯酚硫酸法[11]測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到方程y=11.138x-0.0068,相關(guān)系數(shù)R2=0.9981,式中y為吸光度,x為葡萄糖的質(zhì)量濃度(mg/mL),線性范圍是0.01～0.1 mg/mL。

鐵皮石斛多糖得率計算公式:

石斛多糖得率(%)=(多糖質(zhì)量/鐵皮石斛干質(zhì)量)×100。

1.2.2 發(fā)酵原液制備 石斛發(fā)酵液的制備:通過前期研究,已得到水提法最優(yōu)工藝,故利用最優(yōu)水提工藝(料液比1∶100 g/mL,提取溫度100 ℃,提取時間3 h)制備石斛提取液[11-14],并加入酵母生長所需培養(yǎng)基(每100 mL石斛提取液中加入1 g葡萄糖,1 g蛋白胨,0.5 g酵母膏),用于后續(xù)發(fā)酵工藝研究。

1.2.3 單因素實驗選擇石斛多糖最佳發(fā)酵工藝 準(zhǔn)備適量石斛發(fā)酵原液,滅菌后加入2%的釀酒酵母種子液,以發(fā)酵pH5.0,轉(zhuǎn)速120 r/min,發(fā)酵溫度30 ℃,發(fā)酵時間20 h為發(fā)酵一次的條件。當(dāng)變動一因素時,其他因素與上述提取一次的條件一致。變動的因素:發(fā)酵pH為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,轉(zhuǎn)速為100、120、140、160、180 r/min,發(fā)酵溫度為25.0、27.5、30.0、32.5、35.0 ℃,發(fā)酵時間為每2 h測一次,并在600 nm下測定其吸光值[15-17]。

1.2.4 正交實驗選擇石斛多糖最佳發(fā)酵工藝 單因素實驗表明影響菌生長的主要因素有pH、轉(zhuǎn)速、溫度和時間,選擇pH、轉(zhuǎn)速、溫度和時間四個因素為考察因素,每個因素各取3個較優(yōu)水平做四因素三水平正交實驗設(shè)計(見表1)。

表1 正交實驗因素水平表

1.2.5 石斛多糖發(fā)酵液清除DPPH自由基能力測定 DPPH在乙醇溶液中呈紫色,且在517 nm處有最大吸收值。加入抗氧化劑后,DPPH與抗氧化劑中的氫結(jié)合,顏色發(fā)生改變,吸光度值也隨之發(fā)生變化,從而用來評價其清除自由基能力的強弱[18-19]。本實驗在試管中加入不同質(zhì)量濃度的鐵皮石斛多糖水溶液及等體積的0.2 mmol/L DPPH乙醇溶液,混勻后于暗處靜置30 min,以無水乙醇為參比,在波長517 nm處測定其吸光度值。平行測定3次,取平均值。

清除率(%)=[(B+A-C)/B]×100

式中,A-1 mL乙醇溶液加1 mL樣品溶液的吸光度;B-1 mL乙醇溶液加1 mL DPPH溶液的吸光度;C-1 mL樣品溶液加1 mL DPPH溶液的吸光度。

1.2.6 石斛多糖發(fā)酵液清除ABTS自由基能力測定 ABTS,化學(xué)命名為2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽,在適當(dāng)?shù)难趸瘎┳饔孟聲伤{(lán)綠色水溶性的ABTS·,其在734 nm處有吸收峰。當(dāng)有抗氧化劑存在時,ABTS·的產(chǎn)生受到抑制,溶液顏色變淺,吸光值降低,因此可采用吸光光度法評價樣品清除ABTS自由基的能力[20]。本實驗在試管中加入0.2 mL不同濃度的待測液和0.8 mL ABTS·工作液,充分混勻后,在室溫條件下避光反應(yīng)30 min,用酶標(biāo)儀測定其在734 nm下的吸光值A(chǔ),以水為參比。平行測定3次,取平均值。

清除率(%)=[(A0-A)/A0]×100

式中,A-0.2 mL樣品加0.8 mL ABTS·工作液的吸光度;A0-0.2 mL水加0.8 mL ABTS·工作液的吸光度。

1.2.7 石斛多糖發(fā)酵液總抗氧化能力測定 TPTz中的Fe3+可被樣品中還原物質(zhì)還原為Fe2+,呈現(xiàn)出明顯的藍(lán)色,并于593 nm處具有最大吸收峰,由吸光度大小可計算樣品抗氧化活性的強弱[21-22]。本實驗在試管中分別加入不同濃度的樣品溶液30 μL,加入900 μL的FRAP工作液,再加入90 μL蒸餾水混合均勻,對照中樣品替代成水即可,37 ℃避光反應(yīng)30 min,在593 nm下測定其吸光值,樣品總抗氧化能力用亞硫酸鐵溶液濃度來表示。平行測定3次,取平均值。

1.2.8 多糖平均分子量的測定 采用凝膠滲透色譜——十八角度激光散射聯(lián)用系統(tǒng)(GPC-MALS系統(tǒng))檢測其分子量。將水提多糖與微生物發(fā)酵多糖配制成3 mg/mL的溶液后經(jīng)0.22 μm的水系過濾頭,經(jīng)GPC-MALS法測定。實驗具體條件如下:

輸液系統(tǒng):Waters e 2695系統(tǒng)；

凝膠色譜柱:Shodex SUGER KS-805/KS-803聯(lián)用;

檢測器:十八角度激光光散射儀與示差檢測器聯(lián)用;

進樣體積:0.1 mL;

流速:0.8 mL/min;

柱溫:60 ℃;

示差折光檢測器溫度:50 ℃;

流動相:0.1 mol/L硝酸鈉溶液與0.02%疊氮化鈉溶液的混合溶液(流動相經(jīng)0.22 μm水系過濾膜低真空度過濾)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單個因素對液態(tài)發(fā)酵工藝的影響

2.1.1 pH對發(fā)酵工藝的影響 pH的變化會影響釀酒酵母的生長情況,結(jié)果如圖1所示。

圖1 pH對酵母菌生長的影響Fig.1 Effect of pH on the growth of Saccharomyces cerevisiae

從圖1可以看出,隨著pH的增加,酵母菌的生長趨勢下降,這可能是因為酵母菌適宜在偏酸性環(huán)境生長的原因。pH為5.0時,酵母菌的生長情況最佳。

2.1.2 轉(zhuǎn)速對發(fā)酵工藝的影響 轉(zhuǎn)速的變化會影響釀酒酵母的生長情況,結(jié)果如圖2所示。

圖2 轉(zhuǎn)速對酵母菌生長的影響Fig.2 Effect of agitation speed on the growth of Saccharomyces cerevisiae

從圖2可以看出,隨著轉(zhuǎn)速的增加,菌的生長旺盛,當(dāng)轉(zhuǎn)速大于160 r/min時,菌的生長不明顯。這可能是因為搖床能夠加速發(fā)酵過程中產(chǎn)生的CO2的排出,并能夠使酵母懸浮在培養(yǎng)液中,在一定程度上增加菌液濃度。低轉(zhuǎn)速情況下釀酒酵母的生長和發(fā)酵情況較差可能由于CO2未能及時排除,脅迫釀酒酵母,影響到其生長和發(fā)酵。轉(zhuǎn)速為160 r/min時,酵母菌的生長情況最佳。

2.1.3 發(fā)酵溫度對發(fā)酵工藝的影響 發(fā)酵溫度的變化會影響釀酒酵母的生長情況,如圖3所示。

圖3 溫度對酵母菌生長的影響Fig.3 Effect of temperature on the growth of Saccharomyces cerevisiae

從圖3可以看出,當(dāng)溫度小于30 ℃時,酵母菌的OD值隨溫度升高而增加;當(dāng)溫度大于30 ℃時,酵母菌的OD值隨溫度升高反而緩慢降低。其原因可能是低溫度影響了酵母菌中酶的活性,糖的轉(zhuǎn)運速度下降,較高溫度下釀酒酵母對酒精的敏感性升高,可能是由于培養(yǎng)溫度升高導(dǎo)致發(fā)酵不完全造成。溫度為30 ℃時,酵母菌的生長情況最佳。

2.1.4 發(fā)酵時間對發(fā)酵工藝的影響 發(fā)酵時間的變化會影響釀酒酵母生長情況,結(jié)果如圖4所示。

圖4 時間對酵母菌生長的影響Fig.4 Effect of time on the growth of Saccharomyces cerevisiae

由圖4可知,4 h內(nèi),酵母菌處于生長遲緩期,菌種增長緩慢;酵母菌在4～58 h內(nèi)處于生長對數(shù)期,菌種生長較快;58 h之后逐漸趨于平緩,屬于穩(wěn)定期;所以發(fā)酵58 h為最佳培養(yǎng)時間。

2.2 最佳發(fā)酵工藝的優(yōu)化

液態(tài)發(fā)酵制備鐵皮石斛多糖的正交實驗結(jié)果見表2。

表2 正交實驗結(jié)果及分析

由表2中R值可知,這4個因素的主次順序為發(fā)酵溫度、時間、轉(zhuǎn)速、pH。最優(yōu)組合為A1B3C1D1,即溫度28 ℃,pH為4.5,轉(zhuǎn)速在170 r/min時酵母發(fā)酵54 h，對得到的工藝條件做驗證實驗，重復(fù)3次，此條件下測得釀酒酵母的OD值是1.539±0.03631。

2.3 發(fā)酵對石斛多糖抗氧化活性的影響

2.3.1 發(fā)酵前后石斛多糖清除DPPH自由基的能力 石斛多糖提取液發(fā)酵前后清除DPPH自由基的能力見圖5。

圖5 發(fā)酵前后石斛多糖清除DPPH自由基的能力Fig.5 The scavenging DPPH ability of DOP before and after fermentation

由圖5可以看出,鐵皮石斛多糖發(fā)酵前后清除率均隨著質(zhì)量濃度的增加而逐漸升高,而當(dāng)發(fā)酵前多糖濃度到達8 mg/mL時,發(fā)酵后多糖到達4 mg/mL時,清除率隨質(zhì)量濃度的增加趨于平緩。根據(jù)發(fā)酵前多糖清除率擬合曲線y=-0.0006x4+0.0127x3-0.0991x2+0.4076x-0.0771，R2=0.9868,計算得到發(fā)酵前多糖對DPPH自由基的IC50為2.226 mg/mL;根據(jù)發(fā)酵后多糖清除率擬合曲線y=0.003x3-0.063x2+0.4196x+0.0768,R2=0.9946,計算得到發(fā)酵后多糖對DPPH自由基的IC50為1.162 mg/mL。

2.3.2 發(fā)酵前后石斛多糖清除ABTS自由基的能力 石斛多糖提取液發(fā)酵前后清除ABTS自由基的能力見圖6。

圖6 發(fā)酵前后石斛多糖清除ABTS自由基的能力Fig.6 The scavenging ABTS ability of DOP after fermentation

由圖6可以看出,發(fā)酵前后多糖對ABTS自由基的清除能力隨著濃度的增加而升高,當(dāng)發(fā)酵前多糖濃度為4 mg/mL時,發(fā)酵后多糖濃度為2 mg/mL時,清除率隨著質(zhì)量濃度的增加趨于平緩。根據(jù)發(fā)酵前多糖清除率擬合曲線y=0.0073x3-0.1036x2+0.4999x+0.093R2=0.9988,計算得到發(fā)酵前多糖對ABTS自由基的IC50為0.79 mg/mL;根據(jù)發(fā)酵后多糖清除率擬合曲線y=-0.0111x4+0.1484x3-0.6734x2+1.2299x+0.1776,R2=0.9951,計算得到發(fā)酵后多糖對ABTS自由基的IC50為0.235 mg/mL。

2.3.3 發(fā)酵前后石斛多糖的總抗氧化能力 石斛多糖提取液發(fā)酵前后總抗氧化能力見圖8。

圖7 總抗氧化測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.7 Standard curve of total antioxidant power

圖8 發(fā)酵前后石斛多糖總抗氧化能力Fig.8 The total antioxidant of DOP after fermentation

由圖7可以看出,FeSO4濃度在0.1～5 mmol/L范圍內(nèi)與吸光值呈良好的線性關(guān)系。擬合方程y=0.411x-0.0755,R2=0.9946。

由圖8可以看出,發(fā)酵前后多糖總抗氧化活性隨著質(zhì)量濃度的增大而逐漸提高。

2.4 多糖分子量測定結(jié)果

由GPC-MALS系統(tǒng)測定發(fā)酵前后多糖分子量,結(jié)果顯示發(fā)酵前多糖的平均分子量為4.234×105,發(fā)酵后多糖的平均分子量為1.077×105;發(fā)酵后多糖平均分子量與發(fā)酵前多糖相比縮小了4倍,經(jīng)由微生物轉(zhuǎn)化發(fā)酵多糖得到水解,使得裸露的羥基較多,可能是使其抗氧化活性比發(fā)酵前多糖好的原因。

3 結(jié)論

通過對鐵皮石斛多糖液態(tài)發(fā)酵法的工藝進行研究,考察發(fā)酵pH、溫度、轉(zhuǎn)速及時間對酵母菌生長情況的影響,獲得液態(tài)發(fā)酵適宜的參數(shù),即溫度28 ℃,pH為4.5,轉(zhuǎn)速在170 r/min時酵母發(fā)酵54 h。

通過測定發(fā)酵前后多糖的總抗氧化能力、清除DPPH、ABTS自由基的能力,評價其抗氧化活性。發(fā)酵前多糖對DPPH、ABTS自由基的IC50分別為2.226、0.79 mg/mL;發(fā)酵后多糖對DPPH、ABTS自由基的IC50分別為1.162、0.235 mg/mL,表明發(fā)酵前后多糖均具有一定的抗氧化活性,且發(fā)酵后多糖抗氧化活性優(yōu)于發(fā)酵前多糖。

通過GPC-MALS系統(tǒng)測定發(fā)酵前后多糖分子量,結(jié)果顯示發(fā)酵前多糖的平均分子量為4.234×105,發(fā)酵后多糖的平均分子量為1.077×105,發(fā)酵后多糖平均分子量與發(fā)酵前多糖相比縮小了4倍。

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Study on polysaccharides submerged fermentation fromDendrobiumofficinaleand its antioxidant activity

XUE Yan1,LI Li1,LIU Guang-rong2,WANG Xiao-yue1,WANG qiao-e1,DONG Yin-mao1,*

(1.Beijing Key Laboratory of Plant Resources Research and Development, Beijing Technology and Business University,Beijing 100048,China; 2.Wuxianji(China)Co.,Ltd,Guangzhou 510623,China)

In this paper,the suitable submerged fermentation method and antioxidant activity ofDendrobiumofficinalepolysaccharide(DOP)were studied. The effects of temperature,agitation speed,pH and time on yield ofcerevisiaewere investigated on the basis of single-factor experiments and orthogonal test for fermentation. The optimum fermentation process parameters were fermentation temperature 28 ℃,pH 4.5,agitation speed 170 r/min,fermentation time 54 h. The total antioxidant capacity,DPPH and ABTS free radical scavenging capacity ofDendrobiumofficinalepolysaccharide has been improved by fermentation,and has very strong dose-response relationship. Average molecular weight of polysaccharide by water extraction and fermentation measured by the GPC-MALLS system showed that it was decreased from 4.234×105to 1.077×105after fermentation. The improvement of antioxidant capacity may be related to the decrease of molecular weight.

Dendrobiumofficinale;water extraction;submerged fermentation;polysaccharides;antioxidant activity

2016-11-11

薛燕(1993-)，女，碩士研究生在讀，研究方向：化妝品植物原料，E-mail:15632374533@163.com。

*通訊作者:董銀卯(1963-)，男，博士，教授，研究方向：植物源化妝品功效成分研究與應(yīng)用，E-mail：ymdong2008@163.com。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0155-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.021