不同乳酸菌發酵蘿卜干的品質動態變化研究

劉宗敏,譚興和,*,周紅麗,姚 荷,劉楚岑,王 鋒,郭紅英,王欄樹,嚴欽武,徐永兵

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128; 2.湖南佳宴食品有限公司,湖南長沙 410000; 3.湖南插旗菜業有限公司,湖南岳陽 414000)

不同乳酸菌發酵蘿卜干的品質動態變化研究

劉宗敏1,譚興和1,*,周紅麗1,姚 荷1,劉楚岑1,王 鋒1,郭紅英1,王欄樹2,嚴欽武3,徐永兵3

(1.湖南農業大學食品科技學院,湖南長沙 410128; 2.湖南佳宴食品有限公司,湖南長沙 410000; 3.湖南插旗菜業有限公司,湖南岳陽 414000)

為了縮短生產周期,提高產品質量和安全性,本文以蘿卜干為原料,分別接種腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌、副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌,以自然發酵為對照,研究不同乳酸菌對蘿卜干品質的影響。結果表明,接種發酵和自然發酵pH隨發酵時間先降低后保持穩定;亞硝酸鹽含量隨發酵時間先增加后減小,55 d時接種發酵亞硝酸鹽含量明顯小于自然發酵(p<0.05),腸膜明串珠菌和玉米乳桿菌發酵亞硝酸鹽峰值出現的時間比副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和自然發酵早22 d左右;接種發酵和自然發酵的總酸度、揮發酸、揮發酯和游離氨基酸隨發酵時間呈上升趨勢。乳酸菌純種發酵蘿卜干,可以加快發酵速度,降低亞硝酸鹽含量,改善產品品質,其中腸膜明串菌表現最佳。

蘿卜干,發酵,乳酸菌,亞硝酸鹽,游離氨基酸

發酵蘿卜是蘿卜利用微生物發酵而成的一種風味獨特的發酵食品,具有控制體重、抗動脈粥樣化、抗氧化等功效[1-2],深受消費者青睞。但傳統發酵蘿卜產品一般是自然發酵,生產周期長,發酵產品還可能存在一定的質量問題,如亞硝酸鹽含量過高、食鹽含量過高、微生物含量超標等[3-4]。乳酸菌是一類能利用可發酵糖產生大量乳酸的細菌通稱,它主導著蔬菜的發酵過程,并在其中起到關鍵作用[3]。有研究者利用檸檬明串珠菌[4]和乳酸乳球菌[5]作為發酵劑制作泡菜,發現乳酸菌純種發酵泡菜可以減少產品中腐敗菌的數量并延長產品的貨架期。李文婷等[6]研究表明,利用乳酸菌純種發酵蔬菜不僅可以加快蔬菜的發酵速度,還可以降低發酵蔬菜中亞硝酸鹽含量,提高產品的食用安全性。侯曉艷等[7]利用短乳桿菌、腸膜明串珠菌、戊糖片球菌、植物乳桿菌進行蘿卜的純種發酵,發現純種發酵可以明顯縮短蔬菜的發酵周期,提升產品的品質。這些研究都表明了乳酸菌純種發酵蘿卜的可行性,但目前國內蘿卜干的腌制還是以自然發酵為主[8]。本研究利用腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌、副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌純種發酵蘿卜干并對蘿卜干發酵過程中品質動態變化進行分析,進而選擇適合發酵蘿卜干的乳酸菌,為工業化生產發酵蘿卜干提供一定的理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

腸膜明串珠菌CICC-21859(Leuconostocmesenteroides),玉米乳桿菌CICC-21826(Lactobacilluszeaze),副干酪乳桿菌CICC-22709(Lactobacillusparacasei),乳酸乳球菌CICC-6033(Lactococcuslactis) 中國工業微生物菌種保藏管理中心(China Center of Industrial Culture Collection,CICC)；蘿卜干 企業提供;食鹽、油、紅線椒 湖南農業大學東之源超市。

MRS肉湯培養基 葡萄糖 20 g,酪蛋白酶消化物 10.0 g,牛肉膏粉 10.0 g,酵母膏粉 4.0 g,檸檬酸三銨 2.0 g,乙酸鈉 5.0 g,硫酸鎂 0.2 g,硫酸錳 0.05 g,磷酸氫二鉀 2.0 g,吐溫-80 1.08 g,蒸餾水1000 mL;MRS瓊脂培養基 葡萄糖20.0 g,蛋白胨10.0 g,牛肉膏粉5.0 g,酵母膏粉4.0 g,吐溫-80 1.0 mL,磷酸氫二鉀2.0 g,乙酸鈉5.0 g,檸檬酸三銨2.0 g,硫酸鎂0.2 g,硫酸錳0.05 g,瓊脂15.0 g,蒸餾水1000 mL。

UV-1750紫外-可見分光光度計 上海元析儀器有限公司;YXQ-SG46-280S 高溫滅菌鍋、DHG-9140A電熱恒溫水浴鍋 上海博訊醫療設備廠;SS-450離心機、SW-CJ-IFD型單人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司;Model 3800 Branson超聲波清洗儀 必能信超聲有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 凍干菌種活化 用75%酒精棉擦拭裝有菌種的安瓿管對其表面進行消毒,在酒精燈火焰上燒熱安瓿管封口處大概1～2 min,然后在安瓿管封口處滴一滴無菌水,使其前端炸開,用無菌吸管吸取0.5 mL左右滅過菌的MRS液體培養基于安瓿管中,使凍干菌粉全部溶解。將溶解后的菌液轉移到盛有4～5 mL液體培養基的試管中混勻,取幾滴轉接到試管斜面上,將液體試管和斜面試管于推薦條件下靜置培養(乳酸乳球菌30 ℃,腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌、副干酪乳桿菌37 ℃下分別培養24～36 h)。

1.2.2 乳酸菌生長曲線及產酸情況檢測方法 將乳酸菌凍干菌種用MRS瓊脂培養基轉管活化三代,接種5%的活化菌種于MRS液體培養基中,在30 ℃或37 ℃下靜置培養,每隔2 h取樣測定培養液在波長600 nm下的光密度OD和pH[9]。

1.2.3 發酵種子液的制備 活化好的凍干菌種,接種5%的活化菌種于MRS液體擴大培養基中培養(250 mL三角瓶裝液量為50 mL),按不同菌種的生長情況,取對數生長期的菌液,離心分離(5000 r/min,4 ℃,5 min)集菌,用0.85%的生理鹽水清洗兩次,定容至50 mL制成乳酸菌懸濁液待用(發酵種子液最終濃度達到乳酸菌數為108～109CFU/mL)。

1.2.4 蘿卜干發酵實驗設計 將蘿卜干漂洗切分后,加入一定量水分和食鹽,使蘿卜干含水量為65%,食鹽濃度為5%,乳酸菌接種(5%)或不接種(對照),拌勻并裝壇發酵,發酵溫度28 ℃,每組做兩個平行。每隔11 d測pH和亞硝酸鹽的含量,每隔28 d測定總酸度、揮發酸、揮發酯和游離氨基酸的含量。

1.2.5 pH的測定 使用PHS-3C型pH計測定,取10 g蘿卜干加100 mL蒸餾水制成勻漿,過濾后測定濾液pH。

1.2.6 亞硝酸鹽的測定 亞硝酸鹽的測定參考GB 5009.33-2010,采用第二法分光光度法測定[10]。

1.2.7 總酸度的測定 總酸度的測定按照GBT 12456-2008 pH電位法測定[11]。

1.2.8 揮發酸的測定 揮發酸的測定方法按照GBT 10467-1989測定[12]。

1.2.9 揮發酯的測定 揮發酯的測定參考黃國柱等[13]測黃酒揮發酯的方法。

1.2.10 游離氨基酸的測定 游離氨基酸的測定按照GB 5009.235-2016酸度計法測定[14]。

1.3 數據分析

采用Microsoft Excel 2007整理實驗數據,用SPSS 18分析實驗數據,用Origin75繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同乳酸菌的生長曲線和產酸情況

圖1 不同乳酸菌的生長曲線圖Fig.1 Growth curves of LAB

通常以OD值的變化反映微生物的增殖情況。不同菌株生長曲線見圖1。培養16 h以內,各菌株OD值隨著培養時間的延長而明顯增加,腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌、副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌進入對數生長末期的時間分別在6、12、10和8 h,表明以上菌株適宜接種的最佳時間分別為6、12、10和8 h。培養16 h后,各菌株OD值增加平緩,玉米乳桿菌的OD值一直最大,其次分別是副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和腸膜明串珠菌。表明玉米乳桿菌的數量﹥副干酪乳桿菌﹥乳酸乳球菌﹥腸膜明串珠菌。而且,腸膜明串珠菌的OD值一直遠低于其他菌株的,表明該菌的數量遠少于其他菌株的。

培養期間pH的大小可以反映不同乳酸菌的產酸情況。由圖2可看出,培養16 h以內,各培養液pH隨著培養時間的延長而明顯降低,16 h后則變化平緩。在平穩期時,培養腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌、副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌培養液的pH基本上維持在4.25、3.90、3.85和3.95,腸膜明串珠菌培養液pH一直高于其他菌株的,說明腸膜明串珠菌可能不耐酸,Ji Y J等[15]研究發酵蔬菜中乳酸菌基因表達情況時發現腸膜明串珠菌缺少與耐酸性相關的基因。隨著培養液中乳酸的積累,腸膜明串珠菌的生長可能受到乳酸的影響,導致其增殖率低、產酸總量少。

圖2 pH隨培養時間的變化Fig.2 Change in pH value during fermentation

2.2 蘿卜干發酵過程中pH的變化

發酵蔬菜的pH大小可以反映不同乳酸菌的產酸情況及發酵蔬菜的成熟情況。由圖3可看出,接種發酵和自然發酵pH隨發酵時間先降低后保持穩定。發酵第1 d時,接種發酵組pH明顯高于自然發酵組(p<0.05),但在發酵第11 d時,接種發酵組pH明顯低于自然發酵組(p<0.05),說明接種能加快發酵速度;發酵第22 d時,各發酵組pH差異顯著(p<0.05),其中pH由小到大:腸膜明串珠菌(3.56±0.01)<玉米乳桿菌(4.20±0.01)<自然發酵(4.44±0.01)<乳酸乳球菌(4.48±0.01)<副干酪乳桿菌(4.57±0.02),表明腸膜明串珠菌接種到蘿卜干中能迅速適應發酵環境并產酸,玉米乳桿菌發酵pH較低可能和圖1所示其增殖率高有關。發酵33 d時,副干酪乳桿菌pH明顯小于自然發酵(p<0.05),乳酸乳球菌pH和自然發酵差異不顯著(p>0.05),說明發酵22～33 d期間,副干酪乳桿菌發酵速度>乳酸乳球菌發酵速度>自然發酵速度。從pH的變化可以看出,發酵前期(1～22 d)腸膜明串珠菌和玉米乳桿菌發酵速度較快,這與王秋霞等[16]得出腸膜明串珠菌是發酵蔬菜初期最主要的乳酸菌結論一致;發酵中后期(22～55 d)副干酪乳桿菌和乳酸乳球菌發酵速度較快。

圖3 蘿卜干發酵過程中pH的變化Fig. 3 Change in pH of dried turnip during fermentation注：小寫字母不同表示各組之間差異顯著(p<0.05)。圖4～圖8同。

2.3 蘿卜干發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化

亞硝酸鹽是一種有毒有害物質,在人體內可以轉變為有致癌作用的亞硝胺類化合物。由圖4可看出,接種發酵和自然發酵亞硝酸鹽含量隨發酵時間先增加后減小,且各發酵組在1～55 d的亞硝酸鹽含量低于4 mg/kg,都符合綠色食品醬腌菜亞硝酸鹽的限量規定[17]。在發酵初期壇內存在大量氧氣,一些好氧雜菌比較活躍,將蔬菜中含有的硝酸鹽還原成亞硝酸鹽,經過一段時間發酵后,壇內氧氣減少,乳酸菌開始大量繁殖,產生大量乳酸,抑制其他不耐酸雜菌的生長,并促進亞硝酸鹽的降解,因此呈現出亞硝酸鹽峰[18]。腸膜明串珠菌和玉米乳桿菌發酵在22 d左右出現亞硝酸鹽峰,峰值出現的時間比副干酪乳桿菌、乳酸乳球菌和自然發酵早22 d左右,其中腸膜明串珠菌組亞硝酸鹽峰值為(3.55±0.12) mg/kg,明顯大于玉米乳桿菌組亞硝酸鹽峰值(p<0.05),但在33 d時,腸膜明串珠菌和玉米乳桿菌組亞硝酸鹽含量差異不顯著(p>0.05),說明腸膜明串珠菌降解亞硝酸鹽的速度比玉米乳桿菌的快,這可能與圖3所顯示的腸膜明串珠菌接種到蘿卜干中迅速產酸有關。李清等[19]的結果表明接種乳酸菌可有效抑制亞硝酸鹽的生成,接種的乳酸菌不同,降解亞硝酸鹽的效果也不同。在56 d時,接種發酵亞硝酸鹽含量明顯低于自然發酵組,說明接種發酵能有效控制發酵蔬菜中亞硝酸鹽的含量[20]。

圖4 蘿卜干發酵過程中亞硝酸鹽含量的變化Fig. 4 Change in nitrite concentrations of dried turnip during fermentation

2.4 蘿卜干發酵過程中總酸度的變化

總酸度的大小可以反映發酵過程中微生物產乳酸的情況。由圖5可看出,56 d時，接種發酵和自然發酵總酸度均上升。隨著腌制時間的增加,發酵蘿卜中乳酸含量逐步增加,最后趨于穩定[21],其中玉米乳桿菌和乳酸乳球菌組總酸度隨發酵時間先上升再略微下降,這可能是發酵過程中乳酸菌產生的乳酸部分被其他微生物所利用。在56 d時各組總酸度由大到小:副干酪乳桿菌(1.41%±0.04%)>乳酸乳球菌(1.26%±0.07%)>自然發酵(1.20%±0.05%)>腸膜明串珠菌(1.046%±0.04%)>玉米乳桿菌(0.89%±0.01%),總酸度越高并不代表發酵蔬菜品質越好,蘿卜干的總酸度為0.8%～1.2%時品質最好[5],這也表明在發酵56 d時腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌和自然發酵組蘿卜干的品質較好。

圖5 蘿卜干發酵過程中總酸度的變化Fig.5 Change in titratable acidity of dried turnip during fermentation

2.5 蘿卜干發酵過程中揮發酸含量的變化

揮發酸是腌制產品中酸性氣味的主要來源[22]。由圖6可看出,接種發酵和自然發酵揮發酸含量隨發酵時間呈上升趨勢。其中,在發酵第28 d時,腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌和乳酸乳球菌組揮發酸含量要比自然發酵組高,且接種發酵各組之間的差異顯著(p<0.05)。說明比起自然發酵,接種發酵可以加快蘿卜干揮發酸類物質的形成,且菌種不同,加速的效果不同。發酵56 d時,各組發酵蘿卜干揮發酸含量差異顯著(p<0.05),其中乳酸乳球菌發酵揮發酸含量最低,為(0.21%±0.01%),蘿卜酸味較淡;腸膜明串珠菌發酵揮發酸含量最高,為(1.17%±0.01%),具有發酵蘿卜干特有的酸味。

圖6 純種發酵與自然發酵蘿卜干揮發酸含量隨時間的變化Fig.6 Change in volatile acid ester of dried turnip during fermentation

2.6 蘿卜干發酵過程中揮發酯含量的變化

揮發酯是腌制蔬菜主要風味物質的主要來源。由圖7可看出,接種發酵和自然發酵揮發酯隨發酵時間呈上升趨勢。發酵28 d時,腸膜明串珠菌、玉米乳桿菌和副干酪乳桿菌組揮發酯含量明顯比自然發酵組高(p<0.05),說明接種發酵能促進蘿卜干揮發酯類物質的生成[23],其中腸膜明串珠菌組揮發酯含量最高,為(3.39%±0.03%),與自然發酵組(3.51%±0.03%)差異顯著(p<0.05),但在56 d時腸膜明串珠菌發酵蘿卜干揮發酯含量為(3.39%±0.03%),明顯低于自然發酵組(p<0.05),這可能是腸膜明串珠菌比較早的就產生了大量揮發酯類物質,但隨著發酵時間的延長,產生的揮發酯類物質不易保存[7]。

圖7 蘿卜干揮發酯含量隨時間的變化Fig.7 Volatile ester during inoculated and natural fermentation of dried turnip

2.7 蘿卜干發酵過程中游離氨基酸含量的變化

發酵蔬菜中游離氨基酸的含量大小可以衡量蔬菜中蛋白質的降解程度和產品鮮味程度。由圖8可看出,接種發酵和自然發酵游離氨基酸隨發酵時間呈上升趨勢,侯曉燕等[7]用不同乳酸菌純種發酵蘿卜泡菜發現氨基態氮的含量隨著發酵時間呈下降趨勢(從0.25%降到0.05%),這可能是蘿卜中的肽、氨基酸等在發酵過程中不斷溶入到泡菜汁中被各種微生物利用,導致蘿卜中氨基態氮不斷下降。本實驗發酵蘿卜含水量為65%,說明適當減少腌制蔬菜用水量可能會提高發酵產品的鮮味。發酵56 d時,玉米乳桿菌、乳酸乳球菌發酵和自然發酵蘿卜干游離氨基酸含量差異不顯著(p>0.05);副干酪乳桿菌發酵蘿卜干游離氨基酸含量最高,為(0.46%±0.01%),腸膜明串珠菌游離氨基酸含量次之,為(0.40%±0.01%),且兩者差異顯著(p<0.05)。

圖8 蘿卜干游離氨基酸含量隨時間的變化Fig.8 Free amino acid during fermentation of dried turnip

3 結論

研究表明,在發酵速度上,蘿卜干的純種發酵速度比自然發酵速度快,其中腸膜明串珠菌發酵速度比其他三種菌的發酵速度快。在食用安全性上,純種發酵蘿卜干的亞硝酸鹽含量比自然發酵低,其中腸膜明串珠菌發酵蘿卜干亞硝酸鹽峰值提前出現,在22 d時出現亞硝酸鹽峰,峰值為(3.55±0.12) mg/kg(p<0.05),并在出現峰值后迅速降解亞硝酸鹽。在食用蘿卜干時,應避開亞硝酸鹽含量的高峰期。在品質上,純種發酵和自然發酵蘿卜干總酸度、揮發酸、揮發酯和游離氨基酸都隨著發酵時間呈上升趨勢,其中蘿卜干總酸度在0.8%～1.2%左右時品質最好,揮發酸、揮發酯和游離氨基酸在一定范圍內越高越好,但可能隨著發酵時間延長,產品中揮發酸和揮發酯不易保存。在發酵時間上,蘿卜干的發酵時間不宜過長,44～55 d為好,否則品質容易下降。綜合各項指標變化,純種發酵比自然發酵好,其中腸膜明串珠菌表現最佳,這對蘿卜干工業化生產提供了很好的參考價值。

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Study on dynamic changes of quality of dried turnip fermented by different lactic acid bacteria strains

LIU Zong-min1,TAN Xing-he1,*,ZHOU Hong-li1,YAO He1,LIU Chu-cen1,WANG Feng1, GUO Hong-ying1,WANG Lan-shu2,YAN Qin-wu3,XU Yong-bing3

(1.College of Food Science and Technology,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China; 2.Hunan Jiayan Food Company Limited,Changsha 410000,China; 3.Hunan Cha Qi Vegetables Industry Company Limited,Yueyang 414000,China)

In order to shorten the production cycle and improve product quality and safety,Leuconostocmesenteroides,Lactobacilluszeaze,Lactobacillusparacasei,Lactococcuslactiswere used for the fermentation of dried turnip,and compared with natural fermentation. The results indicated that the inoculated fermentation and natural fermentation pH value decreased firstly then remained stable during fermentation time. Inoculated fermentation and natural fermentation nitrite content increased firstly then decreased during fermentation time,and inoculation fermentation nitrite content were much lower than the natural fermentation(p<0.05)at 55 d.LeuconostocmesenteroidesandLactobacilluszeazenitrite peak appearing time were 22 d earlier thanLactobacillusparacasei,Lactococcuslactisand natural fermentation. Inoculated fermentation and natural fermentation total acidity,volatile acid,volatile esters and free amino acid had rising trend during fermentation time. Lactic acid bacteria inoculation could increase the fermentation rate of dried turnip,reduce the nitrite content and improve product quality,while the performance ofLeuconostocmesenteroideswas the best.

dried turnip;fermentation;lactic acid bacteria;nitrite;free amino acid

2016-11-17

劉宗敏(1992-)，女，碩士研究生，研究方向:蔬菜加工,E-mail:ZongzinLiu@163.com。

*通訊作者:譚興和(1959-)，男，博士，教授，研究方向:農產品加工及貯藏,E-mail:xinghetan@163.com。

TS255.53

A

1002-0306(2017)09-0145-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.019