豆類胰蛋白酶抑制劑亞基特性研究

俞紅恩,康玉凡

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,北京 100193)

豆類胰蛋白酶抑制劑亞基特性研究

俞紅恩,康玉凡*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,北京 100193)

本研究選取豌豆、綠豆、豇豆、蕓豆、紅小豆、蠶豆、黑大豆、鷹嘴豆、黎豆、苦豆10種豆,測(cè)得10種豆中胰蛋白酶抑制劑(trypsin inhibitor,TI)含量范圍為47.4～148.9 TIU/g,苦豆和品紅05200的含量最高,分別為148.9、121.8 TIU/g。Gelatin-PAGE活性染色表明10種豆的亞基數(shù)目范圍為5～13個(gè),品種間TI亞基種類、豐度存在一定差異。通過(guò)極端熱、酸、堿、鹽、振蕩條件分別處理10種豆粉粗提液,在亞基層面分析不同豆類胰蛋白酶抑制劑的穩(wěn)定性特征,為進(jìn)一步探究胰蛋白酶抑制劑穩(wěn)定性機(jī)理提供初步結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù),為豆類在食品加工及飼料養(yǎng)殖方面提供指導(dǎo)。

豆類,胰蛋白酶抑制劑亞基,多型性,穩(wěn)定性

胰蛋白酶抑制劑泛指能抑制胰蛋白酶類的多肽或蛋白質(zhì)[1],它具有極為重要的生理活性功能,在醫(yī)學(xué)上可用來(lái)治療Ⅱ型糖尿病、抑制或殺死癌細(xì)胞[2]、治療輻射損傷[3]、通過(guò)抑制激肽釋放酶和纖溶酶達(dá)到手術(shù)止血作用[4];在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上抗病蟲(chóng)害的侵染等[5];在食品加工上豆類胰蛋白酶抑制劑能抑制蛋白酶的水解,作為食品添加劑食用能有效防止魚(yú)、肉產(chǎn)品的軟化[6],從而達(dá)到改善肉類產(chǎn)品的質(zhì)構(gòu)與口感的功效。

豆類種子中的胰蛋白酶抑制劑是一種重要的貯藏蛋白,含量高達(dá)豆類總蛋白的1%～10%。在豆類種子成熟時(shí),胰蛋白酶抑制劑的含量達(dá)到最高;種子萌發(fā)時(shí),胰蛋白酶抑制劑逐漸被降解,含量也隨之下降[7]。我國(guó)主要栽培的豆類有豌豆、綠豆、蕓豆、豇豆、紅小豆、黑大豆及蠶豆等,非主栽的豆類有海紅豆、鷹嘴豆、黎豆、苦豆等,大量研究表明[1-2,6,8],豆類種子中不僅含有豐富的胰蛋白酶抑制劑,并且大部分種子中TI具有較高的耐熱、酸、堿、鹽等穩(wěn)定性,但目前缺乏主栽及非主栽豆類種子中胰蛋白酶抑制劑亞基數(shù)目、含量及其穩(wěn)定特性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)儲(chǔ)備,這些研究數(shù)據(jù)對(duì)豆類胰蛋白酶抑制劑資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)與利用以及科學(xué)加工食用豆類產(chǎn)品都具有極為重要的參考價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

豌豆、綠豆、蕓豆、紅小豆、蠶豆、豇豆、黑大豆、鷹嘴豆、黎豆、苦豆種子 四川、白城、青島、甘肅、吉林等農(nóng)科院;胰蛋白酶(1∶10000,Trypsin>10000 N.F.U/mg)、苯甲酰-DL-精氨酸-對(duì)硝基酰胺鹽(BAPNA) 美國(guó)Sigma公司;明膠 化學(xué)純;其余試劑為分析純或生物試劑。

旋風(fēng)磨 瑞典Foss公司;JY600C型電泳儀 北京君意儀器公司;THZ-C型恒溫振蕩器 北京佳源興業(yè)科技有限公司;GL-3250B型恒溫磁力攪拌器 海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 胰蛋白酶抑制劑的粗提取 用旋風(fēng)磨研磨完整種子并過(guò)80目篩,將過(guò)篩豆粉置于4 ℃冰箱中備用。取5 g豆粉加入10倍蒸餾水于150 mL燒杯中室溫下振蕩攪拌提取60 min,4 ℃下10000 r/min離心20 min取上清液,即為提取液[8]。

1.2.2 胰蛋白酶抑制劑活性測(cè)定

1.2.2.1 測(cè)定原理 胰蛋白酶可催化水解BAPNA,引起410 nm處吸光度的增加,而胰蛋白酶抑制劑可抑制胰蛋白酶的活性,使410 nm波長(zhǎng)處吸光度增加的幅度有所減少,以其減少的程度表示此抑制劑的抑制能力,從而計(jì)算抑制活性[9]。

1.2.2.2 溶液配制 Tris-HCl緩沖液：0.222 g CaCl2溶于100 mL 0.05 mol/L、pH8.2 Tris-HCl緩沖液;BAPNA溶液(現(xiàn)用現(xiàn)配):先以0.5 mL二甲基亞砜溶解0.02 g BAPNA,再用已預(yù)熱37 ℃的Tris-HCl緩沖液定容至50 mL;胰蛋白酶溶液:0.004 g胰蛋白酶用0.001 mol/L的HCl溶解并定容至50 mL;30%乙酸:分別量取30 mL冰乙酸及70 mL蒸餾水,混勻[8]。

1.2.2.3 測(cè)定步驟 微反應(yīng)板上依次加入50 μL樣品液,50 μL胰蛋白酶液,37 ℃保溫10 min后,加入125 μL BAPNA溶液,37 ℃保溫30 min,加入25 μL乙酸溶液終止反應(yīng)。在410 nm波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度[11]。

1.2.2.4 計(jì)算方法 胰蛋白酶抑制劑活性以每克樣品中胰蛋白酶被抑制的程度表示

式(1)

1.2.3 胰蛋白酶抑制劑亞基測(cè)定

1.2.3.1 溶液配制胰蛋白酶液 0.008 g胰蛋白酶溶于40 mL,0.001 mol/L的鹽酸,放置30 min,加水定容至100 mL;脫酶液:6.058 g Tris,11.7 g NaCl,1.11 g CaCl2加水至800 mL,調(diào)pH至7.5,定容至1 L;洗脫液:14.625 g NaCl定容至1 L。

1.2.3.2 Gelatin-PAGE電泳 按5倍提取液加1倍蒸餾水進(jìn)行稀釋,與等體積的非還原電泳樣品緩沖液充分混合,取10 μL進(jìn)行Gelatin-PAGE電泳。采用不連續(xù)垂直平板電泳系統(tǒng),5%的濃縮膠,12%的分離膠,濃縮膠電流為20 mA,分離膠電流為40 mA,電泳畢,先用胰蛋白酶液酶解20 min;倒掉酶液,倒置培養(yǎng)皿37 ℃靜置酶解1.5 h;而后用脫酶液連續(xù)漂洗3次,2 min/次;考馬斯亮藍(lán)R-250染色1 h,脫色液隔夜脫色[12-14]。

1.2.4 胰蛋白酶抑制劑亞基的穩(wěn)定性 選取實(shí)驗(yàn)材料分別為A.海門白玉豌、B. 濰綠7號(hào)、C. 豇豆09-1451、D.奶花蕓豆、E.白紅8號(hào)、F.青蠶13號(hào)、G. 黑大豆、H. 鷹嘴豆、I. 黎豆、J.苦豆,分別進(jìn)行1.酸、2.堿、3.鹽、4.熱、5.振蕩、6.對(duì)照處理。

1.2.4.1 酸性條件對(duì)抑制劑亞型的影響 取0.5 mL提取液加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH1.7的KCl-HCl緩沖液,靜置8 h。4 ℃下10000 r/min離心10 min取上清,然后檢測(cè)TI殘余活性及酶譜變化。

1.2.4.2 堿性條件對(duì)抑制劑亞型的影響 取0.5 mL提取液加入0.5 mL 0.05 mol/L、pH13的KCl-NaOH緩沖液,靜置8 h。4 ℃下10000 r/min離心10 min取上清,然后檢測(cè)TI殘余活性及酶譜變化。

1.2.4.3 高鹽條件對(duì)抑制劑亞型的影響 取0.5 mL提取液加入0.5 mL 2.4 mol/L NaCl溶液,靜置8 h。4 ℃下10000 r/min離心10 min取上清,然后檢測(cè)TI殘余活性及酶譜變化。

1.2.4.4 高溫條件對(duì)抑制劑亞型的影響 取0.5 mL提取液加入0.5 mL 蒸餾水,于100 ℃水中30 min,取出立即冰水冷卻。4 ℃下10000 r/min離心10 min取上清,然后檢測(cè)TI殘余活性及酶譜變化。

1.2.4.5 過(guò)夜振蕩對(duì)抑制劑亞型的影響 取0.5 mL提取液加入0.5 mL 蒸餾水,于渦旋儀渦旋振蕩8 h。4 ℃下10000 r/min離心10 min取上清,然后檢測(cè)TI殘余活性及酶譜變化。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)運(yùn)用SPSS software(Ver.20.0)進(jìn)行分析,凝膠活性電泳圖譜運(yùn)用Quantity one(V4.6.2)進(jìn)行光密度掃描分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同豆類胰蛋白酶抑制劑含量

由表1可知,不同豆類中TI含量存在較大的差異,如豇豆種子中TI平均含量114 TIU/g,而蠶豆種子中TI平均含量60 TIU/g;有些豆類不同品種間TI含量也存在較大差異,如加拿大豌豆與海門白玉豌、中綠5號(hào)與白綠8號(hào)間TI含量差高達(dá)40%左右;豇豆、小豆、蕓豆品種間TI含量十分接近。豆類品種繁多,且TI含量存在顯著差異,江均平等[8]對(duì)3種黑大豆、17種小豆、26種綠豆的TI含量進(jìn)行測(cè)定,發(fā)現(xiàn)綠豆平均含量比紅小豆、黑大豆低5倍以上。胰蛋白酶抑制劑具有雙重功效,既是一種抗?fàn)I養(yǎng)因子又是一種生理活性蛋白,豆類在食品、飼料、保健等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛。因此,可根據(jù)豆類種子用途(提取、食用或飼料加工)選取TI含量適宜的原材料。

表1 不同豆類胰蛋白酶抑制劑活性±s,n=3)

注：同列數(shù)據(jù)后的不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著，上標(biāo)1:豌豆；2:綠豆；3:豇豆；4：蕓豆；5：小豆；6：蠶豆；7：黑大豆；8：鷹嘴豆；9：黎豆；10：苦豆。2.2 不同豆類胰蛋白酶抑制劑多型性

采用非還原Gelatin-PAGE電泳方法對(duì)選取的豌豆、綠豆、豇豆、蕓豆、小豆、蠶豆各3個(gè)品種及黑大豆、鷹嘴豆、黎豆、苦豆各1個(gè)品種的TI亞基進(jìn)行分析,結(jié)果如圖1、圖3及圖4所示,并對(duì)得到的電泳圖譜進(jìn)行光密度掃描分析。

圖1 豌豆、綠豆、豇豆、蕓豆、小豆、蠶豆TI活性電泳圖譜Fig.1 TIS zymogram of pea,mung bean,cowpea,kidney bean,adzuki bean and broad bean on Gelatin-PAGE注：1.加拿大青豌豆;2.隴豌3號(hào);3.海門白玉豌;4.中綠5號(hào);5.白綠8號(hào);6.濰綠7號(hào);7.豇豆09-1452;8.紅白花豇豆;9.吉豇1號(hào);10.奶花蕓豆;11.中花蕓豆;12.英國(guó)紅;13.品紅05200;14.冀紅12號(hào);15.白紅3號(hào);16.青蠶13號(hào);17.臨蠶6號(hào);18.成胡10號(hào). A1～A13:豌豆TIS;B1～B6:綠豆TIS;C1～C8:豇豆TIS;D1～D8:蕓豆TIS;E1～E8:小豆TIS;F1～F10:蠶豆TIS。

圖2 A，B，C和D的TIS酸、堿、鹽、熱、振蕩及對(duì)照處理活性顯色電泳圖Fig.2 TIS activity staining PAGE of crude extract by heat,acid,alkali,salt,oscillation and control from A，B，C and D注：A：海門白玉豌；B：濰綠7號(hào)；C：豇豆09-1451；D奶花蕓豆。

豌豆有13個(gè)亞基,A1、A2為主要構(gòu)成亞基,相對(duì)含量分別約為25.6%、19.0%,A4、A5、A8相對(duì)含量次之,A7、A9、A11、A13亞基在豌豆品種中微量存在,不同豌豆品種中每種亞基的相對(duì)含量差別不大;綠豆有6個(gè)亞基,其中B4為主要構(gòu)成亞基,相對(duì)含量為43.5%～50.8%,其余4個(gè)亞基含量次之;豇豆有8個(gè)亞基,其中C4為主要構(gòu)成亞基,在3個(gè)品種中的相對(duì)含量為30.2%～39%,C1～C3含量次之,C6～C8亞基含量極低;蕓豆由8個(gè)亞基構(gòu)成,D4是其主要組分,中花蕓豆D5、D6、D7亞基的相對(duì)含量較奶花蕓豆和英國(guó)紅高,而奶花蕓豆和英國(guó)紅D8亞基相對(duì)含量較中花蕓豆高;小豆有8個(gè)亞基,其中E4為主要構(gòu)成亞基,3個(gè)小豆品種E4亞基的相對(duì)含量十分接近,28%左右,E1、E2、E3亞基相對(duì)含量次之,其他亞基微量;蠶豆有9～10個(gè)亞基,成胡10號(hào)有10個(gè)亞基,而臨蠶6號(hào)及青蠶13號(hào)有9個(gè)亞基,蠶豆品種間亞基數(shù)目及亞基類型差異較大;黑大豆有11個(gè)亞基,其中G9與G10為主要亞基構(gòu)成,相對(duì)含量分別為24.0%、22.8%。在非主栽豆類品種中,鷹嘴豆有5個(gè)亞基,其中H2、H3亞基含量最高,相對(duì)含量分別為27.3%、31.9%,其余亞基微量;黎豆有6個(gè)亞基,I4和I5亞基含量最高,相對(duì)含量分別為36.9%、24.2%,其他亞基相對(duì)含量極低;苦豆有6個(gè)亞基,其中J3、J5是其主要構(gòu)成亞基,其他亞基微量。

2.3 不同豆類胰蛋白酶抑制劑亞型的穩(wěn)定性

非還原Gelatin-PAGE電泳結(jié)果如圖2所示。

圖3 E，F(xiàn)，G和H的TIS酸、堿、鹽、熱、振蕩及對(duì)照處理活性顯色電泳圖Fig.3 TIS activity staining PAGE of crude extract by heat,acid,alkali,salt,oscillation and control from E,F,G and H注：E白紅3號(hào)；F：青蠶13號(hào)；G：黑大豆；H：鷹嘴豆。

圖4 I和J的TIS酸、堿、鹽、熱、振蕩及對(duì)照處理活性顯色電泳圖Fig.4 TI activity staining PAGE of crude extract by heat,acid,alkali,salt,oscillation and control from I and J注：I：黎豆；J：苦豆。

表2 豆類胰蛋白酶抑制劑亞基酸、堿、鹽、熱、振蕩穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)圖2～圖4的電泳圖譜進(jìn)行光密度掃描分析,得表2及圖5結(jié)果。表2在定性方面總結(jié)了不同豆類TI能耐受極端酸堿鹽熱振蕩環(huán)境的亞基類型,圖5則從定量方面總結(jié)了不同處理對(duì)TI亞基相對(duì)含量的影響。表3從TI整體活性方面探究了極端環(huán)境處理后,部分亞基被破壞,TI活性功能的變化。

由圖2～圖5、表2～表3的分析可知,粗提液經(jīng)極端酸、堿、鹽、熱及振蕩環(huán)境處理后,其TI殘余活性、TI亞基相對(duì)含量及TI亞基數(shù)目變化的結(jié)果相吻合,因此,TI表現(xiàn)出的穩(wěn)定特性是由其具備相應(yīng)穩(wěn)定特性的亞基決定的。濰綠7號(hào)、豇豆09-1451、奶花蕓豆及白紅8號(hào)TI耐受強(qiáng)酸環(huán)境的能力遠(yuǎn)低于耐受強(qiáng)堿環(huán)境;10種豆TI均能在高鹽環(huán)境中保持較高的穩(wěn)定性;濰綠7號(hào)及奶花蕓豆耐受高溫煮沸的能力最強(qiáng);除奶花蕓豆外,其余9種豆TI均能在高強(qiáng)度振蕩環(huán)境中保持高活性。TI是一種蛋白質(zhì),當(dāng)樣品溶液的pH低于TI等電點(diǎn)時(shí),TI便呈正離子狀態(tài);當(dāng)溶液的pH高于TI的等電點(diǎn)時(shí),TI則成負(fù)離子狀態(tài),在等電點(diǎn)附近,水化作用最弱,溶液越不穩(wěn)定[15];TI屬于絲氨酸族蛋白酶抑制劑[16],半胱氨酸、絲氨酸、精氨酸等構(gòu)成其活性部位,高溫條件下,因半胱氨酸殘基和二硫鍵對(duì)熱敏感而易被破壞[17],且研究發(fā)現(xiàn)[18],在蛋白質(zhì)表面絲氨酸含量下降明顯;在高鹽環(huán)境中,鹽分子與溶液中的水進(jìn)行水化作用,降低水分子的活度系數(shù)[19],致使蛋白質(zhì)沉淀。

表3 豆類胰蛋白酶抑制劑酸、堿、鹽、熱、振蕩穩(wěn)定性

圖5 豆類胰蛋白酶抑制劑亞基相對(duì)含量Fig.5 Subunit relative proportion of legume trypsin inhibitor

3 討論與結(jié)論

3.1 豆類胰蛋白酶抑制劑亞基的數(shù)目及含量

實(shí)驗(yàn)材料選取來(lái)自全國(guó)不同地區(qū)的豆類種子,TI亞基活性電泳圖譜顯示豌豆有13種TIS、綠豆有6種TIS、豇豆、蕓豆、小豆有8種TIS,而蠶豆有9～10種亞基,成胡10號(hào)有10種亞基,臨蠶6號(hào)及青蠶13號(hào)有9種亞基。E1-Shamei Z等[20]發(fā)現(xiàn)豆類胰蛋白酶抑制劑亞基的數(shù)目及含量與豆類品種、病害程度、生理狀況有極大關(guān)聯(lián)。研究胰蛋白酶抑制劑的多型性有著非常重要的生理生物學(xué)意義,豆類胰蛋白酶抑制劑在降血糖、抑癌、抗病蟲(chóng)微生物侵害、種子萌發(fā)等方面有著重大意義,有研究表明PTI的一種亞型能劑量依賴性地抑制人體早期結(jié)腸癌細(xì)胞HT29[21]。因此,通過(guò)對(duì)豆類胰蛋白酶抑制劑亞基的進(jìn)一步探究,分離純化相關(guān)功能亞基,更有針對(duì)性地應(yīng)用于醫(yī)療領(lǐng)域,并對(duì)其結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,有助于探究胰蛋白酶抑制劑降血糖、抑癌等生物學(xué)功能機(jī)制。

3.2 豆類胰蛋白酶抑制劑亞基的穩(wěn)定性

大量研究[22-27]表明小豆、綠豆、豇豆、蕓豆、豌豆等均具有較高的熱、高鹽穩(wěn)定性,本研究在亞基層面解釋了豆類胰蛋白酶抑制劑表現(xiàn)出較強(qiáng)熱、高鹽穩(wěn)定性的本質(zhì)是由特定的亞基決定的。在探究TI亞基穩(wěn)定性的電泳圖譜上,顯現(xiàn)出亞基缺失或新增,在極端pH環(huán)境下,由高靜電荷所引起的強(qiáng)分子間排斥力可能會(huì)導(dǎo)致蛋白分子的增大或展開(kāi)[28]。李一莉等[29]研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)對(duì)綠豆胰蛋白酶抑制劑的Lys活性碎片序列進(jìn)行重組去殘基,合成一個(gè)22肽的胰蛋白酶抑制劑,其活性與天然的26肽相當(dāng),這是目前人工合成的最小的多肽類抑制劑。這表明,在一些極端環(huán)境下,胰蛋白酶抑制劑亞基也會(huì)自發(fā)的重組、斷裂,可能會(huì)形成具有新型功能或強(qiáng)化某項(xiàng)功能的高效型胰蛋白酶抑制劑,這也為開(kāi)發(fā)或改進(jìn)胰蛋白酶抑制劑結(jié)構(gòu)功能提供新依據(jù),使其更好地應(yīng)用于醫(yī)藥、食品行業(yè)。

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Subunit properties of legume trypsin inhibitor

YU Hong-en,KANG Yu-fan*

(College of Agronomy,China Agricultural University,Beijing 100193,China)

This study selected 10 varieties of cultivated beans,inclucling mung bean,cowpea,kidney bean,adzuki bean and broad bean,black soybean,chickpea,mucuna,fenugreek as matarials. Trypsin inhibitor(TI)activity,polymorphism and stability of beans were tested. The beans TI activity were 47.4～148.9 TIU/g. Fenugreek and Pinhong05200 had the highest TI activity,which were 148.9,121.8 TIU/g,respectively. Inhibitor activity staining Gelatin-PAGE showed that beans had 5～13 TI bands. The number and the relative content of subunit of legume TI were determined respectively,and there were many differences of subunit properties in diverse cultivars. Through the treatment of extreme heat,acid,alkali,salt and oscillation,the stability characteristics of trypsin inhibitor were analyzed in the level of subunit aiming at provide preliminary structural data for further research on the mechanism of the stability of the trypsin inhibitor and provide guidance for beans in the food processing and forage breeding.

legume;subunit of trypsin inhibitor;polymorphis;mstability

2016-09-13

俞紅恩(1992-)，女，碩士，研究方向：豌豆胰蛋白酶抑制劑提取純化與特性，E-mail：15600912395@163.com。

*通訊作者:康玉凡(1963-)，女，博士，教授，研究方向：種子生物學(xué)及豆類芽菜理論與技術(shù)，E-mail：yfkang@cau.edu.cn。

國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)資金(CARS-09-06B)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0133-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.017