桃果實褐腐病拮抗菌的篩選、鑒定及其拮抗活性

殷曉慧,王慶國,張 暢,石晶盈

(山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018)

桃果實褐腐病拮抗菌的篩選、鑒定及其拮抗活性

殷曉慧,王慶國,張 暢,石晶盈*

(山東農業大學食品科學與工程學院,山東泰安 271018)

以桃褐腐菌(Moniliniafructicola)為靶菌,采用稀釋分離法和平板對峙法從桃園土壤中篩選出對病原菌有較強拮抗作用的菌株12a和14b。通過離體和活體實驗對拮抗菌抑菌活性進行研究,經菌株形態、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析進行菌株鑒定。結果表明:菌株12a和14b分別鑒定為死谷芽孢桿菌(Bacillusvallismortis)和高地芽孢桿菌(Bacillusaltitudinis),其無菌發酵濾液和揮發性代謝產物對桃褐腐菌的生長有顯著的抑制作用,其中12a揮發性代謝產物對其菌絲生長的抑菌效果更為顯著(p<0.05)。兩株拮抗菌的菌液浸泡和熏蒸桃果實,延緩了桃褐腐病發病時間,有效地控制了病斑的擴展。

桃褐腐菌,拮抗菌,揮發性代謝產物,無菌發酵濾液,鑒定

桃果實肉質鮮美,富含蛋白質、糖、粗纖維、礦物質以及胡蘿卜素、維生素B1、尼克酸等多種人體所必需的物質[1],被稱為“天下第一果”[2]。但因其營養豐富,成熟期在高溫季節,采后由微生物造成的腐爛非常嚴重[3]。其中,由褐腐菌(Moniliniafructicola)引起的褐腐病是桃果實采后的重要侵染性病害,環境適宜時,其在貯藏、運輸、銷售及消費過程中發生極為嚴重,使果實迅速喪失商品價值,造成巨大的經濟損失[4]。目前桃果實采后褐腐病的控制主要依賴化學殺菌劑[5]。大量研究表明化學殺菌劑對桃果實采后褐腐病具有直接有效的殺菌作用。紀兆林等[6]測定了15種殺菌劑對桃褐腐病菌的毒力效果,咪鮮胺、戊唑醇和多菌靈等均對桃褐腐病菌有較強的毒力作用。Adaskaveg等[7]研究表明,環酰菌胺、啶酰菌胺、嘧霉胺和密菌環胺等能夠有效地控制桃褐腐病的發生。但是長期使用化學殺菌劑會導致病原菌抗藥性產生,藥劑殘留量增加和環境污染等問題[8]。

生物防治因其安全無毒、高效無殘留等特點而受到廣泛關注,并已有桃褐腐菌生防菌的篩選及對桃褐腐病防治的報道[9-11]。紀兆林等[12]在桃病果上分離篩選得到的地衣芽孢桿菌菌株W10菌液和抗菌蛋白能夠明顯地推遲褐腐病的發病時間,降低自然腐爛率。枯草芽孢桿菌CPA-8對桃果實褐腐病的體外實驗表明,其無菌濾液對桃褐腐病菌有80%～90%的抑制活性[13]。氣體熏蒸方式防治采后病害在生產中使用更為方便,而利用拮抗微生物產生的揮發性成分抑制病原菌生長和果實采后病害的研究報道比較少見。因此,有必要分離和篩選產揮發性拮抗成分的微生物用于防治采后病害,為生防菌的推廣應用奠定良好的基礎。

本研究從桃樹根際土壤中篩選到兩株對桃褐腐菌有拮抗作用的菌株12a和14b,并對其進行鑒定,在離體實驗的基礎上,通過浸泡和熏蒸的方法進一步探究其對桃果實活體的抑菌活性,初步評價拮抗菌無菌發酵濾液和揮發性代謝產物對桃果實褐腐病的防治效果,以期為桃褐腐病的防治提供新的拮抗菌株資源,為其實際應用奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

桃褐腐菌(Moniliniafructicola)、拮抗菌12a(Bacillusvallismortis)及拮抗菌14b(Bacillusaltitudinis) 均由山東農業大學食品科學與工程學院果蔬采后貯藏保鮮實驗室分離保存。

牛肉膏蛋白胨固體培養基(NA):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2,121 ℃高壓滅菌20 min;牛肉膏蛋白胨液體培養基(NB):牛肉膏3 g,蛋白胨10 g,NaCl 5 g,蒸餾水1000 mL,pH7.2,121 ℃高壓滅菌20 min;馬鈴薯蔗糖瓊脂培養基(PDA):馬鈴薯200 g,蔗糖20 g,瓊脂20 g,蒸餾水1000 mL,121 ℃高壓滅菌20 min。

SJ-CJ-1D超凈工作臺 蘇州蘇潔凈化設備有限公司;ZQTY-70F恒溫振蕩培養箱 上海知楚儀器有限公司;AL204電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;EPED-E2-20TF實驗室級超純水器 南京易普易達科技發展有限公司;HWS-500恒溫培養箱 寧波江南儀器廠;YXQ-LS-50S歷史壓力蒸汽滅菌器 上海博迅實業有限公司;3730XL測序儀、2720 thermal cycler PCR儀 APPlied Biosystems;DYCP-31DN DNA電泳槽、DYY-5穩壓電泳儀 北京六一儀器廠;DK-SD電熱恒溫水槽 上海一恒科學儀器有限公司;FR98O凝膠成像儀 上海復日科技儀器有限公司;HC-258R冷凍高速離心機 Bio Basic Inc;SP10-1000 Surf系列精密單道可調移液器、Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒SK8255、SanPrep柱式DNAJ膠回收試劑盒SK8131 生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 拮抗菌的分離和篩選 在未施用化肥農藥的桃園中采集桃樹根際土壤,采用稀釋分離法,取處理好的土壤0.5 g于10 mL無菌試管中,加入5 mL無菌水,振蕩搖勻,靜置3 min,吸取上層溶液0.5 mL加入到另一無菌試管內,加入4.5 mL無菌水,搖勻靜置,依次進行稀釋,獲得10-1、10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液,分別吸取10-2、10-3和10-4的土壤稀釋液100 μL加到NA平板上,用無菌涂布器涂勻,標明編號,放置1 h后將培養皿反轉,于37 ℃中培養。2 d后,根據菌落形態等特點挑選細菌單菌落,分別移接到NA平板上,培養48 h后用于后續實驗。經純化的菌株于NA斜面培養基上,4 ℃保存。

采用平板對峙法[14]篩選拮抗菌。在PDA平板中央接種桃褐腐菌菌餅,以褐腐菌菌餅為中心,劃十字,在十字交叉線的四端、距離平板1.5 cm處,接種分離出的同一種細菌,每個處理3皿。室溫下培養96 h,以不接種細菌的培養皿為對照(Control),測定其抑菌率,選擇抑菌率較高的兩株拮抗菌進行后續實驗。

抑菌率(%)=(對照菌落直徑(mm)-處理菌落直徑(mm))/對照菌落直徑(mm)×100

式(1)

1.2.2 拮抗菌對病原菌抑制活性的測定

1.2.2.1 拮抗菌發酵濾液對桃褐腐菌菌絲生長的抑制作用 挑取NA平板上生長良好的拮抗菌分別接種到150 mL NB培養基中,在40 ℃ 180 r/min振蕩培養48 h。將所得菌液在離心機中10000 r/min離心15 min,取上清液,用0.22 μm微孔濾膜進行過濾,即得無菌濾液。將無菌濾液與冷卻至50 ℃左右的PDA培養基以體積比1∶9的比例混合后倒平板。對照組加入等體積的無菌水。在無菌操作臺中,將事先培養好的桃褐腐菌用直徑為6 mm的打孔器打孔,取菌餅接種到PDA平板中央,在溫度為25 ℃,相對濕度為80%的條件下培養。培養24 h后，每12 h觀察一次,測量菌落直徑,計算抑菌率,計算方法同1.2.1。

1.2.2.2 拮抗菌揮發性代謝產物對桃褐腐菌菌絲生長的抑制作用 參照Gong等[15]的方法采用平板對扣法測定拮抗菌體外揮發性成分對褐腐菌菌絲的影響。制備NA和PDA平板,分別吸取過夜培養的兩株拮抗菌菌液100 μL均勻涂布在NA平板上,取活化7 d的病原菌菌餅接種于另一PDA平板中央,與涂有拮抗菌菌液的平板對扣,密封,在溫度為25 ℃,相對濕度為80%的條件下培養。每個處理3個重復,以只接種病菌菌餅的PDA平板和不做任何處理的NA平板對扣為對照。培養24 h后每12 h觀察一次,測量菌落直徑,計算菌絲生長抑制率,計算方法同1.2.1。

1.2.3 拮抗菌抑制桃果實褐腐病活性的測定

4)常規方案將飽和煙氣加熱至75 ℃，考慮系統溫降后煙囪出口的排放煙氣溫度為70 ℃，高溫煙氣由100 ℃降溫為75 ℃。

1.2.3.1 拮抗菌菌液浸泡對桃果實褐腐病病斑擴展的影響測定 挑取NA培養基上生長良好的兩株拮抗菌分別接種到NB培養基中(各1000 mL),40 ℃ 180 r/min振蕩培養48 h,將菌液用無菌水稀釋一倍。取成熟度一致、大小均一、無病蟲害和機械傷的肥城白里桃,分別用兩種菌液稀釋液浸泡15 min,以無菌水浸泡處理為對照,20 ℃下自然晾干,每個果在赤道一側果面的中心處刺3 mm×3 mm×3 mm的傷口1個,接種參照Gu等[16]的方法制備的5×104個孢子囊/mL的桃褐腐菌孢子囊懸浮液20 μL。將上述處理的果實于(20±1) ℃保濕貯藏。每個處理重復三次,每次重復處理果實20個,該實驗重復兩次。貯藏36 h后，每12 h調查一次病斑直徑,計算病斑擴展抑制率。

病斑擴展抑制率(%)=(對照病斑直徑(cm)-處理病斑直徑(cm))/對照病斑直徑(cm)×100

1.2.3.2 拮抗菌菌液熏蒸對桃果實褐腐病病斑擴展的影響測定 將在NB培養基中振蕩培養48 h的菌液1000 mL倒入密封罐的隔板下層(對照下層為相同體積的無菌水),上層放置成熟度一致、大小均一、無病蟲害和機械傷的肥城白里桃,用凡士林密封罐蓋,熏蒸1 h后將果實取出。每果刺3 mm×3 mm×3 mm的傷口1個,分別接種5×104個孢子囊/mL的桃褐腐菌孢子囊懸浮液20 μL,將上述處理的果實于(20±1) ℃保濕貯藏。每個處理重復三次,每次重復處理果實20個,該實驗重復兩次。貯藏36 h后，每12 h調查一次病斑直徑,計算病斑擴展抑制率,計算方法同上。

1.2.4 拮抗菌的鑒定

1.2.4.1 分子生物學鑒定 采用SK8255(細菌)DNA 提取試劑盒分別提取菌株12a和14b的總DNA。PCR擴增采用細菌16S rRNA基因的通用引物對27F(5′-AGT TTG ATC MTG GCT CAG-3′)和1492R(5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)進行PCR擴增,PCR擴增反應體系為25 μL,包括Template(基因組DNA 20～50 ng/μL)0.5 μL,10×Buffer(with Mg2+)2.5 μL,dNTP(各2.5 mmol/L)1 μL,酶0.5 μL,F(10 μmol/L)0.5 μL,R(10 μmol/L)0.5 μL,加雙蒸H2O至25 μL。PCR反應條件為:94 ℃預變性4 min;94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,循環30次;72 ℃修復延伸10 min,4 ℃終止反應。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳,電泳條件為150 V、100 mA、20 min,EB染色后用凝膠成像系統觀察電泳條帶,切割所需DNA目的條帶,純化方式按照SK8131試劑盒說明書進行,PCR產物用PCR引物直接測序。測序完成后,將得到的序列在NCBI網站上進行BLAST分析,選取具有代表性的菌株,采用MEGA 6軟件進行多序列同源性分析,并構建系統進化樹。

1.2.4.2 菌株形態和生理生化鑒定 菌株形態和生理生化鑒定:參照《常見細菌系統鑒定手冊》[17]中的方法對菌株12a和14b的形態和生理生化指標進行鑒定。

1.2.5 數據分析 采用IBM SPSS Statistics 20統計軟件進行數據分析,用Duncan新復極差法進行顯著性(p<0.05)水平檢驗。使用SigmaPlot 10.0進行作圖。

2 結果與分析

采用平板稀釋法從桃樹根際土壤中分離出57株菌,利用平板對峙法篩選出4株對桃褐腐菌抑制效果較為明顯的拮抗菌(表1),其中菌株12a和14b的抑菌活性較強,抑制率分別達70.6%和56.5%,結果見圖1。

表1 四種拮抗菌對桃褐腐菌菌絲生長的抑制效果

注：同列中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),表中數據為3次重復的平均值。

2.2 拮抗菌對病原菌菌絲的抑制效果

2.2.1 拮抗菌12a、14b發酵濾液對桃褐腐菌菌絲生長的抑制作用 如圖2和圖3所示,拮抗菌12a和14b的無菌發酵濾液均對桃褐腐菌具有較好的抑菌活性,經拮抗菌無菌發酵濾液處理的病原菌菌落邊緣色素沉著、菌絲萎縮老化,其中拮抗菌12a的無菌發酵濾液對桃褐腐菌的菌絲生長具有較強的抑制作用,處理96 h后，其抑制率高達83.1%,拮抗菌14b的無菌發酵濾液對菌絲生長的抑制作用相對較弱,在40%左右。

圖2 菌株12a及14b無菌發酵濾液對桃褐腐菌菌絲生長的影響Fig.2 Inhibition of sterile fermentation filtrate of strain 12a and 14b on mycelial growth of M. fructicola注:同一時間中不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05),圖4、圖6、圖7同。

圖3 菌株12a及14b無菌發酵濾液對桃褐腐菌的抑制作用Fig.3 Inhibition of sterile fermentation filtrate of strain 12a and 14b on M. fructicola

2.2.2 拮抗菌株12a、14b揮發性代謝產物對桃褐腐菌菌絲的抑制作用 由圖4、圖5可以看出,拮抗菌12a、14b的揮發性代謝產物對桃褐腐菌具有強烈的抑制作用。和對照相比,桃褐腐菌在12a揮發性代謝產物的影響下菌絲褐變、生長受阻,在14b揮發性代謝產物的影響下菌絲擴展緩慢。處理96 h后,與菌株12a對扣的褐腐菌絲幾乎無擴展,菌株14b的抑制率達67.7%,兩者均具有較好的應用開發價值。

圖4 菌株12a及14b揮發性代謝產物對桃褐腐菌的抑制作用Fig.4 Inhibition of volatile metabolites of strain 12a and 14b on mycelial growth of M. fructicola

圖5 菌株12a及14b揮發性代謝產物對桃褐腐菌的抑制作用Fig.5 Inhibition of volatile metabolites of strain 12a and 14b on M. fructicola

2.3 拮抗菌對桃果實褐腐病的抑制效果

圖6 菌株12a及14b發酵液對桃果實病斑擴展的影響Fig.6 Effects of fermentation filtrate of strain 12a and 14b on development of lesion diameter of peach fruit inoculated with M. fructicola

2.3.1 拮抗菌菌液浸泡對桃果實褐腐病病斑擴展的影響 如圖6所示,拮抗菌12a和14b發酵液浸泡處理,能明顯延緩接種褐腐菌后桃果實病斑直徑的擴展,但因其浸泡時桃毛脫落,蠟質層損傷,因此,桃果實自身抗性降低,防治效果隨著時間的延長而逐漸降低。貯藏36 h時，對照組桃果實已出現褐腐病病斑，而處理組未出現。經拮抗菌12a發酵液浸泡處理的桃果實褐腐病病斑出現的時間晚于對照，且病斑直徑顯著(p<0.05)低于對照,防治效果較為明顯,處理60 h后,病斑擴展的抑制率達74.2%;拮抗菌14b發酵液浸泡處理對桃果實病斑直徑的抑制也有一定的效果,處理60 h后,病斑擴展的抑制率為24.7%。

2.3.2 拮抗菌菌液熏蒸對桃果實褐腐病病斑擴展的影響 如圖7所示,經菌株12a和14b發酵液熏蒸處理的桃果實褐腐病病班出現的時間晚于對照組，且病斑直徑顯著(p<0.05)低于對照,處理后前期的防治效果較為明顯。其中,拮抗菌12a發酵液熏蒸處理的桃果實對病斑的擴展有較強的抑制作用,處理60 h后,病斑擴展的抑制率達77.1%;拮抗菌14b發酵液熏蒸果實60 h后,病斑擴展的抑制率達50%。

圖7 菌株12a及14b揮發性代謝產物對桃果實病斑擴展的影響Fig.7 Effects of volatile metabolites of strain 12a and 14b on lesion diameter of peach fruit inoculated with M. fructicola

2.4 拮抗菌的鑒定

2.4.1 分子生物學鑒定 以菌株12a和14b基因組DNA為模板,利用細菌通用引物進行PCR擴增,測得菌株12a和14b的16S rRNA基因序列長度分別為1509 bp和1508 bp(圖8),將序列通過NCBI比對后,選取相似序列構建系統發育樹(圖9,圖10)。結果表明,拮抗菌12a與BacillusvallismortisAB681417在同一分支上,遺傳進化距離最近,拮抗菌14b與BacillusaltitudinisAJ831842在同一分支上,遺傳進化距離最近。

圖8 PCR擴增產物的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig.8 Agarose gel electrophoresis of PCR product from strain 12a and 14b

圖9 基于菌株12a的16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.9 Phylogenetic tree of strain 12a based on 16S rRNA gene sequence

圖10 基于菌株14b的16S rRNA基因序列構建的系統發育樹Fig.10 Phylogenetic tree of strain 14b based on 16S rRNA gene sequence

2.4.2 菌株形態和生理生化鑒定 菌株12a經革蘭氏染色陽性,鏡檢呈桿狀,具鞭毛,有芽孢,在NA平板上形成乳白色菌落,表面有褶皺,干燥不透明,邊緣不整齊。菌株14b經革蘭氏染色陽性,鏡檢呈桿狀,具鞭毛,有芽孢,在NA平板上形成的菌落透明,表面光滑,邊緣不整齊。拮抗菌12a和14b的生理生化鑒定結果見表2。結合菌株形態、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析,鑒定拮抗菌12a為死谷芽孢桿菌(B.vallismortis),拮抗菌14b為高地芽孢桿菌(B.altitudinis)。兩株拮抗菌已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物菌種保藏中心進行了保藏,12a的保藏號為CGMCC No.12179,14b的保藏號為CGMCC No.12180。

表2 菌株12a和14b的生理生化特性

注：“+”表示陽性,“-”表示陰性。

3 結論與討論

采用平板稀釋法從桃樹根際土壤中分離得到57種菌株,經平板對峙篩選到兩株對桃褐腐病原菌具有較強拮抗作用的菌株12a和14b。離體抗菌活性的測定中發現拮抗菌12a和14b的無菌發酵濾液和揮發性代謝產物對桃褐腐菌絲均有明顯的抑制作用,說明兩者中含有抑制桃褐腐病病原菌的成分,其活性物質有待進一步深入研究。張志斌等研究發現拮抗菌株FRo2發酵濾液對金黃色葡萄球菌等具有強抑制作用,并在濾液中分離得到抑菌活性化合物AW2[18]。Raza等研究發現多粘類芽孢桿菌WR-2產生的揮發性代謝產物具有良好的抗真菌作用,通過GC-MS分離鑒定出的苯并噻唑、苯甲醛、十六醛、2-十三烷酮和苯酚等能夠抑制尖孢鐮刀菌的生長[19]。在活體接種實驗中,經兩株拮抗菌發酵液浸泡和熏蒸處理的桃果實出現病斑的時間均晚于對照,同時期處理組的病斑直徑明顯小于對照,說明兩株拮抗菌的次生代謝產物均能有效的延緩桃果實發病,控制病原菌在桃果實上的侵染,其中揮發性代謝產物對桃果實褐腐病的防治效果更為明顯。桃果實經菌液浸泡后,表面起保護作用的桃毛脫落,易對桃果實造成物理性傷害,而采用熏蒸的方式處理桃果實,操作簡單,成本較低,菌株與桃果實沒有直接接觸,造成交叉感染的風險小,且防治效果優于浸泡處理,因此采用熏蒸的方式對桃果處理具有較高的應用價值和廣闊的市場前景。

結合菌株形態、生理生化特性及16S rRNA基因序列分析對兩株拮抗菌進行菌種鑒定,菌株12a被鑒定為死谷芽孢桿菌,命名為Bacillusvallismortis12a;菌株14b被鑒定為高地芽孢桿菌,命名為Bacillusaltitudinis14b。死谷芽孢桿菌和高地芽孢桿菌在桃采后病害防治上的研究尚未見報道,但是死谷芽孢桿菌在抑制香菇培料中的木霉菌上的研究發現,此菌株生長繁殖所需的營養簡單,繁殖速度快、抗逆性強[20],具有作為優勢生防菌株的潛力,為防治桃果實褐腐病提供了新的資源和途徑,對有效降低桃果實采后褐腐病的侵染和減少化學殺菌劑的使用提供了重要的參考價值,后續研究將對其抑菌活性物質進行分離純化,以期開發出一種高效殺菌、環境友好型的微生物菌劑。

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Isolation and identification of antagonistic bacteria against peach brown rot and its antibacterial activity

YIN Xiao-hui,WANG Qing guo,ZHANG Chang,SHI Jing-ying*

(College of Food Science and Engineering,Shandong Agricultural University,Tai’an 271018,China)

Two antagonistic bacteria 12a and 14b were obtained from the peach rhizosphere soil againstMoniliniafructicolausing serial dilution method and dual-culture inhibition on agar plate. 12a and 14b were identified asBacillusvallismortisandBacillusaltitudinisrespectively by phenotypic,physiological,biochemical and 16S rRNA gene sequence analysis.Invitroevaluation of antagonistic activity,the sterile fermentation filtrate and volatile metabolites of strain 12a and 14b both showed a strong inhibition on the mycelia growth ofM.fructicola. Especially,the inhibitory effect of the volatile metabolites of strain 12a was more significant(p<0.05). For further study,invivotests indicated that fermentation broth and volatile metabolites of strain 12a and 14b also delayed the onset of brown rot significantly(p<0.05)inhibited the development of lesion diameter of peach brown rot.

Moniliniafructicola;antagonistic bacteria;sterile fermentation filtrate;volatile metabolites;identification

2016-12-02

殷曉慧(1992-)，女，碩士，研究方向：食品加工與儲藏技術，E-mail:18763896920@163.com。

*通訊作者:石晶盈(1980-)，女，博士，副教授，主要從事果實采后病害的控制及其機理研究，E-mail:jyshi80@163.com。

山東省科技發展計劃項目(2014GNC113009)；“十二五”國家科技支撐計劃項目(2015BAD16B03)。

TS201.3

A

1002-0306(2017)09-0128-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.016