白鰱魚肌肉脂肪氧合酶提取條件優化及酶學性質研究

王幫國,林 琳,余振宇,李 洋,姜紹通

(合肥工業大學農產品加工研究院,合肥工業大學食品科學與工程學院,安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

白鰱魚肌肉脂肪氧合酶提取條件優化及酶學性質研究

王幫國,林 琳,余振宇,李 洋,姜紹通*

(合肥工業大學農產品加工研究院,合肥工業大學食品科學與工程學院,安徽省農產品精深加工重點實驗室,安徽合肥 230009)

本文以白鰱魚肌肉為原料,通過單因素實驗對白鰱魚肌肉脂肪氧合酶(LOX)提取條件進行優化;用圓二色譜法和熒光光譜法對其貯藏穩定性、熱穩定性、最適pH進行研究;探討磷酸鹽緩沖液pH、離子強度、二硫蘇糖醇(DTT)和乙二胺四乙酸(EDTA)添加量對白鰱魚肌肉LOX提取工藝的影響。結果表明,白鰱魚肌肉LOX適宜提取條件為磷酸鹽緩沖液pH7.8、離子強度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L,在此條件下提取白鰱魚肌肉LOX的酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL,活力為(244.44±5.93) U。通過對LOX酶學性質研究可知,白鰱魚肌肉LOX在常溫條件下0～2 d內酶活性較為穩定,最適作用溫度為40 ℃,最適pH為7.8。

白鰱魚,脂肪氧合酶,提取條件,酶學性質

我國是世界淡水漁業第一大國,2015年我國淡水產品產量3290.04萬t,占我國水產品總產量的49.11%。白鰱生長周期短、抗病能力強、產量高,而且肉質鮮嫩、營養豐富,養殖產量位居淡水魚類第二,是四大家魚之一[1-3]。近年來白鰱魚主要以鮮銷為主,工業化加工發展緩慢,其中土腥味是制約鰱魚加工發展的重要因素之一[4]。

白鰱魚在貯藏與加工過程中,會出現腥味明顯增強的現象,大大影響了消費者對白鰱魚及其制品的喜愛。據已有報導,導致白鰱魚在貯藏和加工過程中腥味增加的原因主要是有兩個方面,一是由于自身不飽和脂肪酸嚴重氧化生成的揮發性成分,二是來源于白鰱魚養殖過程中飲食和周圍環境中物質在體內的堆積[5]。目前認為導致白鰱魚腥味加重主要是因為白鰱魚體內的脂肪氧合酶催化降解不飽和脂肪酸產生的各種醛類物質引起的,不同種魚的特征性風味物質均是由其體內的LOX所決定的。Fu等[6-7]研究表明,白鰱魚體內主要含有12-LOX,其能快速催化分解不飽和脂肪酸,產生和鰱魚腥味密切相關的醛類物質。

脂(肪)氧合酶(LOX,EC1.13.11.12)是一種氧化還原蛋白酶,能催化含順,順-1,4-戊二烯結構的不飽和脂肪酸,生成具有共軛雙鍵的不飽和脂肪酸的氫過氧化物[8-9],目前普遍認為LOX的催化中心與Fe離子有關,其活化態為高自旋的氧化型Fe3+,非活化態為高自旋的還原型Fe2+[10-13]。白鰱魚肌肉LOX氧化會造成不飽和脂肪酸含量下降,降低魚肉營養價值,大大影響鰱魚肉在貯藏和加工過程中的品質,為了更好地研究白鰱腥味物質的產生機理和途徑,研發新型脫腥工藝,保持白鰱魚加工過程中的品質和營養價值,本文以白鰱魚肉為原料,從中提取LOX,對酶的提取條件進行優化,并對LOX的酶學性質進行初步研究,為白鰱的土腥味控制和精深加工提供技術和數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮活白鰱魚 合肥市馬鞍山路家樂福超市,條重(1100±200) g。磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、氫氧化鈉、DTT、EDTA、硫酸銨、亞油酸、硼酸、硼砂、吐溫20 分析純試劑。

JJ-2型組織搗碎機 江蘇省金壇市城西崢嶸實驗儀器廠;HC-3018R高速冷凍離心機 安徽中科中佳科學儀器有限公司;T6新世紀紫外可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;HH-4數顯恒溫水浴鍋 江蘇省金壇市白塔新寶儀器廠;Jasco-810-CD圓二色譜儀 日本Jasco公司;SHIMADZU RF-5301PC熒光分光光度計 島津(香港)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 白鰱魚肌肉LOX的提取 參照Gata等[14]方法稍加修改,將鮮活白鰱魚宰殺,于冰袋中帶回實驗室,然后置于裝滿冰的冰盒中去頭尾和內臟,用冷水洗凈,去脊骨和魚皮,手工采集背部白色肌肉;將新鮮肌肉置于組織搗碎機中,添加4倍體積的50 mmol/L pH7.4 磷酸緩沖液(含1 mmol/L DTT、1 mmol/L EDTA,4 ℃),12000 r/min勻漿1.5 min;勻漿后緩沖液進行冷凍離心(10000×g,60 min),上清液加入13.4 g/100 mL研碎無水硫酸銨,冷凍離心(10000×g,30 min),取上清液加入14.3 g/100 mL研碎無水硫酸銨冷凍離心,沉淀等量溶于磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4)中,即粗酶液。

1.2.2 白鰱魚肌肉LOX酶活、酶液濃度的測定 采用紫外分光光度法[3]測定酶活:用Tween-20(最終濃度0.1 mL/100 mL)做為乳化劑,將亞油酸(最終濃度10 mmol/L)分散在10 mmol/L硼酸緩沖液(pH9.0)中,置于4 ℃冰箱中備用。250 μL上述底物和50 μL LOX酶液添加到1.7 mL磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4),立刻計時,測定其在234 nm吸光度的增加值。吸光度增加0.001/min定義為1酶活力單位。

酶液濃度采用考馬斯亮藍法測蛋白質濃度,標準品選用牛血清蛋白。

1.2.3 白鰱魚肌肉LOX圓二色譜檢測方法 采用圓二色譜法(CD)對LOX的二級結構進行測定。以磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.8)作為空白對照,先將LOX粗酶液稀釋至0.1～0.2 mg/mL,CD光譜掃描范圍190～250 nm,樣品池光程1 mm,掃描速度100 nm/min,常溫(25 ℃)下重復掃描4次,得到LOX粗酶液CD光譜,用平均摩爾橢圓率[θ]表示CD色性,單位deg·cm2/mol。

1.2.4 白鰱魚肌肉LOX熒光強度的檢測 蛋白質中的芳香族氨基酸具有內源熒光性,此類蛋白在外加光源激發情況下會發射內源熒光,熒光光譜會隨著芳香族氨基酸基團位置和微環境的變化而發生改變,所以通過熒光光譜的變化可以用來分析蛋白三級結構的變化趨勢[15-16]。以磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.8)作為空白對照,先將LOX粗酶液稀釋至0.01～0.05 mg/mL,用熒光光譜儀進行掃描,激發波長為295 nm,掃描波長為220～700 nm,速度240 nm/min,常溫(25 ℃)下重復掃描3次。

1.3 實驗內容

1.3.1 白鰱魚肌肉LOX提取條件優化 緩沖液pH對酶的提取至關重要,首先應保證在蛋白質穩定的范圍內,即選擇在偏離等電點兩側,以增大蛋白質的溶解度,提高提取效果,另外選擇合適的pH可以使蛋白質在緩沖液中的共穩定性及溶解度均有所增加[17]。緩沖液離子強度對蛋白質提取同樣重要,離子強度較低時,鹽析作用不明顯,會造成蛋白質無法充分溶解到緩沖液中,較高時則會造成大量雜蛋白提取到緩沖液中[18]。

EDTA作為金屬離子螯合劑,能和堿金屬、稀土元素和過渡金屬等形成穩定的水溶性絡合物,可以有效消除蛋白質提取過程中金屬離子對蛋白質的影響,減少因為金屬離子存在而引起的變性;但是濃度過高時,會影響蛋白質的溶解性,并抑制酶的活性[17-18]。DTT是一種很強的還原劑,可以保持蛋白質中-SH的還原態,對于活性中心含有-SH的酶有保護作用,同時防止體系內氧化類物質氧化作用對酶的影響。但是DTT的作用是還原cys上被氧化的SH,可以把二硫橋拆開,影響蛋白質三級構象,從而影響酶的活性[19-20]。

因此以磷酸緩沖液pH、離子強度以及EDTA添加量和DTT的添加量作為單因素,研究不同因素水平下對白鰱魚肌肉LOX提取的影響,然后選取合適的因素水平,得到白鰱魚肌肉LOX提取的最佳條件,以LOX酶活、酶液濃度作為實驗指標。

固定離心速率為10000×g、60 min,分別設定pH為6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6,離子強度為0、25、50、75、100 mmol/L,EDTA和DTT濃度均為0、1、2、4、8 mmol/L;離心后上清液在4 ℃下收集無水硫酸銨20%～40%飽和度組分,然后重溶于磷酸鹽緩沖液(50 mmol/L,pH7.4),得到白鰱魚肌肉LOX酶液,對其酶活、濃度測定,研究不同單因素對白鰱魚肌肉LOX提取的影響。

白鰱魚肌肉LOX提取工藝流程圖：新鮮白鏈魚→手工采集背部肌肉→加入磷酸鹽緩沖液攪碎勻漿→冷凍離心→加入無水硫酸氨收集20%～40%飽和組分→沉淀重溶于磷酸鹽緩沖液→粗酶液

1.3.2 白鰱魚肌肉LOX酶學特性 對白鰱魚肌肉LOX的貯藏穩定性、熱穩定性、pH穩定性進行研究;貯藏穩定性:將酶液分別在常溫(25±3) ℃下貯藏1～7 d,熱穩定性:在4、20、30、40、50、60、70、80、90、100 ℃下分別恒溫水浴加熱20 min；pH穩定性:將LOX分別溶于6.6、7.0、7.4、7.8、8.2、8.6的磷酸緩沖液(50 mmol/L)中,分別測定其酶活、二級構象、三級構象變化,研究白鰱魚肌肉LOX酶學性質。

1.4 數據統計分析

每組實驗進行三組平行實驗,所有數據采用Microsoft Excel進行整理分析,測定結果以平均值±標準差表示,圓二色譜圖和熒光光譜圖采用Origin9.0作圖軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 白鰱魚肌肉LOX提取條件優化

2.1.1 磷酸鹽緩沖液pH對白鰱魚肌肉LOX提取的影響 由圖1可知,其在pH7.8提取條件下酶活最高,當pH7.4～pH8.2之間時,LOX酶液濃度較高,說明此時緩沖液pH偏離白鰱魚肌肉LOX等電點,LOX酶液較為穩定。酸性條件不利于白鰱魚肌肉LOX的提取。因此得出白鰱魚肌肉的適宜提取pH為7.8。

圖1 磷酸鹽緩沖液pH對白鰱魚肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.1 The influence of phosphate buffer pH on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

2.1.2 磷酸鹽緩沖液離子強度對白鰱魚肌肉LOX提取的影響 由圖2可知,當離子強度低于50 mmol/L時,隨著緩沖液離子強度的增加,鹽析作用逐漸增強,酶液濃度不斷增大,酶活也逐漸升高;當離子強度大于50 mmol/L時,鹽析作用進一步增強,酶液濃度不斷增大,但酶活保持在較高水平,變化較小,此時會有部分雜蛋白被提取到酶液中,影響酶液純度,因此LOX提取緩沖液適宜的離子強度為50 mmol/L。

圖2 離子強度對白鰱魚肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.2 The influence of phosphate buffer lonic strength on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

2.1.3 EDTA和DTT添加量對白鰱魚肌肉LOX提取的影響 由圖3可知,當EDTA濃度低于2 mmol/L時,酶活呈上升趨勢,當濃度在2～8 mmol/L時,酶活變化較小,呈略微下降趨勢;DTT濃度為2 mmol/L時,酶活最高,大于2 mmol/L時,酶活明顯降低。由于EDTA和DTT濃度均較小,所以對LOX酶液濃度影響較小,無決定作用。因此,白鰱魚肌肉LOX提取適宜的EDTA和DTT濃度均為2 mmol/L。

圖3 EDTA、DTT添加量對白鰱魚肌肉LOX酶活、濃度的影響Fig.3 The influence of added amount of EDTA, DTT on the activity,concentration of silver carp muscle LOX

在最優提取條件磷酸緩沖液pH7.8、離子強度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L下,白鰱魚肌肉LOX酶活為(244.44±5.93) U、酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL。

2.2 白鰱魚肌肉LOX酶學特性研究

2.2.1 白鰱魚肌肉LOX貯藏穩定性 將白鰱魚肌肉LOX酶液在常溫條件下放置1～7 d,每天對LOX進行酶活、CD光譜、熒光光譜測定,結果如圖4～圖6所示。

由圖4可知,隨著時間增加,LOX酶活不斷降低,在0～2 d時,下降趨勢比較小,2 d過后,急劇下降,6 d時,基本完全失活。

圖4 貯藏時間對白鰱魚肌肉LOX酶活的影響Fig.4 The influence of storage time on the activity of silver carp muscle LOX

圓二色譜光譜法(CD)作為分析蛋白質二級結構最常用簡便的方法,可以有效分析計算白鰱魚肌肉LOX的α-螺旋和β-折疊等各組分的含量,進一步研究白鰱魚肌肉LOX在不同條件下的二級構象變化[21]。蛋白質二級結構中主要的光活性基團是肽鏈骨架中的肽鍵,一般認為α-螺旋特征吸收峰在208 nm和222 nm左右,其在208 nm處橢圓率能夠反映蛋白質α-螺旋結構變化;典型β-折疊在214 nm左右有一特征吸收負峰;無規則卷曲在220 nm左右有一小而寬的正峰[22-23]。由圖5可知,LOX的CD光譜在208 nm和222 nm處均有明顯的負峰,在214 nm處有一負峰,還在220 nm左右有一很微弱正峰,說明白鰱魚肌肉LOX中包含有α-螺旋、β-折疊、無規則卷曲等蛋白質二級結構;隨著貯藏時間增加,LOX的CD光譜在208 nm處的負峰和214 nm處的負峰強度都有所下降,在2 d以后下降尤為明顯,說明LOX在貯藏過程中二級結構不斷變化,在0～2 d,二級結構相對較穩定,2 d以后變化較大。

圖5 貯藏時間對白鰱魚肌肉LOX二級構象的影響Fig.5 The influence of storage time on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖6 貯藏時間對白鰱魚肌肉LOX三級構象的影響Fig.6 The influence of storage time on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

在295 nm激發波長下,含有芳香族氨基酸殘基如色氨酸(tryptophan,Trp)、酪氨酸(tyrosine,Tyr)和苯丙氨酸(phenylalanine,Phe)殘基的蛋白質會產生熒光,稱為內源性熒光。其中Trp的熒光強度最大,因而內源熒光分析的主要對象為Trp,通常被用來研究蛋白質的三級結構[24-25]。圖6是常溫下貯藏不同時間的LOX內源熒光光譜圖,在344 nm處有很強的Trp熒光峰,隨著貯藏時間的增加熒光峰形狀及出峰未知無變化,但貯藏時間增加后,熒光強度受到很大影響,這與LOX中Trp所處的微環境有很大關系;隨著時間增加,Trp的熒光強度不斷增強,說明LOX中的Trp因為蛋白質三級結構的改變不斷由分子內部非極性環境逐漸暴露在分子外部極性環境中,因此可以說明,隨著時間的推移,LOX的三級結構發生明顯變化。

圖7 不同溫度對白鰱魚肌肉LOX酶活的影響Fig.7 The influence of temperatures on the activity of silver carp muscle LOX

2.2.2 白鰱魚肌肉LOX熱穩定性 由圖7可知,LOX在4～40 ℃時,隨著溫度升高,脂肪氧合酶的溶解度增大,分散度上升,增加了脂肪氧合酶的活化分子數,與底物的親和力也逐漸增強,酶活也逐漸增大;40 ℃時酶活最高,當溫度大于40 ℃時,高溫導致脂肪氧合酶變性,在酶液中的溶解度降低,分散度下降,使酶活迅速降低,70 ℃基本完全失活。圖8為白鰱魚肌肉LOX經不同溫度處理后CD光譜圖。由圖8可知,在4～40 ℃時,208 nm和214 nm處負峰均呈微弱變化,40 ℃以后,208 nm和214 nm處負峰強度急劇降低,至70 ℃以后,208 nm和214 nm特征吸收峰基本消失;因此說明在4～40 ℃之間,LOX二級結構呈微弱變化,40 ℃以后,LOX二級結構被嚴重破壞,α-螺旋、β-折疊含量急劇下降,70 ℃后,LOX中α-螺旋、β-折疊已基本被完全破壞,LOX完全失活。圖9為白鰱魚肌肉LOX經不同溫度處理后熒光光譜圖。當溫度低于40 ℃時,Trp熒光強度變化較小,說明此時蛋白質中Trp仍處在分子內非極性環境中,LOX的三級構象相對穩定;高于40 ℃時,Trp熒光強度快速增強,說明此時分子內Trp暴露在外部極性環境中,LOX的三級構象破壞,因此可知LOX在溫度低于40 ℃的條件下,能保持較高的活性。

圖8 不同溫度對白鰱魚肌肉LOX二級構象的影響Fig.8 The influence of temperatures on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖9 不同溫度對白鰱魚肌肉LOX三級構象的影響Fig.9 The influence of temperatures on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

2.2.3 白鰱魚肌肉LOX pH穩定性 結果如圖10～圖12所示。

圖10 不同pH對白鰱魚肌肉LOX酶活的影響Fig.10 The influence of different pH on the activity of silver carp muscle LOX

圖11 不同pH對白鰱魚肌肉LOX二級構象的影響Fig.11 The influence of different pH on the secondary conformation of silver carp muscle LOX

圖12 不同pH對白鰱魚肌肉LOX三級構象的影響Fig.12 The influence of different pH on the tertiary conformation of silver carp muscle LOX

由圖10可知,當緩沖液過酸或者過堿時,都會使脂肪氧合酶分子側鏈上極性基團的狀態改變,分子活性中心結構變化,發生變性失活,影響底物與脂肪氧合酶之間的結合與解離,進而影響酶的活性,因此當pH小于7.4或者大于7.8時,酶活都會明顯受到抑制。圖11為白鰱魚肌肉LOX在不同pH條件下CD光譜圖。由圖11可知,白鰱魚肌肉LOX在不同pH條件下的CD光譜變化較小,呈微弱變化趨勢,在pH7.8時208 nm和214 nm處負峰強度最大,pH6.6時最小;因此說明,不同pH對白鰱魚肌肉LOX二級結構變化影響較小,pH的變化不會造成LOX中α-螺旋、β-折疊含量出現較大變化。圖12為白鰱魚肌肉LOX在不同pH條件下熒光光譜圖。當pH為7.8時,Trp熒光強度最小,說明此時蛋白質中Trp仍處在分子內非極性環境中,LOX的三級構象相對穩定,因此可以得到pH7.8為LOX的最適pH。

3 結論

白鰱魚中LOX對白鰱魚魚腥味生成至關重要,因此針對白鰱魚體內LOX的研究對于白鰱魚產業特別是白鰱加工的發展很有意義。本文得到白鰱魚LOX的最優提取條件為磷酸緩沖液pH7.8、離子強度50 mmol/L、EDTA和DTT添加量均為2 mmol/L,此時白鰱魚肌肉LOX酶活為(244.44±5.93) U、酶液濃度為(1.98±0.037) mg/mL。通過對LOX酶學性質研究可知,白鰱魚肌肉LOX最適pH為7.8,最適溫度為40 ℃,在常溫和低溫環境中仍保持較高酶活,常溫條件下0～2 d內較為穩定。

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Optimization of lipoxygenase extraction conditions in silver carp muscle and the study on its enzymatic properties

WANG Bang-guo,LIN Lin,YU Zhen-yu,LI Yang,JIANG Shao-tong*

(Institute of Agricultural Processing,School of Food Science and Engineering,Key Laboratory for Agriculture Processing Product of Anhui Province,Hefei University of Technology,Hefei 230009,China)

The extraction process and enzymatic properties of Lipoxygenase(LOX)from silver carp muscle were evaluated. The extraction conditions of LOX were optimized by single-factor experiment and the storage stability,thermal stability,optimum pH of LOX were studied by circular dichroism and fluorescence spectroscopy. The effects of pH,ionic strength and the addition of EDTA,DTT on the enzyme activity and concentration of LOX were studied respectively. The results showed that the suitable extraction condition parameters were:pH7.8,ionic strength 50 mmol/L,EDTA 2 mmol/L and DTT 2 mmol/L,the enzyme concentration of LOX was(1.98±0.037) mg/mL and the activity was (244.44±5.93) U under that condition. Our present work showed that the enzyme activity of LOX was stable within 0～2 d under room temperature,the optimum pH was 7.8 and the optimum temperature was 40 ℃.

silver carp;lipoxygenase;extraction conditions;enzymatic properties

2016-10-08

王幫國(1992-)，男，碩士，研究方向：農產品加工，E-mail： wang_bangguo@163.com。

*通訊作者:姜紹通(1954-)，男，碩士，教授，研究方向：農產品加工，E-mail：jstxsgj@163.com。

安徽省重點實驗室項目(JZ2014AKSY0401)。

TS254.1

A

1002-0306(2017)09-0113-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.013