樺樹葉黃酮提取物對人臍靜脈內皮細胞抗氧化活性的研究

劉 玥,苗欣宇,文連奎

(吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

樺樹葉黃酮提取物對人臍靜脈內皮細胞抗氧化活性的研究

劉 玥,苗欣宇,文連奎*

(吉林農業大學食品科學與工程學院,吉林長春 130118)

本實驗對白樺葉黃酮提取物是否具有體外抗氧化作用以及是否能夠預防HUVEC(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,人臍靜脈內皮細胞)細胞的氧化損傷進行了研究。通過測定白樺葉黃酮提取物清除DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基、還原能力以及培養細胞SOD、GSH-PX活力、T-AOC總抗氧化能力,研究白樺葉黃酮提取物的體外抗自由基作用和對細胞損傷的預防作用。實驗結果表明:白樺葉黃酮提取物濃度為0.20 mg/mL時,DPPH自由基清除率為86.89%;濃度為0.18 mg/mL時,ABTS自由基清除率為96.26%;黃酮提取物濃度為1.9 mg/mL時,羥基自由基清除率為71.18%。當白樺葉黃酮提取物濃度為10 μg/mL時可極顯著增強細胞的SOD活力、GSH-PX活力以及提高細胞中活性氧水平和總的抗氧化能力(p<0.01)。實驗結果表明白樺葉黃酮提取物具有明顯的抗自由基作用和預防細胞氧化損傷作用。

樺樹葉,黃酮提取物,體外抗氧化,HUVEC

白樺(Betula platyphylla Suk.)系樺木科樺屬喬木,產于東北、華北、河南、陜西、寧夏、甘肅、青海、四川、云南、西藏東南部。適應性強,分布廣[1]。葉厚紙質,三角狀卵形,三角狀菱形,三角形,少有菱狀卵形和寬卵形,葉片中含有黃酮類、三萜皂苷類和酚酸類物質,具有利尿作用[2]。

黃酮類化合物是在植物中分布廣泛的一類化合物,它存在于高等植物及羊齒植物的根、莖、葉、花、果實等中,不僅數量種類繁多,而且結構類型復雜多樣[3]。研究表明黃酮類化合物具有良好的生物活性功能,如抗病毒、抗菌、抗腫瘤、抗疲勞、以及清除自由基和抗氧化的作用[4]。

目前對于白樺葉的研究主要在精油的抑菌和抗氧化方面,王素娟等人對白樺葉的化學成分進行了分析,從白樺葉中分離得到了9個化合物,并根據理化性質和波譜數據確定了相應的成分[5];段曉玲等人對白樺葉精油的抑菌和抗氧化的活性成分進行研究,通過氣相色譜-質譜(GC-MS)法分析其揮發性化學成分[6]。而有關白樺葉中黃酮類化合物的體外抗氧化作用還未見報道。本實驗研究白樺葉黃酮提取物的抗氧化作用,為其藥理研究以及相關產品研發提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

樺樹葉黃酮提取物(實驗室自制:采用超聲波法提取、NKA-9大孔吸附樹脂純化,經蘆丁標準曲線法測定黃酮類化合物含量為68.5%)。HUVEC細胞株 上海中喬新舟生物科技有限公司；無水乙醇(分析純) 天津市富宇精細化工有限公司；95%乙醇(分析純)、甲醇(分析純)、濃鹽酸(分析純) 北京化工廠；FeCl3(分析純)、TCA(三氯乙酸)、氫氧化鈉(分析純) 天津市博迪化工股份有限公司； 硝酸鋁(分析純) 天津市致遠化學試劑有限公司； K2S2O8(分析純) 西隴化工股份有限公司；KH2PO4(分析純)、Na2HPO4(分析純)、NaH2PO4(分析純)、Na2EDTA(分析純) 天津市北晨方正試劑廠； 抗壞血酸(VC)、鐵氰化鉀(分析純)二叔丁基對甲酚 Aladdin(阿拉丁)；H2O2(分析純) 天津市福晨化學試劑廠；TBA(硫代巴比妥酸) 上海展云化工有限公司； DPPH 南京奧多福尼生物科技有限公司；ABTS、PBS溶液 天津市瑞金特化學品有限公司；DMSO(分析純) 天津市恒興化學試劑制造有限公司；1640培養基 Hyclone；胎牛血清(500 mL)MTT(噻唑蘭)Sigma(分)蘆丁標準品 酷爾化學科技(北京)有限公司；NKA-9大孔吸附樹脂 天津市光復精細化工研究所；T-AOC試劑盒 南京建成生物工程研究所；GSH-PX試劑盒、SOD試劑盒 南京建成生物工程研究所。

pH計 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;高速離心機 Eppendorf公司;T6新世紀紫外可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司;酶標儀 Thermo Scientific公司;CO2培養箱 Thermo Scientific公司;倒置顯微鏡 上海波愛姆光學儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 DPPH自由基清除實驗 采用李熙燦教授方法[7],部分有改動。取2.5 mg DPPH定容至60 mL無水乙醇中,超聲溶解5 min,測定吸光值,A值范圍在1.2～1.3之間。將樣品以及陽性對照品VC、BHT用無水乙醇配制成濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20 mg/mL的溶液。取DPPH溶液2 mL加入試管中,加入1 mL無水乙醇充分混合,在519 nm測定吸光值為A0。取DPPH溶液2 mL加入試管中,加入樣品液0.5 mL,無水乙醇0.5 mL,避光靜置30 min后測定吸光值為A。每次測量A值時需要重新測定相應的A0。

式(1)

式(1)中:A0空白組吸光值;A為樣品組及陽性對照組吸光值。

1.2.2ABTS自由基清除實驗 采用李熙燦教授方法[8],部分有改動。配制好的ABTS儲備液放置黑暗室溫12h備用。將ABTS儲備液用無水乙醇稀釋50倍,測定吸光值,范圍在0.7±0.02,此溶液為ABTS+工作液。取上述1.6mLABTS+工作液與0.4mL無水乙醇充分混合,靜置6min后,測得A值為A0。取1.6mLABTS+工作液與0.4mL樣品溶液充分混合,靜置6min后,測得A值為A。

式(2)

式(2)中:A0空白組吸光值;A為樣品組及陽性對照組吸光值。

1.2.3 羥基自由基清除能力 采用李熙燦教授方法[9],部分有改動。樣品和BHT選用固體1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mg。取0.2mol/L緩沖液2mL加入固體樣品中,混合均勻,依次加入50mmol/L脫氧核糖250μL,1mmol/LNa2EDTA250μL,3.2mmol/LFeCl3250μL,50mmol/LH2O2250μL,1.8mmol/L抗壞血酸250μL,50 ℃水浴加熱20min后,依次加入10%TCA500μL,5%TBA150μL,105 ℃加熱15min,在530nm條件下測定吸光值。A0為無樣品添加組,A為樣品添加組。

式(3)

式(3)中:A0空白組吸光值;A為樣品組及陽性對照組吸光值。

1.2.4 還原能力測定 將樣品以及陽性對照品VC、BHT用無水乙醇配制成濃度為0.02,0.04,0.06,0.08,0.10,0.12,0.14,0.16,0.18,0.20mg/mL的溶液。取樣品溶液1.0mL,加入PBS2.5mL、1%鐵氰化鉀2.5mL,將上述溶液混合均勻后50 ℃水浴加熱20min后,加入10%三氯乙酸2.5mL,3000r/min離心10min,精密吸取上清液2.5mL,加入蒸餾水2.5mL、0.1%FeCl30.5mL,在700nm處測定吸光度[10]。

1.2.5HUVEC細胞抗氧化實驗

1.2.5.1 細胞的復蘇 從液氮罐中取出凍存管,在37 ℃水浴中迅速融化,1000r/min離心10min,棄去上清液,加入3mL10%胎牛血清的1640細胞培養液,吹打成懸浮液后轉移至細胞培養瓶[11]。

1.2.5.2 細胞的傳代 步驟一,棄去培養瓶中培養液,在瓶中滴加2mLPBS,輕輕搖晃后小心棄去;步驟二,加入2mL胰酶,37 ℃培養箱恒溫培養2min,在顯微鏡下觀看細胞形態,如果細胞撐圓鼓脹且不成片聚集,即刻加入10%胎牛血清的1640細胞培養液5mL終止消化。步驟三,吹打成懸浮液,1000r/min離心5min后棄去培養液,加入10%胎牛血清的1640細胞培養液3mL,以每個培養瓶1.5mL的量均勻分至兩個細胞培養瓶中,37 ℃培養箱恒溫培養[12]。

1.2.5.3 細胞的凍存 步驟一、步驟二同細胞的傳代;步驟三,吹打成懸浮液,1000r/min離心5min后棄去培養液,加入凍存液,分至凍存管中,采用梯度降溫法,4 ℃冰箱降溫30min,-20 ℃冰箱降溫2h直至完全凍實,然后放置于-80 ℃冰箱過夜,次日轉移至液氮罐中凍存[13]。

1.2.5.4MTT毒理實驗 將樣品溶液按照終濃度為0.5、2.5、5、10、25、50、100、250μg/mL配制成8個梯度;收集對數期細胞制備成細胞懸浮液,在96孔板中37 ℃培養24h;待孔板底部長滿細胞后,棄去培養液,無血清路線培養4h;空白組后續不加任何試劑;不加AngⅡ組加入黃酮樣品液后培養24h;加AngⅡ組加入黃酮樣品液后培養18h,加入AngII培養6h;以上兩組每孔加入MTT后,繼續培養4h;小心棄去培養液后,每孔加入DMSO終止培養,將孔板置于搖床低速振蕩10min,使結晶充分溶解。在490nm處用酶標儀測定吸光值,篩選出低、中、高三個濃度組[14]。

1.2.5.5SOD、GSH-PX、T-AOC試劑盒實驗 選用已篩選出的三個濃度組進行實驗。步驟一同細胞的傳代;步驟二,加入2mL胰酶,37 ℃培養箱恒溫培養2min,加入含10% 胎牛血清的1640細胞培養液13～14mL終止消化;步驟三,吹打細胞成懸浮液,以每孔1mL的量轉移至十二孔板中,過夜培養至細胞長滿孔板底部;步驟四,小心吸取培養液后,無血清培養路線培養4h;步驟五,空白對照組加入黃酮樣本培養24h,預防組加入黃酮樣本培養18h;步驟六,預防組加入AngII培養6h[15]。步驟七,預防組和空白對照組均棄去培養液加入胰酶消化1min后,加入無血清1640培養液轉移至EP管中,-20 ℃儲存,用于SOD、GSH-PX、T-AOC的測定。

1.4 數據分析

各實驗組數據用SPSS22.0作單因素方差分析和LSD均數間多重比較。

2 結果與分析

2.1DPPH自由基清除實驗結果

從圖1中可以看出,樣品組隨著溶液濃度的增加,清除率呈遞增趨勢,在0.20mg/mL時,最大清除率達到86.89%,說明樺樹葉黃酮具有良好的清除DPPH自由基能力。

圖1 樺樹葉黃酮對DPPH自由基的清除作用Fig.1 DPPH radical scavenging activities of flavonoids from birch leaves

2.2 ABTS自由基清除實驗結果

從圖2中可以看出,黃酮提取物溶液具有良好清除ABTS自由基能力,隨著濃度增加,其抗氧化能力呈上升趨勢,當濃度達到0.18 mg/mL時達到最大清除率96.26%,與陽性對照品清除率十分接近,證明有良好的清除ABTS自由基能力。

圖2 樺樹葉黃酮對ABTS自由基的清除作用Fig. 2 ABTS radical scavenging activities of flavonoids from birch leaves

2.3 羥基自由基清除實驗結果

由圖3可以看出,黃酮樣品的清除率高于陽性對照品BHT,在使用量為1.9 mg/mL時,清除率達到71.18%,而BHT清除率為50.50%。具有良好的清除羥基自由基效果。

圖3 樺樹葉黃酮對羥基自由基的清除作用Fig.3 Hydroxyl free radical scavenging activities of flavonoids from birch leaves

2.4 還原能力實驗結果

由圖4可見,黃酮提取物溶液的還原能力隨著濃度的增大,有緩慢的遞增趨勢,變化并不明顯。

圖4 樺樹葉黃酮的還原能力Fig.4 Reducing power of flavonoids from birch leaves

2.5 MTT毒理實驗結果

如圖5(無ANGⅡ損傷對照組)所示,空白組隨著溶液濃度的增加呈遞增趨勢,當溶液濃度為5 μg/mL時,與空白組呈顯著差異;當溶液濃度為10、25 μg/mL時,與空白組呈極顯著差異(p<0.01),并且在濃度為10 μg/mL時吸光度達到峰值,此時細胞活力最高,而當濃度繼續增高時,吸光度下降,此時已超出細胞所能融合的最大黃酮濃度,細胞活力降低,呈高濃度抑制現象。同樣,在圖6(含ANGⅡ損傷對照組)中,ANGⅡ預防組在10 μg/mL時吸光度達到峰值,而當濃度繼續增高時,吸光度下降,這表明溶液濃度繼續增高對細胞的活力有抑制作用,預防損傷的能力降低。綜合以上實驗結果,選取最優濃度10 μg/mL為中濃度組,5 μg/mL為低濃度組,25 μg/mL為高濃度組。

圖5 MTT毒理實驗Fig.5 Results of determined by MTT toxicology experiment注:*p<0.05;**p<0.01表示與空白組相比有顯著、極顯著差異,圖6同。

圖6 MTT毒理實驗Fig.6 Results of determined by MTT toxicology experiment

2.6 T-AOC、SOD、GSH-Px試劑盒實驗

2.6.1 T-AOC試劑盒實驗結果 機體防御體系的抗氧化能力的強弱與健康程度存在著密切聯系,該防御體系有酶促與非酶促兩個體系,許多酶是以微量元素為活性中心,非酶促反應體系中主要為維生素、氨基酸和金屬蛋白質。機體中有許多抗氧化物質,能使Fe3+還原成Fe2+,后者可與菲啉類物質形成穩固的絡合物,通過比色可測出其抗氧化能力的高低[17]。如圖7所示,預防組和空白組的低、中、高濃度組均與ANGⅡ對照組和空白對照組呈高度顯著差異(p<0.01),其中中濃度組抗氧化能力優于低濃度組與高濃度組,與陽性對照VC組抗氧化能力接近,結果表明樺樹葉黃酮提取物的添加能夠顯著增加細胞的總抗氧化能力,中濃度組效果最佳。

圖7 樺樹葉總黃酮對HUVEC總的抗氧化能力的影響Fig.7 Effects of total flavonoids from birch leaves on T-AOC of HUVEC注:圖中*為實驗組與空白組之間的差異顯著性, *:p<0.05,**:p<0.01;#為實驗組與ANGⅡ組之間的差異顯著性,#:p<0.05,##:p<0.01,圖8、圖9同。

2.6.2 SOD試劑盒實驗結果 SOD是一種源于生命體的活性物質,能消除生物體在新陳代謝過程中的有害物質,對人體能夠起到抗衰老的作用[18]。如圖8所示,預防組與空白組均與空白對照組和ANGⅡ組呈高度顯著差異(p<0.01),其中預防組中濃度組活力遠優于低濃度組和高濃度組,空白組實驗結果相同,其中空白對照組和預防組的低濃度組均低于空白組但高于ANGⅡ組,表明在SOD實驗中低濃度已經不能提高細胞SOD活力,但黃酮提取物的添加仍然可以一定程度的預防細胞氧化損傷。這表明樺樹葉黃酮提取物有良好的清除氧自由基、提升細胞中SOD活力的功能。

圖8 樺樹葉總黃酮對HUVEC中SOD的影響Fig.8 Effects of total flavonoids from birch leaves on SOD of HUVEC

2.6.3 GSH-Px試劑盒實驗結果 谷胱甘肽過氧化物酶是機體內廣泛存在的一種重要的催化過氧化氫分解的酶。它特異的催化還原型谷胱甘肽(GSH)對過氧化氫的還原反應,可以起到保護細胞膜結構和功能完整的作用[19]。如圖9所示,除預防組低濃度組與空白組無顯著差異外,其余均與空白組有高度顯著差異(p<0.01),高濃度組的GSH-Px活力要優于中濃度組。這與前三組試劑盒實驗結果有所不同,高濃度并沒有產生對細胞活力的抑制作用。

圖9 樺樹葉總黃酮對HUVEC中GSH-Px的影響Fig.9 Effects of total flavonoids from birch leaves on GSH-PX of HUVEC

3 討論與結論

由于人體需要經常與外界進行接觸,例如呼吸、放射線照射、污染物等,導致人體體內會不斷的產生自由基,科學研究表明過量的自由基堆積會導致癌癥、衰老等疾病。SOD、GSH-Px是生物體內非常重要的抗氧化酶,可以有效的清除體內自由基,有十分重要的機體抗氧化損傷作用[20]。

本實驗過程中,應用原料為實驗室自制樺樹葉黃酮提取物,并沒有分析提取物中的黃酮組分,在GSH-Px試劑盒實驗中,呈現出了高濃度組在預防損傷組、空白組明顯優于中濃度組,并沒有呈現出高濃度抑制細胞活力,這與其他三組試劑盒實驗有所不同,原因可能是粗提物中的不同黃酮化合物對酶的生理活性有所影響從而導致細胞活力的增加,建議對黃酮提取物中具體的黃酮組分進行研究。

實驗結果表明,當樺樹葉黃酮提取物濃度為0.20 mg/mL時,DPPH自由基清除率為86.89%;濃度為0.18 mg/mL時,ABTS自由基清除率為96.26%;濃度為1.9 mg/mL時,羥基自由基清除率為71.18%。當白樺葉黃酮提取物濃度為10 μg/mL時可極顯著(p<0.01)增強細胞的SOD活力、GSH-Px活力和總的抗氧化能力,可以有效的預防HUVEC氧化損傷，這說明樺樹葉黃酮提取物是良好的自由基清除劑。

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Study on the influence of flavonoid extracts from brich leaves on antioxidant activity of human umbilical vein endothelial cells

LIU Yue,MIAO Xin-yu,WEN Lian-kui*

(Jilin Agriculture University,College of Food Science and Technology,Changchun 130118,China)

This paper is to identify the anti-oxidative effectinvitroof the birch leaf flavonoids and their preventive effects on HUVEC cells from oxidative damages. Experiments are performed to determine the capabilities of the birch leaf flavonoids to eliminate the DPPH radicals,hydroxyl radicals and ABTS radicals,and their reductive activity as well as the cellular SOD,GSH-PX activities,and T-AOC were measured in order to prove that the birch leaf flavonoids are capable of resisting the radicalsinvitroand preventing the cellular damages. Results demonstrated the birch leaf flavonoids(0.20 mg/mL)could scavenge the DPPH radicals by 86.89%,ABTS radical by 96.26% at 0.18 mg/mL,and the hydroxyl radicals fall by 50.50% in presence of 1.9 mg/mL flavonoids. The cellular SOD,GSH-PX and T-AOC were significantly enhanced by the 10 μg/mL flavonoids(p<0.01). It’s concluded that the birch leaf flavonoids markedly scavenge(free)radicals and prevent cells from oxidative damages.

birch leaf;flavonoids;invitroantioxidation;human umbilical vein endothelial cell(HUVEC)

2016-10-28

劉玥(1991-)，女，碩士研究生，研究方向：果蔬貯藏加工工程,E-mail：8577aimishi@sina.com。

*通訊作者:文連奎(1962-)，博士，教授，研究方向：長白山野生植物資源開發利用,E-mail：wenliankui@163.com。

TS201.2

A

1002-0306(2017)09-0082-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.007