羧甲基果聚糖的膠原肽修飾及其活性研究

曾 艷,張 穎,門 燕,孫媛霞

(中國科學院天津工業生物技術研究所,天津 300308)

羧甲基果聚糖的膠原肽修飾及其活性研究

曾 艷,張 穎,門 燕,孫媛霞*

(中國科學院天津工業生物技術研究所,天津 300308)

為考察羧甲基果聚糖及其衍生物在功能性食品、生物醫學及化妝品方面的應用可行性,通過羧基與氨基的交聯反應制備了膠原肽修飾的羧甲基果聚糖,并測試了產物的抗氧化、吸濕保濕活性以及其對人皮角質HaCaT細胞生長增殖的影響。發現羧甲基果聚糖經膠原肽修飾后抗氧化性明顯提高,25 mg/mL時的ABTS+·清除率為62.31%,比修飾前提高了6.11倍。盡管膠原肽的引入會對吸濕保濕性造成影響,修飾后的羧甲基果聚糖仍然保留良好的吸濕保濕性能。在相對濕度43%和81%中放置72 h的吸濕率分別為11.96%和21.54%,在干燥硅膠環境中放置72 h的保濕率為60.48%。此外,修飾產物在0～1 mg/mL的濃度范圍內無細胞毒性,可以促進HaCaT細胞增殖。HaCaT細胞在0.5 mg/mL修飾產物刺激下的存活率為124.2%。膠原肽修飾能提高羧甲基果聚糖的生物活性,拓展其在功能性食品、醫藥制品和化妝品上的應用潛力。

羧甲基果聚糖,膠原肽,化學修飾,抗氧化性,吸濕保濕活性,細胞增殖

由于多糖的活性直接或間接地受其分子結構影響,而化學官能團在糖鏈上的引入,對多糖的生物活性與理化功能提升具有積極作用,因此,化學修飾是多糖構效關系研究和多糖類藥物研制的重要手段[1]。其中,羧甲基化修飾不僅能有效改善多糖的水溶性、乳化性、抗氧化性和抗腫瘤能力等理化性質,還具有成本低、操作簡單及生成物毒性小等優點,在多糖的化學修飾中得到廣泛應用,如羧甲基纖維素已作為增稠劑用于食品和藥劑配方中[2]。

作為膠原蛋白的酶解產物,膠原肽在保留膠原蛋白有關特性如參與細胞遷移分化增殖、生物相容性良好等的同時,還兼具分子量小、更容易被人體吸收的優點[3]。國外期刊報道表明,通過共價鍵在多糖骨架上引入膠原肽形成的交聯產物,其水溶性、抗氧化性、吸濕保濕性良好,能促進皮膚成纖維細胞增殖,在保健食品、化妝品、醫藥衛生等領域顯現出良好的應用潛力[4-6]。然而,關于膠原肽修飾多糖的國內研究報道甚少,相關工作有待進一步深入。

本實驗以解淀粉芽孢桿菌PB6高產胞外果聚糖[7]為原料,通過羧基化修飾在果聚糖骨架上引入羧基后,進一步借助羧基與氨基的交聯反應,制備膠原肽修飾的羧甲基果聚糖;并對膠原肽修飾的羧甲基果聚糖的抗氧化、保濕吸濕活性以及其對皮膚角質細胞增殖影響進行測試,探討其在功能性食品、醫藥制品和化妝品方面的應用可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)、N-羥基硫代琥珀酰亞胺鈉鹽(NHS)、2-嗎啉乙磺酸(MES) 分析純,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;氫氧化鈉、氯乙酸、碳酸鉀、硫酸銨、熒光素鈉、硫酸亞鐵二甲基亞砜(DMSO) 分析純,國藥試劑化學試劑有限公司;2,2-聯氮基雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽(2,2-Azinobis(3-ehtylbenzothiazolin-6-sulfnicAcid)Diammonium Salt,ABTS)、2,2′-偶氮二(2-甲基丙基咪)二鹽酸鹽(2,2′-azobis(2-methylpropionamidine)dihydrochloride,AAPH)、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪(2,4,6-tris(2-pyridyl)-s-triazine,TPTZ) 分析純,美國Sigma-Aldirch公司;膠原肽 以鱈魚皮為原料實驗室自制[8],分子量分布400～1500 Da;果聚糖 由實驗室借助解淀粉芽孢桿菌發酵生產自制[7];人皮膚永生化角質細胞(HaCaT細胞;KCB200442YJ) 北京北納創聯生物技術研究院;雙抗(Penicillin/Streptomycin)、0.25% 胰蛋白酶 美國Corning 公司;DMEM 高糖基礎培養基、胎牛血清(FBS) 美國Gibco公司。

UV-1800紫外分光光度計 日本島津公司;Spectra Max M5多功能酶標儀 美國Molecular Devices公司;Sorvall Evolution RC高速落地離心機 美國Thermo Scientific公司;IKA RV10旋轉蒸發儀 德國IKA集團;SHZ-D(Ⅲ)循環水式真空泵 河南省予華儀器有限公司;FD-1-50真空冷凍干燥機 北京博醫康實驗儀器有限公司;VERTEX70型傅里葉變換紅外光譜儀 德國Bruker公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 羧甲基果聚糖的制備 參考Liu等的方法[9],取2 g果聚糖溶于80 mL異丙醇中,逐步滴入30 mL的20% NaOH溶液,常溫攪拌1 h后加入4 g氯乙酸,60 ℃下攪拌4 h,調pH至中性,將混合物轉移至8000～10000 Da的透析袋中,去離子水透析4 d 后,收集透析液,冷凍干燥后得到白色固體,即為羧甲基果聚糖。

1.2.2 羧甲基果聚糖的膠原肽修飾 取1.2 g羧甲基果聚糖溶于0.2 mol/L的MES緩沖液(100 mL,pH6.5)中,加入0.76 g的EDC試劑和0.24 g的NHS試劑,常溫攪拌20 h后,迅速加入0.9 g膠原肽,繼續攪拌10 min,調節體系pH到6,透析72 h,濃縮冷凍干燥。得到的白色固體即為膠原肽修飾的羧甲基果聚糖。

1.2.3 取代度測試 根據Fan等方法計算取代度,其中取代度定義為羧甲基果聚糖中每個重復結構單元中羧甲基被膠原肽取代的數目[10]。在1～30 mg/L濃度下,膠原肽在200 nm的紫外吸收值與其濃度成正比,其濃度-紫外吸收標準曲線見式(1)。以羧甲基果聚糖為空白對照,測定30 mg/L膠原肽修飾羧甲基果聚糖產物在200 nm的紫外吸收,通過式(1)計算折算其膠原肽的當量濃度,再根據式(2)計算取代度DS。

A=38.03C-0.0007

式(1)

式(2)

1.2.4 紅外光譜檢測 稱取干燥后的樣品2 mg與150 mg 的KBr混合研磨后壓片,上機掃描分析,掃描范圍400～4000 cm-1。

1.2.5 抗氧化性測試 通過ABTS+·清除能力、氧自由基清除能力和鐵還原能力實驗測試抗氧化性。

1.2.5.1 ABTS+·清除能力測定 采用張換等[11]的方法測定樣品對ABTS+·的清除能力。將ABTS+·(7 mmol/L,5 mL)和過硫酸鉀溶液(140 mmol/L,88 μL)混合,室溫避光反應12～16 h,制備ABTS+·儲備液。使用磷酸鹽緩沖液(10 mmol/L,pH7.4)將儲備液稀釋至其在734 nm波長處吸光度(A)為0.70±0.02。取100 μL不同質量濃度(0～25 mg/mL)的待測樣品水溶液,加入3 mL 的ABTS+·溶液,避光反應6 min,記錄其在734 nm波長處的吸光度為A樣品。以100 μL純水代替樣品,相同操作,記錄其在734 nm波長處的吸光度為A空白。按式(3)計算樣品清除ABTS+·的清除率。

式(3)

1.2.5.2 氧自由基清除能力測定(oxygen radical absorbance capacity,ORAC) 采用Yan Zeng等[12]的方法,使用Spectra Max M5多功能酶標儀進行測試。于96孔板微孔中加入熒光素鈉鹽(70 nmol/L,120 μL)和20 μL待測樣品,在37 ℃條件下孵育10 min,迅速加入AAPH(12.8 mmol/L,60 μL)后,每隔1 min測量樣品在485 nm激發條件下,528 nm處熒光發射的強度變化。以水溶性的VE衍生物Trolox(終濃度:1～8 μmol/L)替代不同質量濃度(0.5～10 mg/mL)的樣品水溶液,同板同時操作,用于繪制標準曲線。測定時間為90 min,各樣品不同時間的熒光強度分別記為F0、F1、F2…F90。其中,F0為0 min時的熒光值,Fn為第n min的熒光值。按式(4)計算樣品熒光變化零階矩曲線下面積(areaunder curve,AUC)。

式(4)

根據標準曲線方程式(5)計算樣品對應的Trolox濃度,即ORAC值,以mmol Trolox/g表示。

AUC=5.298C+30.291R2=0.9984

式(5)

式(5)中,C為Trolox濃度(μmol/L)。

1.2.5.3 鐵離子還原能力測定(ferric reducing antioxidant power,FRAP) 采用張穎等[1]的方法測試鐵離子還原能力。配制新鮮FRAP反應液:300 mmol/L乙酸鈉緩沖液(pH3.6),10 mmol/L的TPTZ溶液(40 mmol/L HCl為溶劑)以及20 mmol/L的FeCl3溶液,三者以體積比10∶1∶1混合后,于37 ℃水浴保溫。取100 μL樣品溶液與3 mL鐵還原(FRAP)試劑混勻后于37 ℃水浴中反應5 min,測定體系在593 nm的吸光值A。同時取濃度0～1.0 mmol/L的FeSO4溶液替代樣品反應繪制標準曲線。通過標準曲線方程式(6)計算樣品對應的FeSO4濃度,即FRAP值,以μmol Fe2+/g表示。

A=0.4148C+0.0489R2=0.9995

式(6)

式(6)中,C為Fe2+濃度(mmol/L)。

1.2.6 吸濕保濕性測試 參考Ping Shao等[13]的方法,在室溫20 ℃下進行吸濕保濕性測定。

1.2.6.1 吸濕性測試 準確稱取0.5 g在100 ℃下干燥4 h的樣品,分別置于以碳酸鉀飽和溶液維持相對濕度43%和以硫酸銨飽和溶液維持相對濕度81%的干燥器中,間隔一定時間稱量放置前的樣品質量(W0)和放置后的樣品質量(Wn),根據式(7)計算吸濕率:

式(7)

1.2.6.2 保濕性測試 準確稱取0.5g在100 ℃下干燥4h的樣品,加入樣品10%質量分數的水分,置于裝有干燥變色硅膠的干燥器中,間隔一定時間稱量樣品放置前的水分質量(H0)和放置后的水分質量(Hn),根據式(8)計算保濕率:

式(8)

1.2.7 皮膚成纖維細胞生長增殖測試 參考陳俊等[14]的方法,進行皮膚成纖維細胞生長和增殖測試實驗。

1.2.7.1 細胞培養 人皮角質HaCaT細胞置于DMEM培養液(含10%FBS與1%雙抗)中,于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱培養,每隔2～3d換一次培養液,待細胞融合率達90%時,用0.25%胰蛋白酶消化,并進行傳代培養,取對數期生長狀態良好的細胞進行細胞活力測試。

1.2.7.2 細胞活力測試HaCaT細胞以6×103個/孔密度接種于96孔板,于37 ℃、5%CO2飽和濕度孵育箱培養24h后,使用含0、0.05、0.1、0.5、1.0mg/mL樣品的DMEM培養液(含10%FBS與1%雙抗)等體積地取代原培養液(200μL),繼續培養48h。棄去培養液,每孔加入10μL的MTT溶液(終濃度為0.5mg/mL),繼續孵育4h后,4500r/min離心10min,棄去上清,加入150μLDMSO,溶解活細胞與MTT生成的甲臜,震蕩10min,利用酶標儀測試各孔在490nm的吸光值A。按式(9)計算細胞活力:

式(9)

1.2.8 數據處理方法 測試結果以平均值±標準偏差表示,并采用SPSS 19.0統計學軟件進行單因素方差兩兩比較分析,p<0.05時有統計學差異。

2 結果與分析

2.1 結構表征

膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(COP-CP)的紅外光譜見圖1。羧甲基果聚糖CP除具有多糖類的紅外特征吸收峰(如3421 cm-1的O-H伸縮振動吸收峰與2937 cm-1的C-H伸縮振動吸收峰)外,還在1601 cm-1出現羧基基團的C-O 伸縮振動吸收峰,在1412 cm-1處出現與羧基相連的-CH2-的剪式振動吸收峰,說明-CH2COO-基團被成功引入到果聚糖上[15]。而膠原肽修飾羧甲基果聚糖的產物,在保有羧甲基果聚糖的紅外特征吸收峰外,還出現了可在膠原肽紅外光譜中觀察到的1654 cm-1與1546 cm-1處酰胺基和伯胺基伸展振動峰,這一結果與Fan等報道一致[10],說明羧甲基果聚糖被膠原肽成功修飾。

圖1 膠原肽修飾羧甲基果聚糖的傅里葉紅外光譜表征Fig.1 FT-IR analysis of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides

電位滴定實驗[16]測定羧甲基果聚糖中的羧甲基取代度為0.289。通過測試羧甲基果聚糖在膠原肽修飾前后的200 nm紫外吸收變化,計算出膠原肽在羧甲基果聚糖修飾中的取代度為0.0374,這說明有12.94%的羧甲基官能團被膠原肽完全取代。考慮到不同多糖在同一反應條件下的化學修飾程度不同,雖然實驗中的羧甲基果聚糖制備及后續的膠原肽修飾均參考相關文獻的最優條件進行,推測反應參數的后期優化仍然可以調整修飾產物中膠原肽取代羧甲基的比例,從而對修飾后的羧甲基果聚糖的功能活性造成影響。

2.2 抗氧化性

作為多糖的重要生物學活性之一,多糖的抗氧化性及其作用機理在功能食品與藥品開發上倍受關注,相關研究日趨廣泛和深入。有研究表明羧甲基化修飾不能確保多糖的抗氧化性提高,甚至可能造成相反效果[17]。與此報道結果類似,本實驗中的解淀粉芽孢桿菌果聚糖經羧甲基化修飾后,抗氧化能力基本沒有變化(果聚糖數據未給出)。而膠原肽的引入會明顯提高羧甲基果聚糖的抗氧化能力。

如圖2所示,隨樣品濃度的增加,膠原肽修飾的羧甲基果聚糖對ABTS+·的清除能力也在不斷增強,兩者呈劑量關系。在25 mg/mL下,膠原肽修飾的羧甲基果聚糖對ABTS+·的清除率為62.31%,比修飾前提高了6.11倍。除ABTS+·的清除能力有顯著提高(p<0.05)外,膠原肽修飾后的羧甲基果聚糖氧自由基清除能力ORAC值與鐵離子還原能力FRAP值也顯著提高,分別增長了3.02倍和40%(p<0.05)。不同來源膠原肽的抗氧化活性有所不同。如賈建萍等報道鱈魚皮膠原肽具有較強的清除ABTS+·的能力,而驢皮膠原肽具有較強的還原力[18]。由于本實驗中的膠原肽來源于鱈魚皮,因此其提高羧甲基果聚糖的鐵還原能力效果有限。后期可以針對羧甲基果聚糖修飾產物的抗氧化性具體要求,對不同來源的膠原肽進行篩選,從中選擇合適的原料修飾羧甲基果聚糖。

圖2 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產物對ABTS+·的清除率Fig.2 ABTS+·radical scavenging ability of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides 注:使用不同小寫字母標記同一濃度下不同樣品測試值的顯著差異(p<0.05),圖4同。

表1 膠原肽修飾羧甲基果聚糖的氧自由基清除能力ORAC值與鐵離子還原能力FRAP值

注：使用不同字母標記測試值的顯著差異(p<0.05)。

2.3 吸濕保濕性

由于吸濕保濕劑具有防止水分損失的作用,經常用于果餞和焙烤食品中。除此之外,吸濕保濕劑還有助于皮膚角質層在干燥的空氣中保持正常水分(質量分數為:10%～20%),防止皮膚因水分不足而產生皺裂、粗糙等。本實驗以甘油(glycerol)為對照,測試了膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)的吸濕和保濕能力。

如圖3a所示,在飽和K2CO3(相對濕度43%)低濕環境下,COP、CP-COP、CP和glycerol在實驗24 h的吸濕率分別為9.37%、11.03%、14.24%和15.71%,各樣品吸濕率的差異顯著(p<0.05)。之后,除對照glycerol的吸濕能力隨時間延長繼續增強外,其余樣品的吸濕率幾乎保持不變。樣品的吸濕性大小順序為:glycerol>CP>CP-COP>COP，其中CP-CPO在放置72 h的吸濕率為11.96%。但值得注意的是,在測試前期12 h內CP的吸濕速率和效果均要優于glycerol,而CP-COP的吸濕速效與glycerol持衡。樣品在飽和(NH4)2SO4(相對濕度81%)高濕環境中的吸濕率變化如圖3b所示,隨時間延長,COP、CP和CP-COP的吸濕率增大,在36 h基本達到平臺期。而對照glycerol的吸濕率在測試時間內一直保持穩定增加。樣品在36 h的吸濕性大小順序依舊為:glycerol(36.16%)>CP(24.08%)>CP-COP(21.35%)>COP(21.22%)。然而CP-COP與CP、COP在吸濕率上的差異并不顯著(p>0.05)，其中CP-COP在放置72 h的吸濕率為21.54%。說明與低濕環境相比,CP、CP-COP和COP三者在高濕環境中的吸濕能力差異變小。此外,COP、CP和CP-COP的在低濕與高濕環境下的吸濕能力均高于報道的擬目烏賊生殖腺堿提多糖以及常規保濕劑聚乙二醇6000、殼聚糖[19]。

圖3 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產物在不同濕度環境下的吸濕保濕性能Fig.3 The moisture absorption and moisture retention abilities of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides under different humidity environment注:(a)RH 43%濕度環境,(b)RH 81%濕度環境,(c)干燥環境;使用不同小寫字母標記同一時間下不同樣品測試值的顯著差異(p<0.05)。

在變色硅膠維持的無水干燥條件下,各樣品的保濕率均有減小(圖3c)。其中,COP、CP和CP-COP的保濕率下降趨勢在36 h后趨于飽和,而對照glycerol的保濕率仍隨時間延長明顯降低。在72 h時glycerol、COP、CP-COP和CP的保濕率分別為32.09%、47.76%、60.48%和66.55%,其中,CP-COP與CP的保濕率無顯著差異(p>0.05)。這說明膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)均具有較強的保濕能力,其保濕效果不僅優于對照甘油,也高于報道的羅耳阿太菌胞外多糖[20]和紅棗水解多糖[21]。

羧甲基果聚糖經膠原肽修飾后,雖然抗氧化能力明顯提高,但吸濕、保濕性能有所下降。這是因為被膠原肽修飾后,羧甲基果聚糖中能與水形成氫鍵、穩定結合的極性羧基官能團的數目在減少。實驗中膠原肽對羧甲基官能團的取代度為12.94%,其相應修飾產物在吸濕、保濕性能上的變化明顯小于在抗氧化性上的變化。說明膠原肽修飾對羧甲基果聚糖的影響主要表現在抗氧化性上,而通過控制膠原肽修飾的反應條件,可以調控羧甲基果聚糖衍生產物在抗氧化性與吸濕、保濕性能之間的協衡關系。

2.4 對皮膚成纖維細胞生長和增殖影響

角質細胞作為真皮內主要的修復細胞,對皮膚適度的自我代謝有重要作用,其增殖生長對于維持皮膚的正常結構和生理功能具有重要意義。如白曉智等發現,白芷活性提取物濃度為0.05～0.5 mg/mL時,均能促進人角質形成HaCaT細胞增殖,抑制其凋亡,有利于皮膚創面愈合[22]。本實驗使用MTT法考察膠原肽(COP)、羧甲基果聚糖(CP)和膠原肽修飾的羧甲基果聚糖(CP-COP)對人皮膚角質細胞(HaCaT細胞)生長影響,結果如圖4所示。在0～1 mg/mL濃度范圍內,COP、CP和CP-COP不僅無明顯毒性,還可以促進HaCaT細胞增殖,具有較好的生物相容性。其中,COP與CP-COP在0～0.5 mg/mL的促進細胞增殖能力與其濃度呈劑量關系。在0.5 mg/mL下,COP、CP-COP兩者與CP的促增殖效果存在顯著差異(p<0.05),三者作用下的HaCaT細胞存活率分別為128.7%、124.2%與111.9%。說明膠原肽修飾能增強羧甲基果聚糖促進人皮膚角質細胞增殖的效果,更有利于其在皮膚修復方面的生物活性提升。此外,本實驗中膠原肽修飾羧甲基果聚糖對HaCaT細胞增殖的促進效果與張鑫等報道類似。其發現林蛙皮多肽質量濃度為50～3000 mg/L時,對HaCaT細胞均有顯著性促進增殖的作用。在50～800 mg/L范圍內,隨著多肽質量濃度的升高,活性多肽對HaCaT細胞的促進增殖作用呈現劑量依賴效應[23]。

圖4 膠原肽修飾羧甲基果聚糖產物對HaCat細胞增殖的影響Fig.4 Effect of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides on theproliferation of HaCat cells

3 結論

膠原肽對羧甲基果聚糖的修飾,能大幅度提高羧甲基果聚糖的抗氧化性。不僅如此,修飾產物還保留了良好的保濕吸濕活性,與皮膚親合性好,對細胞無毒性,能有效促進人皮角質細胞增殖。基于上述特性,膠原肽修飾能提高羧甲基果聚糖應用于功能性食品、醫藥制品和化妝品上的潛力。

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Preparation and characterization of carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides

ZENG Yan,ZHANG Ying,MEN Yan,SUN Yuan-xia*

(Tianjin Institute of Industrial Biotechnology,Chinese Academy of Sciences,Tianjin 300308,China)

To investigate the possible application of carboxymethylatedlevan and its derivative on functional food,cosmetics and medicine,collagen peptides were used to modify carboxymethylated levan through the cross-linking reaction between carboxyl group and amino group. Moreover,the antioxidant activity and the moisture absorption and retention capacities of the modified product,as well as its effect on the viability of human skin keratinocyte cells(HaCaT cells)were evaluated. After modified withcollagen peptides,the antioxidant activity of carboxymethylatedlevan was obviously improved. The scavenging rate of the product on ABTS+· was 6.11 times higher than that before modification,with the scavenging rate of 62.31% at 25 mg/mL. Though collagen peptides had some negative effect on the moisture absorption and retention capacities of the product,its modified carboxymethylatedlevan still had good moisture absorption and retention capacities. The moisture-absorbing rate of the product under the relative humidity of 43% and 81% was 11.96% and 21.54% at 72 h,respectively. The moisture retention capacity after desiccation in the silica gel chamber for 72 h was 60.48%. Furthermore,carboxymethylatedlevan modified with collagen peptides showed no cytotoxicity in the concentration of 0～1 mg/mL and could promote the proliferation of HaCaT cells. Under the stimulation of the modified product at 0.5 mg/mL,the cell viability of HaCaT cells reached 124.2%. The results showed that the modification with collagen peptides could improve the bioactivity of carboxymethylatedlevan,and extend its potential application on functional food,medicine and cosmetics.

carboxymethylatedlevan;collagen peptides;chemical modification;antioxidant activity;moisture absorption and retention capacities;cell viability

2016-12-08

曾艷(1982-)，女，博士，副研究員，研究方向：天然功能活性物質開發，E-mail：zeng_y@tib.cas.cn。

*通訊作者:孫媛霞(1963-)，女，博士，研究員，研究方向：功能糖與天然活性物質，E-mail:sun_yx@tib.cas.cn。

863計劃(2013AA102105；2014AA022108)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)09-0049-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.09.001