胃促生長素對人主動脈平滑肌細胞增殖及線粒體融合蛋白2表達的影響

何永銘,宋明寶△,胡建波,張源萍,李佑美

(第三軍醫大學新橋醫院心血管內科，重慶 400037)

胃促生長素對人主動脈平滑肌細胞增殖及線粒體融合蛋白2表達的影響

何永銘1,宋明寶1△,胡建波1,張源萍1,李佑美1

(第三軍醫大學新橋醫院心血管內科，重慶 400037)

目的 通過體外培養人主動脈平滑肌細胞(HASMCs)，研究胃促生長素(ghrelin)對血管平滑肌細胞(VSMC)增殖及線粒體融合蛋白2(Mfn-2)表達的影響。 方法 體外培養HASMCs，第4～6代細胞用于試驗。給予不同濃度(10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)的ghrelin 或10-6mol/L ghrelin不同時間(0、6、12、18、24 h)處理，用四甲基偶氮唑藍比色(MMT)法觀察其對HASMC增殖的影響。RT-PCR，Western blot方法檢測不同處理方法對Mfn-2表達的影響。結果 10-7～10-5mol/L的ghrelin可明顯抑制HASMC增殖，濃度為10-6mol/L抑制作用最為明顯 (P<0.01)。ghrelin在6～24 h內均能明顯抑制HASMC增殖，在24 h達最高峰 (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin能明顯上調Mfn-2 mRNA和蛋白的表達 (P<0.01)。10-6mol/L ghrelin在18 h上調Mfn-2 mRNA和蛋白表達的作用最為明顯 (P<0.01)。結論 ghrelin可能通過上調Mfn-2的表達來抑制HASMC增殖。

胃促生長素；肌，平滑，血管；主動脈；人主動脈平滑肌細胞；增殖；線粒體融合蛋白-2

血管平滑肌細胞(VSMC)增殖過度并向內膜下遷移是血管增殖性疾病的主要發病機制。胃促生長素(ghrelin)是90年代發現的生長激素促分泌素受體(GHSR)的內源性配體。研究發現，ghrelin除具有促生長激素釋放功能外，還具有心臟保護功能，抑制炎癥反應及炎癥相關的小鼠結腸癌變[1-4]，保護血管內皮功能[5]等作用,而轉錄因子核轉錄因子kappa B(NF-κB)、Nkx2.2可調控人類ghrelin的啟動子活性[6]；還有研究發現，女性外周血中ghrelin的水平與頸動脈內膜的厚度呈負相關[7-8]，推測ghrelin可能對動脈再狹窄有抑制作用。線粒體融合蛋白2(Mitofusin 2，Mfn-2)又命名為增殖抑制基因,它被發現于1997年，因能夠抑制VSMC增殖而得名。Mfn-2能抑制大鼠頸動脈球囊損傷后誘導的再狹窄[9]，而Mfn-2缺陷通過干擾細胞自噬來抑制細胞增殖[10]。本文擬通過體外培養HASMCs，研究ghrelin對VSMC增殖及Mfn-2表達的影響，探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗材料 人主動脈平滑肌細胞(human aortic smooth muscle cells，HASMCs)購自美國Sciencell公司。

1.1.2 試驗儀器 熒光倒置顯微鏡(Olympus公司，美國)，凝膠成像分析系統(UVP公司，美國)，酶聯免疫檢測儀(Bio-Rad公司，美國)，PCR儀(Bio-Rad公司，美國)。

1.1.3 試驗試劑 ghrelin(Sigma公司，美國)，胎牛血清(Sciencell公司，美國)，SMCM培養基(Sciencell公司，美國)，四甲基偶氮唑藍比色(MTT)試劑盒(江蘇碧云天生物公司)；大鼠抗人Mfn-2單克隆抗體(Santa Cruz公司，美國),大鼠抗人GAPDH多克隆抗體(Santa Cruz公司，美國),辣根過氧化物酶標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗(江蘇碧云天生物公司)；逆轉錄試劑盒、PCR試劑盒(TAKARA公司，日本)。

1.2 方法

1.2.1 HASMCs培養及試驗分組 HASMCs在含20.00%胎牛血清的SMCM培養基中于37 ℃、5.00%CO2條件下培養，細胞生長達80.00%融合后，用0.25%胰蛋白酶消化，以1∶2比例進行傳代。取第4～6代呈對數生長的HASMCs細胞接種于培養瓶中，待細胞生長至80.00%融合，無血清培養基繼續培養24 h，更換為試驗用液。分為空白對照組(0 mol/L ghrelin),不同濃度ghrelin組(藥物終濃度分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L),不同時間組(10-6mol/L ghrelin,0、6、12、18、24 h)。

1.2.2 細胞增殖活力檢測(MTT法) 以5×103/孔的密度接種于96孔板內，37 ℃、5.0%CO2飽和濕度培養箱中靜置培養24 h。在細胞約80.0%融合狀態下，96孔板中的HASMCs換上含0.2% BSA的DMEM培養基培養24 h后，換以含0.2% BSA的含藥培養基，孵育48 h后換上MTT液100 μL，繼續孵育4 h，然后將培養基吸干，每孔加入200 μL二甲基亞砜，混勻后于酶標儀570 nm處測光密度(OD)值，以檢測細胞的數目和活力。

1.2.3 逆轉錄PCR(RT-PCR)法檢測Mfn-2的表達 收集處理完畢后的6孔板中的細胞，用4 ℃預冷PBS(0.01 mol/L，pH7.2～7.3)洗3遍，加入1 mL TRizol溶液裂解，按TRizol試劑盒使用說明書提取總RNA，以DNA/RNA測定儀測定RNA的濃度和純度。將2 μL總RNA加入到20 μL體系中按逆轉錄合成試劑盒使用說明書合成cDNA待用。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)作為內參照。Mfn-2目的片段為2 271 bp，引物序列為：5′-ATG TCC CTG CTC TTC TCT CGA TGC-3′(上游)和5′-TCT GCT GGG CTG CAG GTA CTG GT-3′(下游)；GAPDH引物序列：5′-GAA GGT GAA GGT CGG AGT C-3′(上游)和5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT TC-3′(下游)。PCR條件94 ℃ 4 min；94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃ 90 s，共32個循環；再72 ℃延伸10 min。PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳并在紫外光下顯像。

1.2.4 Western blot法檢測 制作10%的分離膠和5%積層膠進行蛋白電泳，通過電轉移法將蛋白轉到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含3%血清的TBS-T封閉1 h，分別加入3%血清的TBS-T稀釋的1∶3 000鼠抗人Mfn-2單克隆抗體一抗4 ℃孵育過夜，再同結合辣根過氧化物酶的二抗孵育1 h，用化學發光試劑盒檢測結果，采用GAPDH作為內參照。

2 結 果

2.1 HASMCs形態學觀察 培養的第4～6代人HASMCs在顯微鏡下觀察可見呈典型“峰-谷”狀生長。細胞形體多呈長梭形，核大，可見明顯的肌絲纖維，見圖1。

A:典型“峰-谷”狀生長(×40);B:細胞形體多呈長梭形、核大(×100)。

圖1 HASMCs形態學觀察

2.2 ghrelin對HASMC增殖的影響 與空白對照組相比，ghrelin在10-7～10-5mol/L濃度范圍內均可抑制HASMC增殖，其中以10-6mol/L ghrelin抑制增殖的作用最為明顯，10-6mol/L ghrelin組與空白對照組OD值比較：(45.74±4.78)%vs.(91.48±6.85)%，差異有統計學意義(P<0.01)。與0 h組相比，ghrelin在6～24 h均可抑制HASMC增殖，24 h達到高峰[36.22±0.81)%vs.(57.28±0.99)%，P<0.01]，見圖2。

A:不同濃度ghrelin對HASMC的增殖作用；B：不同時間ghrelin(10-6mol/L)對HASMC的增殖作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較。#：P<0.05，與10-6mol/L組比較;△:P<0.05，與0 h比較。

圖2 ghrelin對HASMC增殖的影響

2.3 ghrelin對Mfn-2 mRNA表達的影響 對照組Mfn-2 mRNA為1.0。10-7～10-5mol/L的ghrelin均能明顯上調Mfn-2 mRNA的表達(10-7、10-6、10-5mol/L ghrelin 分別為：2.44±0.55、2.70±0.45和2.71±0.46，P<0.05)。10-6mol/L ghrelin在12～24 h內能明顯上調Mfn-2 mRNA的表達，18 h達最高峰(4.48±1.57，P<0.01)，但在6 h，ghrelin對Mfn-2 mRNA的表達無明顯影響(P>0.05)，見圖3。

A:不同濃度ghrelin對Mfn-2 mRNA的作用；B：不同時間ghrelin對Mfn-2 mRNA的作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較。#：P<0.05，與10-6mol/L組比較;△:P<0.05，與0 h比較。

圖3 ghrelin對Mfn-2 mRNA表達的影響

A:不同濃度ghrelin對Mfn-2蛋白的作用；B：不同時間ghrelin對Mfn-2蛋白的作用。*：P<0.05，與0 mol/L比較;#:P<0.05，與0 h比較。

圖4 ghrelin對Mfn-2蛋白表達的影響

2.4 ghrelin對Mfn-2蛋白表達的影響 對照組Mfn-2 蛋白為1.0。10-8～10-5mol/L濃度的ghrelin均能上調Mfn-2蛋白的表達，在10-6mol/L ghrelin達最高峰(2.46±0.11，P<0.01)。而10-9mol/L濃度的ghrelin對Mfn-2蛋白表達無影響(P>0.05)。ghrelin在12～24 h內能明顯上調Mfn-2蛋白的表達，18 h達最高峰(2.18±0.03，P<0.01)。而18 h和24 h之間蛋白表達比較差異無統計學意義(P>0.05)，見圖4。

3 討 論

動脈粥樣硬化、高血壓、支架內再狹窄等血管增殖性疾病的發病率逐年增加。目前已證實，VSMC增殖-凋亡失衡是此類疾病的主要特征。抑制VSMC增殖，有望成為預防和治療血管增殖性疾病新的方法。

ghrelin是1999年Kojima等[11]發現的一種可促進生長激素釋放的酰化肽。近年研究發現，ghrelin具有廣泛的生理作用，且與心血管疾病、免疫炎癥反應、糖尿病、腫瘤等密切相關。研究認為ghrelin是一個心臟保護因子，可以抑制血管內皮細胞凋亡，促進血管內皮細胞的增殖[12]，具有血管內皮保護功能，但對血管平滑肌的作用目前仍不清楚。本研究結果顯示， ghrelin能抑制HASMC增殖且能促進血管內皮細胞的增殖，推測其對動脈再狹窄有抑制作用。

Mfn-2是具有抑制VSMC增殖功能的基因，參與血管平滑肌細胞分化，有望成為血管增殖性疾病干預的新靶點[13]。研究發現，在大鼠頸動脈球囊損傷再狹窄模型上，適度上調Mfn-2的表達可以明顯抑制VSMC增殖，抑制率分別為97.2%和82.0%[14]，Mfn-2在控制細胞增殖中起重要作用。

本課題組發現在HASMCs，ghrelin上調Mfn-2 mRNA和蛋白的表達和其抑制HASMC增殖的作用在濃度和時間上基本上是一致的，也就是說ghrelin在上調Mfn-2的表達的同時能明顯抑制HASMC增殖。這提示，ghrelin可能通過上調Mfn-2的表達來抑制HASMC增殖。進一步探討ghrelin在心血管疾病發病過程中的作用及機制，可為心血管疾病的防治提供新的靶點。

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Effect of ghrelin on proliferation and mitofusin-2 expression of human aortic smooth muscle cells

HeYongming1,SongMingbao1△,HuJianbo1,ZhangYuanping1,LiYoumei1

(DepartmentofCardiology,XinqiaoHospitalofThirdMedicalMilitaryUniversity,Chongqing400037,China)

Objective To investigate the effects of ghrelin on proliferation of vascular smooth muscle cells (VSMC) and the expression of mitochondrial fusion 2 (Mfn-2) in cultured human aortic smooth muscle cells (HASMCs).Methods HASMCs were cultured in vitro，treated with different concentrations(10-9，10-8，10-7，10-6，10-5mol/L)ghrelin or 10-6mol/L ghrelin for different time(0，6，12，18，24 h).Subconfluent HASMCs at passage 4-6 were used in experiments.MTT essay was used to investigate the effect on proliferation of HASMCs.RT-PCR and Western blot were used to analyse the expression of Mfn-2.Results 10-7-10-5mol/L ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs,and the inhibitory effect of concentration of 10-6mol/L was the most obvious(P<0.01).Ghrelin inhibited the proliferation of HASMCs in 6-24 h，and it reached the peak at 24 h(P<0.01).10-6mol/L ghrelin significantly increased the expression of Mfn-2 mRNA and protein(P<0.01).The up-regulation of 10-6mol/L ghrelin on Mfn-2 mRNA and protein expression reached the peak at 18 h(P<0.01).Conclusion Ghrelin might inhibit the proliferation of HASMC by up-regulating the expression of Mfn-2.

ghrelin；muscle,smooth,vascular；aorta;human aortic smooth muscle cells；proliferation;mitofusin 2

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.006

何永銘(1976-)，主治醫師，本科，主要從事冠心病臨床與基礎方面研究。△

,E-mail：smb0939@163.com。

R543.1

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1671-8348(2017)15-2034-03

2016-11-26

2017-01-14)