甲狀腺激素T3對大鼠腦缺血再灌注損傷后NGF和BDNF表達的影響研究*

竇 超，張 敏，趙源征，郭亞培，吳世陶，劉恒方

(鄭州大學第五附屬醫院神經內科，鄭州 450000)

甲狀腺激素T3對大鼠腦缺血再灌注損傷后NGF和BDNF表達的影響研究*

竇 超，張 敏，趙源征，郭亞培，吳世陶，劉恒方△

(鄭州大學第五附屬醫院神經內科，鄭州 450000)

目的 探討甲狀腺激素T3對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用及機制。方法 雄性SD大鼠分為假手術+生理鹽水組、假手術+T3組、大腦中動脈栓塞(MCAO)+生理鹽水組、MCAO+T3組。應用MCAO法建立大鼠腦缺血再灌注損傷模型，分別于缺血后1 h及再灌注后6 h給予腹腔注射甲狀腺激素10 μg/100 g，生理鹽水為安慰劑。再灌注24 h后，觀察不同組別大鼠神經功能損傷情況，梗死體積變化，以及缺血側腦皮質中神經生長因子(NGF)和腦源性神經營養因子(BDNF)的mRNA及蛋白表達水平變化。結果 與MCAO+生理鹽水組比較，MCAO+T3組大鼠神經功能缺損表現減輕，腦梗死體積減小，NGF、BDNF的mRNA和蛋白表達上升(P<0.05)。結論 甲狀腺激素對大鼠腦缺血再灌注損傷有神經保護作用，其機制與增加腦缺血再灌注損傷中NGF、BDNF的表達相關。

腦缺血；再灌注損傷；甲狀腺激素類；神經生長因子；神經保護作用；腦源性神經營養因子

缺血性腦血管病是目前威脅人類健康與生存的主要疾病之一。及時恢復腦組織血液供應是修復腦組織損傷的最佳辦法，但缺血后血流再通又可能導致缺血再灌注損傷，因此減輕再灌注損傷并促進腦缺血后神經功能恢復已成為目前研究熱點之一[1]。研究發現，腦缺血后，神經生長因子(nerve growth factor，NGF)和腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)水平增加，通過激活不同的信號系統，促進受損神經元再生及分化，改善神經元的病理狀態[2-3]。甲狀腺激素在嬰幼兒神經系統發育成熟的過程中至關重要[4]。近年來，人們發現其對成年甚至老年期中樞神經系統亦有至關重要的作用[5-6]。Mendes-De-Aguiard等[7]將甲狀腺激素T3加入培養的膠質細胞中發現，T3可增加其對抗高濃度谷氨酸毒性的能力，并增加與膠質細胞共培養神經元的存活率，可見T3對培養的神經元有保護作用。但對T3在腦缺血再灌注損傷中的作用研究較少。本實驗通過研究T3對腦缺血再灌注大鼠腦組織中NGF和BDNF表達的影響，探討T3對腦缺血再灌注損傷是否存在保護作用及其機制，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 SPF級成年SD大鼠32只，雄性，8周，體質量250～280 g，由鄭州大學實驗動物中心提供。

1.1.2 主要試劑 T3購自美國Sigma公司；兔抗神經生長因子抗體(anti-NGF)和兔抗腦源性神經營養因子抗體(anti-BDNF)購自英國abcam公司；兔抗β-actin抗體、辣根過氧化物酶(HRP)標記山羊抗兔二抗購自美國CST公司；Trizol購自美國Invitrogen公司；NGF、BDNF及β-肌動蛋白(β-actin)引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；Western blot相關試劑購自中國博士德公司；HotStarTaq Master Mix試劑盒購自德國Qiagen公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒購自加拿大Abm公司；紅四氮唑(TTC)購自美國Sigma公司；其余試劑為國產分析純試劑。

1.1.3 主要儀器 Nonodrop超微量分光光度計和CL31.1R低溫超速離心機購自美國Thermo公司；普通/梯度PCR儀購自德國Eppendorf公司；DYY-6C水平電泳儀購自北京市六一儀器廠；Mini-PROTEAN Tetra蛋白垂直電泳儀購自美國BIO-RAD公司；Amersham Imager 600化學發光成像系統購自美國GE公司。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥 將32只SD大鼠分為4組，每組8只。分別為：假手術+生理鹽水組、假手術+T3組、大腦中動脈栓塞(MCAO)+生理鹽水組、MCAO+T3組。分別于缺血后1 h及再灌注后6 h腹腔注射T3 10 μg/100 g，以及等量生理鹽水。

1.2.2 大鼠腦缺血再灌注模型制備 根據改良的Longa法通過MCAO制備腦缺血再灌注損傷模型[8]。大鼠用10%水合氯醛(30 mg/100 g)腹腔注射麻醉，仰臥位固定，常規消毒，頸部正中切口。分離右側頸總、頸外及頸內動脈，結扎頸總及頸外動脈，頸內動脈遠心端用動脈夾夾閉后，在頸總動脈分叉距頸內動脈0.5 cm處作1個切口，將尼龍線導入頸內動脈，插入線栓深度約為(18.0±0.5)mm，感到輕微阻力時立即停止插線。縫合傷口，留置線頭于體外，2 h后將線栓提至頸總動脈內，完成再灌注。假手術各組采用相同的手術步驟，但不插入線栓。術后將室溫控制在22～25 ℃，將動物置于放有清潔墊料的鼠籠中，自由進食、水。

1.2.3 大鼠神經功能評分 參照Longa等[8]的5分制評分標準進行神經行為學評分：(1)無神經功能缺失癥狀、活動正常者，0分；(2)不能完全伸展左側前爪，1分；(3)動物爬行時出現向左轉圈(追尾現象)，2分；(4)身體向左側傾倒者，3分；(5)不能自發行走，意識喪失者，4分。評分為0分和4分者均被剔除，神經功能評價在再灌注后24 h取材前進行。

1.2.4 2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色梗死體積測量 神經行為學評分完成后，斷頭取腦，-20 ℃速凍30 min，從額極后2 mm處行連續冠狀切片，厚2 mm。將切片放入2%TTC溶液中，37 ℃避光染色30 min后，用4%多聚甲醛固定24 h后拍照，正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區呈蒼白色。采用圖像分析系統計算梗死面積，將各腦片的梗死面積與厚度的乘積進行累加，獲得梗死體積。

1.2.5 RT-PCR技術

1.2.5.1 引物設計 根據大鼠基因組序列設計引物，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，見表1。

1.2.5.2 RT-PCR 取缺血側皮層腦組織置于1.5 mL RNA-free EP管中，利用TRIzol法提取總RNA，紫外分光光度計測定RNA水平，采用TaqMan Reverse Transcription Reagents試劑盒將mRNA反轉錄成cDNA。取反轉錄產物采用HotStarTaq Master Mix試劑盒進行PCR反應擴增目的基因。所有PCR擴增產物均進行瓊脂糖凝膠電泳，以β-actin為內參照，觀測其表達水平變化。

1.2.6 Western blot檢測 取缺血側皮層腦組織，置于組織勻漿器中，加入適量RIPA蛋白提取裂解液，置于冰上低溫勻漿裂解。裂解完全后，將裂解液移至1.5 mL EP管中，12 000 r/min，4 ℃離心10 min，取上清液，置于-80 ℃保存。二喹啉甲酸 (BCA)試劑盒測定蛋白濃度后，按相同蛋白濃度等量體積依次上樣。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白后，轉移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，然后用5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，之后4 ℃過夜孵育特異性兔抗NGF(1∶1 000)、兔抗BDNF(1∶1 000)、兔抗β-actin(1∶1 000)、TBST洗膜3次后，HRP標記山羊抗兔二抗(1：1 000)室溫孵育1 h后，電化學發光(ECL)顯色，Amersham Imager 600化學發光成像系統成像。以β-actin為內參，用Image J圖像處理系統分析蛋白條帶的相對灰度值，觀測不同組別目的蛋白表達水平變化。

2 結 果

2.1 T3對腦缺血再灌注大鼠神經行為學評分的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后，假手術+生理鹽水組和假手術+T3組均無神經功能缺損表現，Longa評分0分；MCAO+生理鹽水組大鼠可見明顯的左側偏癱樣表現，左側追尾，軀體向左側傾倒，Longa評分(2.71±0.56)分，明顯高于假手術各組(P<0.05)；MCAO+T3組神經功能缺損表現減輕，Longa評分(1.63±0.58)分，較MCAO+生理鹽水組降低(P<0.05)。

2.2 T3對腦缺血再灌注大鼠腦梗死體積的影響 大鼠腦缺血再灌注損傷24 h后，假手術+生理鹽水組和假手術+T3組TTC染色呈均勻橘紅色，無缺血梗死灶。MCAO+生理鹽水組和MCAO+T3組腦組織均有不同程度的缺血梗死，TTC染色可見梗死灶成白色，周邊組織呈橘紅色。與MCAO+生理鹽水組[(45.12±2.32)%]相比，[MCAO+T3組(26.36±1.04)%]大鼠的腦梗死體積百分比減少(P<0.05)，見圖1。

A:MCAO+生理鹽水組;B：MCAO+T3組。

圖1 腦缺血再灌注大鼠腦組織TTC染色

2.3 T3對腦缺血再灌注大鼠腦組織NGF和BDNF mRNA表達水平的影響 與假手術+生理鹽水組和假手術+T3組相比，MCAO+生理鹽水組大鼠NGF和BDNF mRNA水平均增加(P<0.05)；而與MCAO+生理鹽水組相比，MCAO+T3組大鼠NGF和BDNF mRNA水平進一步升高(P<0.05)，見圖2。

A：NGF mRNA；B：BDNF mRNA。*：P<0.05，與假手術+生理鹽水組比較；#：P<0.05，與MCAO+生理鹽水組比較。

圖2 各組大鼠腦組織NGF和BDNF mRNA水平

2.4 T3對腦缺血再灌注大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達水平的影響 與假手術+生理鹽水組和假手術+T3組相比，MCAO+生理鹽水組大鼠NGF和BDNF蛋白表達水平均增加(P<0.05)；而與MCAO+生理鹽水組相比，MCAO+T3組大鼠NGF和BDNF表達水平進一步升高(P<0.05)，見圖3。

A：NGF蛋白；B：BDNF蛋白。*：P<0.05，與假手術+生理鹽水組比較；#：P<0.05，與MCAO+生理鹽水組比較。

圖3 各組大鼠腦組織NGF和BDNF蛋白表達水平

3 討 論

腦血管病是目前危害人類健康的常見病之一，其中80%約為缺血性腦血管病。本研究通過MCAO建立局灶性腦缺血再灌注大鼠模型，觀察甲狀腺激素對大鼠腦缺血再灌注損傷的神經保護作用，結果顯示，甲狀腺激素T3對腦缺血再灌注損傷有保護作用，可減輕缺血再灌注損傷所致神經缺損表現，減少梗死體積，保護受損神經元，促進神經元再生等作用。同時發現，T3的這種神經保護作用與增加腦組織中NGF和BDNF的表達水平，促進新生神經元再生相關。

腦缺血再灌注損傷所致局部梗死灶主要由中心壞死區和周邊缺血半暗帶組成[9-10]。缺血早期，中心區的神經元壞死，神經功能完全喪失；而周邊區神經元暫時處于休眠狀態[11-12]，只要盡早恢復其血供，即可及時修復受損細胞。NGF和BDNF均屬于神經生長因子家族，在中樞神經發育過程至關重要[13-14]。Tongiorgi等[15]發現，多發性硬化癥患者中，BDNF可通過激活PI3K-Akt信號通路，維持神經元生存。Li等[16]發現，局灶性腦缺血后，BDNF通過調節TrkB相關信號，抑制神經細胞凋亡，促進神經元再生。此外，BDNF還可通過NMDA受體及胞核鈣信號拮抗興奮性氨基酸的神經毒性反應[17]。據報道，NGF可作用于NMDA受體，降低細胞內的Ca2+超載，加速自由基清除、減輕興奮性氨基酸毒性，從而保護神經元[18]。可見，適度增加腦組織中NGF和BDNF表達水平，對維持神經元存活、促進受損神經修復、減輕神經毒性是有利的。

甲狀腺激素，特別是T3，在哺乳動物神經系統發育成熟的過程中至關重要，它已被證實參與胚胎腦細胞的增殖分化、樹突軸突生長、神經元遷移及髓鞘形成等[4,19]。然而，其作用并不局限于幼年個體。近年來，人們逐漸開始關注甲狀腺激素對于成年動物腦組織的影響[5-6,20]。研究發現，成年人甲狀腺激素水平紊亂(過低或過高)會導致情緒障礙、癡呆或混亂[21]。慢性脫髓鞘動物模型中，給予外源性的T3能夠促進癥狀的緩解和髓鞘再生修復[22]。Deb等[23]發現，甲狀腺激素可通過調節一氧化氮和pERK1/2信號通路保護星形膠質細胞免受嗎啡誘導的細胞凋亡。此外，研究還發現，T3通過一種非基因組機制，減輕神經毒性反應[7,24]。綜上所述，甲狀腺激素對正常中樞神經系統維持及損傷神經系統修復均具有保護作用，然而其在腦缺血再灌注后損傷中的作用尚未見報道。

因此，本研究通過大鼠腦缺血再灌注模型，觀測甲狀腺激素對腦缺血再灌注損傷的作用。結果表明，甲狀腺激素T3可通過增加腦組織中NGF和BDNF表達水平，促進神經元再生、修復受損神經細胞、減輕腦梗死體積，從而對缺血再灌注大鼠起到神經保護作用。

[1]Male S,Nickele C,Elijovich L.Critical care of brain reperfusion[J].Curr Neurol Neurosci Rep,2016,16(3):23.

[2]Fang M,Yuan Y,Lu J,et al.Scutellarin promotes microglia-mediated astrogliosis coupled with improved behavioral function in cerebral ischemia[J].Neurochem Int,2016(97):154-171.

[3]Pendharkar AV,Levy SL,Ho AL,et al.Optogenetic modulation in stroke recovery[J].Neurosurg Focus,2016,40(5):E6.

[4]Rovet JF.The role of thyroid hormones for brain development and cognitive function[J].Endocr Dev,2014(26):26-43.

[5]Sánchez-Huerta K,García-Martínez Y,Vergara P,et al.Thyroid hormones are essential to preserve non-proliferative cells of adult neurogenesis of the dentate gyrus[J].Mol Cell Neurosci,2016(76):1-10.

[6]Hung PL,Huang CC,Huang HM,et al.Thyroxin treatment protects against white matter injury in the immature brain via brain-derived neurotrophic factor[J].Stroke,2013,44(8):2275-2283.

[7]Mendes-De-Aguiar CB,Alchini R,Decker H,et al.Thyroid hormone increases astrocytic glutamate uptake and protects astrocytes and neurons against glutamate toxicity[J].J Neurosci Res,2008,86(14):3117-3125.

[8]Longa EZ,Weinstein PR,Carlson S,et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989,20(1):84.

[9]Yu Y,Han Q,Ding X,et al.Defining core and penumbra in ischemic stroke:a voxel and volume-based analysis of whole brain CT perfusion[J].Sci Rep,2016(6):20932.

[10]Lin L,Bivard A,Krishnamurthy V,et al.Whole-brain CT perfusion to quantify acute ischemic penumbra and core[J].Radiology,2016,279(3):876-887.

[11]le Feber J,Tzafi Pavlidou S,Erkamp N,et al.Progression of neuronal damage in an in vitro model of the ischemic penumbra[J].PLoS One,2016,11(2):e0147231.

[12]Hillis AE,Baron JC.Editorial:the ischemic penumbra:still the target for stroke therapies[J].Front Neurol,2015(6):85.

[13]Hernandez-Morato I,Sharma S,Pitman MJ.Changes in neurotrophic factors of adult rat laryngeal muscles during nerve regeneration[J].Neuroscience,2016,333(12):44-53.

[14]Lian D,He D,Wu J,et al.Exogenous BDNF increases neurogenesis in the hippocampus in experimental Streptococcus pneumoniae meningitis[J].J Neuroimmunol,2016(294):46-55.

[15]Tongiorgi E,Sartori A,Baj G,et al.Altered serum content of brain-derived neurotrophic factor isoforms in multiple sclerosis[J].J Neurol Sci,2012,320(1/2):161-165.

[16]Li X,Zheng W,Bai H,et al.Intravenous administration of adipose tissue-derived stem cells enhances nerve healing and promotes BDNF expression via the TrkB signaling in a rat stroke model[J].Neuropsychiatr Dis Treat,2016(12):1287-1293.

[17]Lau D,Bengtson CP,Buchthal B,et al.BDNF Reduces toxic extrasynaptic NMDA receptor signaling via synaptic NMDA receptors and nuclear-calcium-induced transcription of inhba/activin A[J].Cell Rep,2015,12(8):1353-1366.

[18]Wong H,Kang I,Dong XD,et al.NGF-induced mechanical sensitization of the masseter muscle is mediated through peripheral NMDA receptors[J].Neuroscience,2014(269):232-244.

[19]Préau L,Fini JB,Morvan-Dubois G,et al.Thyroid hormone signaling during early neurogenesis and its significance as a vulnerable window for endocrine disruption[J].Biochim Biophys Acta,2015,1849(2):112-121.

[20]Remaud S,Gothié JD,Morvan-Dubois G,et al.Thyroid hormone signaling and adult neurogenesis in mammals[J].Front Endocrinol (Lausanne),2014(5):62.

[21]Leyhe T,Müssig K.Cognitive and affective dysfunctions in autoimmune thyroiditis[J].Brain Behav Immun,2014(41):261-266.

[22]El-Tahry H,Marei H,Shams A,et al.The effect of triiodothyronine on maturation and differentiation of oligodendrocyte progenitor cells during remyelination following induced demyelination in male albino rat[J].Tissue Cell,2016,48(3):242-251.

[23]Deb I,Das S.Thyroid hormones protect astrocytes from morphine-induced apoptosis by regulating nitric oxide and pERK 1/2 pathways[J].Neurochem Int,2011,58(8):861-871.

[24]Kumar BK,Reddy AG,Krishna AV,et al.Developmental neurotoxicity of monocrotophos and lead is linked to thyroid disruption[J].Vet World,2016,9(2):133-141.

The influence of thyroid hormones on the expression of NGF and BDNF after cerebral ischemia-reperfusion injury in rats*

DouChao,ZhangMin,ZhaoYuanzheng,GuoYapei,WuShitao,LiuHengfang△

(DepartmentofNeurology，theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou，Henan450000,China)

Objective To investigate the neuroprotective effect of thyroid hormones T3 on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats and its mechanism．Methods SD rats were divided into four groups:sham+saline group,sham+T3 group,MCAO+saline group,MCAO+T3 group.The cerebral ischemia-reperfusion injury rat models were established by right middle cerebral artery occlusion.Thyroid hormones (10 μg/100 g) or normal saline were given respectively by intraperitoneal injection twice at 1 h after the onset of ischemia and 6 h after reperfusion.Neurobehavioral score was evaluated at 24 h after reperfusion;TTC staining was used to label infarction area;RT-PCR was used to detect the mRNA level of nerve growth factor (NGF) and brain derived neurotrophic factor (BDNF) in brain tissue;Western blot was employed to determine alterations in protein levels of NGF and BDNF.Results Compared with MCAO+saline group,the neurological deficit and the volume of cerebral infarction of MCAO+T3 group was decreased,and the mRNA and protein expression of NGF and BDNF of MCAO+T3 group were increased(P<0.05).Conclusion Thyroid Hormones could promote the nerve repair,stimulate the nerve regeneration and improve the nervous behavioral function by up-regulating the expression of NGF and BDNF.

brain ischemia；reperfusion injury；thyroid hormones；nerve growth factor;neuroprotective effect;brain-derived neurotrophic factor

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.005

河南省醫學科技攻關計劃項目(16A310021)。 作者簡介：竇超(1988-)，住院醫師，碩士，主要從事腦血管疾病方面研究。△

，E-mail：liuhf1965@163.com。

R743.3

A

1671-8348(2017)15-2030-04

2016-11-26

2017-01-12)