不同滴度噬菌體D29對氣道上皮細胞9HTE的生長及功能影響研究*

梁 梅,郭述良,張紅梅

(1.重慶市渝北區人民醫院呼吸內科 401120；2.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶 400016；3.重慶市第五人民醫院呼吸內科 400062)

不同滴度噬菌體D29對氣道上皮細胞9HTE的生長及功能影響研究*

梁 梅,郭述良2△,張紅梅3

(1.重慶市渝北區人民醫院呼吸內科 401120；2.重慶醫科大學附屬第一醫院呼吸內科，重慶 400016；3.重慶市第五人民醫院呼吸內科 400062)

目的 研究噬菌體D29不同滴度對氣道上皮細胞株9HTE的生長及功能影響。方法 分別用高滴度(109PFU/mL)和低滴度(107PFU/mL)噬菌體D29及噬菌體緩沖液組作用于9HTE細胞株后，用四甲基偶氮唑藍比色法(MTT)檢測細胞生長情況；用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法測量細胞上清液白細胞介素(IL)-6、IL-8水平；用逆轉錄PCR(RT-PCR)檢測細胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表達，用流式細胞技術檢測細胞凋亡率。結果 高、低滴度噬菌體D29作用氣道上皮細胞一段時間后，對細胞生長活性、細胞因子IL-6、IL-8和ICAM-1 mRNA的表達,以及細胞凋亡率的影響與噬菌體緩沖液組比較差異無統計學意義(P>0.05)。結論 高、低滴度噬菌體D29對體外培養的氣道上皮細胞生長及功能無明顯影響。

細菌噬菌體；氣管；白細胞介素類；血管細胞黏附分子1；氣道上皮細胞；安全性

當前，結核病仍是全球最嚴重的公共衛生問題之一，2014年全球960萬人患有結核病，其中150萬人因感染結核而死亡，48萬人為耐多藥結核病。結核病耐藥形勢嚴峻，而現有的治療方案無法達到令人滿意的效果，因此急需研發新的治療結核病的方法和制劑。噬菌體作為細菌病毒中的一種，能在感染細菌周期末期特異性裂解宿主菌,故可作為抗菌制劑而被用于研究[1]，特別是用于耐藥菌的治療[2]。噬菌體D29能裂解結核分枝桿菌，有望用于結核病的診斷和治療。本課題組前期研究發現，噬菌體D29能裂解巨噬細胞內的結核分枝桿菌，使結核病模型豚鼠肝、脾臟器荷菌量減少，這為研制耐藥結核病治療用噬菌體制劑奠定了基礎[3]。且前期研究還發現噬菌體D29通過呼吸道給入后到達肺部的滴度比皮下、肌內注射高，且維持時間長，表明氣道給藥可能有利于治療肺結核[4]。但通過呼吸道給入噬菌體安全性如何還不得而知，本文通過對噬菌體D29對體外培養的氣道上皮的生長和功能研究，以期了解噬菌體通過氣道給藥的安全性。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗材料：氣道上皮細胞株9HTE，由重慶市兒童醫院呼吸科實驗室惠贈；噬菌體D29由中國藥品生物制品檢定所王國治教授惠贈。試劑：DMEM培養基(美國Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，美國Gibco公司)，胰蛋白酶(美國Gibco公司)，四甲基偶氮唑藍比色(MTT，超純級，美國Amersco公司)，酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D公司分裝)，Annexin V/PI細胞凋亡檢測試劑盒(凱基公司)。逆轉錄試劑盒、RNAiso、Plus、Tag酶、DNA Marker (上海寶生物公司)，引物序列由上海寶生物合成。

1.2 方法

1.2.1 9HTE細胞的培養 氣道上皮細胞9HTE用含10%的FBS DMEM培養基(內含有4.0 mmol/L谷氨酰胺，4 500 mg/L葡萄糖)培養于50 mL培養瓶中，置于37 ℃，5%CO2細胞培養箱中培養，每隔1 d換液，待細胞于對數生長期時用于試驗。

1.2.2 MTT比色法檢測細胞增殖活性 取對數生長的9HTE細胞制成1×105/mL接種到96孔細胞培養板內，每孔150 μL，待過夜貼壁后換無血清培養液培養24 h，使細胞同步化于G0期。取出培養板后棄去無血清培養基，給藥組加入噬菌體D29使得每孔終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，每孔終體積均為200 μL，以噬菌體緩沖液(phage buffer)為陰性對照孔，均設置4個復孔，置于37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養，24 h后，加入MTT(5 g/L)每孔20 μL后放入37 ℃、5%CO2細胞培養箱孵育4 h，以800 r/min，離心5 min，棄去上清液，每孔加入二甲基亞砜150 μL，輕輕振蕩10 min，使紫色結晶完全溶解后，用全波長酶標儀于570 nm檢測吸光度(A)值，該試驗重復3次。細胞存活率=(A給藥組-A空白組)/(A正常組-A空白組)×100%。其中給藥組為試驗干預組，正常組為未做任何處理組，空白組為單純加入MTT細胞培養基組。

1.2.3 ELISA法檢測細胞上清液白細胞介素(IL)-6、IL-8分泌水平 接種處于對數生長期的9HTE氣道上皮細胞懸液以1×105/孔接種于24孔細胞培養板內，每孔500 μL待過夜貼壁后試驗組加入噬菌體D29使每孔的最終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為1 mL，均設置4個復孔；以phage buffer為陰性對照組，脂多糖(LPS，終濃度為10 mg/L)設置為陽性對照組，置入37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養，2 d后，收集細胞上清液，3 000 r/min，離心20 min，取上清液，按照ELISA試劑盒說明書操作，測上清液細胞因子IL-6、IL-8水平，該試驗重復3次。

1.2.4 RT-PCR半定量檢測氣道上皮細胞細胞間黏附分子-1(ICAM-1)mRNA的表達 將對數生長的氣道上皮細胞懸液以1×106/瓶接種到細胞培養瓶中，細胞過夜貼壁后加入噬菌體D29使每孔的終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為3 mL；以phage buffer為陰性對照組，置入37 ℃、5%CO2細胞培養箱培養，2 d后按照說明書提取細胞總RNA,反轉錄合成cDNA鏈，加入Tag酶及上、下游引物，在PCR儀上進行PCR擴增。ICAM-1引物核苷酸序列：上游5′-GAG TCT GCT GGG AAT TTT CTG G-3′，下游5′-GAG GTG ACA GTG AAG TGT GAG G-3′，PCR循環參數為：94 ℃ 30 s變性，56 ℃ 30 s退火，共反應30循環；β-actin上游5′-TCC TGT GGC ATC CAC GAA ACT-3′,下游5′-GAA GCA TTT GCG GTG GAC GAT-3′。PCR循環參數為：94 ℃ 30 s變性，58 ℃ 30 s退火，共反應35循環，擴增產物瓊脂糖電泳并掃描成像，計算機軟件分析電泳條帶灰度。

1.2.5 流式細胞儀對氣道上皮細胞凋亡的檢測 臺盼藍記數細胞活力大于95%的氣道上皮細胞105/孔接種于24孔細胞培養板，細胞貼壁后換無血清DMEM培養基24 h，使細胞同步于G0期。試驗組加入噬菌體D29使每孔終濃度分別為109、107PFU/mL(高滴度組、低滴度組)，終體積為1 mL；陰性對照組加入phage buffer，均設3個復孔，刺激48 h后，以無二乙胺四乙酸(EDTA)的0.25%胰蛋白酶收集上清液和底壁細胞，以1 000 r/min離心5 min。用無菌PBS洗滌2次，沉淀以500 μL binding緩沖液懸浮細胞，加入5 μL AnnexinV-FITC混勻后再加入5 μL碘化丙啶(PI)，室溫避光孵育10 min后立即用流式細胞儀檢測。

2 結 果

2.1 高、低滴度噬菌體D29對9HTE細胞生長活性 高滴度和低滴度分別作用于氣道上皮細胞9HTE不同時間12、24、48 h后，各組存活率見表1。采用重復測量方差分析，作用時間對9HTE細胞無明顯影響(F=0.892,P=0.427)；高、低滴度對細胞生長活性比較差異無統計學意義(F=0.506,P=0.619)；作用時間及濃度之間不存在交互作用(F=1.053,P=0.408)。

表1 MTT法檢測9HTE細胞增殖存活率結果

2.2 高、低滴度噬菌體D29對9HTE分泌細胞因子的影響

2.2.1 高、低滴度噬菌體D29對9HTE分泌IL-6的影響 用高、低滴度噬菌體D29作用于氣道上皮細胞9HTE 48 h后，各組細胞上清液IL-6水平較少，高滴度組[(1.185±0.114)ng/L]、低滴度組[(1.193±0.932)ng/L]與陰性對照組[(1.238±0.443)ng/L]及正常組[(1.210±0.101)ng/L]兩兩比較差異無統計學意義(F=0.257，P=0.855)；陽性對照組[(3.788±0.048)ng/L]與正常組比較細胞因子水平明顯升高，比較差異有統計學意義(t=46.123，P=0.000)。

2.2.2 高、低滴度分別對9HTE分泌IL-8的影響 高滴度組[(0.632±0.042)ng/L]、低滴度組[(0.596±0.163)ng/L]細胞上清液細胞因子IL-8水平與陰性對照組[(0.625±0.003)ng/L]及正常組[(0.609±0.025)ng/L]比較差異無統計學意義(F=1.568，P=0.248)；陽性對照組[(0.817±0.016)ng/L]與正常組比較細胞因子水平升高明顯，比較差異有統計學意義(t=14.064，P=0.000)。

2.2.3 高、低滴度噬菌體D29對9HTE細胞表達ICAM-1的mRNA影響 高滴度組(2.76±0.27)和低滴度組(2.75±0.30)各組間ICAM-1 mRNA表達量與陰性對照組(2.84±0.15)和正常組(2.49±0.35)均比較差異無統計學意義(F=0.695，P=0.581)，見圖1。

1:高滴度組；2:低滴度組；3:陰性對照組；4:正常組。

圖1 各組9HTE細胞ICAM-1 mRNA的表達

2.2.4 流式細胞儀檢測 高滴度組[(9.82±0.59)%]、低滴度組[(9.98±0.34)%]與陰性對照組[(10.09±0.32)%]、正常對照組[(10.56±0.18)%]凋亡率兩兩比較差異無統計學意義(F=1.992，P=0.194)。

3 討 論

結核病耐藥問題逐漸嚴重，故急需要開發新的抗菌藥物，噬菌體D29裂解譜廣，抗原性較高，能裂解耐藥結核分枝桿菌，故有望用于肺結核病特別是耐藥結核病的治療[5]。結核病以肺部感染最多，通過課題組前期研究表明通過呼吸道給藥噬菌體到達肺部量最多，藥物量維持時間長[4,6]，保證其有效性，但目前國內外對噬菌體對氣道上皮的功能及安全性研究甚少。

氣道上皮細胞具有機械屏障作用，同時還有更重要的免疫炎癥防御作用[7]，氣道上皮細胞受刺激后可產生多種炎癥介質，募集炎性細胞，誘發異常炎癥反應，造成病理損傷[8]。IL-6在正常氣道上皮細胞極少分泌，但在受刺激后分泌量增加，其主要功能是促進T、B細胞增殖活化，參與炎癥反應，導致機體發熱等，IL-8是一種化學趨化因子，可趨化并激活中性粒細胞到達炎癥部位，發揮作用[9]。而ICAM-1屬于免疫球蛋白超家族成員之一，參與調解炎癥反應，細胞和組織之間分化和發育、免疫反應應答及淋巴細胞歸巢和再循環等一些重要的生理功能[10]，也是大部分血清型鼻病毒、呼吸道合胞病毒等多種病毒的受體，受到相關病毒感染時，其ICAM-1表達上調[11-13]。

本試驗研究結果提示：無論是高滴度或是低滴度噬菌體D29對氣道上皮細胞分泌的IL-6、IL-8及氣道上皮細胞的生長活性和ICAM mRNA 的分泌均無明顯影響，表明噬菌體D29本身不會刺激氣道上皮細胞發生炎癥反應，初步表明噬菌體D29對氣道上皮細胞具有較好的安全性，但本試驗僅限于體外試驗，對體內試驗是否安全需要進一步動物試驗證明。

綜上所述，噬菌體D29作用于人氣道上皮細胞一段時間過后，對其生長及功能均無明顯影響，表面噬菌體D29對氣道上皮細胞有較好的安全性，為今后噬菌體生物制劑通過呼吸道治療肺結核感染提供安全性依據。

[1]Rastogi V,Pragya,Verma N,et al.An overview on bacteriophages:a natural nanostructured antibacterial agent[J].Curr Drug Deliv，2016.DOI:10.2174/1567201813666 160406115744.[Epub ahead of print].

[2]Latz S,Wahida A,Arif A，et al.Preliminary survey of local bacteriophages with lytic activity against multi-drug resistant bacteria[J].J Basic Microbiol，2016，56(10):1117-1123.

[3]Peng L,Chen BW,Luo YA,et al.Effect of mycobacteriophage to intracellular mycobacterium smegmatis and mycobacterium tuberculosis in vitro[J].Respirology,2005,10 Suppl:S177.

[4]梁梅,郭述良,張紅梅，等．噬菌體D29不同途徑給入在小鼠體內的代謝分布[J]．中國新藥與臨床雜志，2012(5)：272-276.

[5]鄔亭亭,劉平,羅永艾，等.分枝桿菌噬菌體D29的生物學特性研究及其抗耐藥結核潛力的探討[J].世界科技研究與發展,2012,34(2):314-317.

[6]楊文慧.分枝桿菌噬菌體D29應用于耐藥結核病治療的探索性研究[D].天津：中國人民解放軍軍事醫學科學院,2009.

[7]Lloyd CM,Saglani S.Asthma and allergy:the emerging epithelium[J].Nat Med,2010,16(3):273-274.

[8]Liu YJ.Thymic stromal lympHopoietin:master switch for allergic inflammation[J].J Exp Med,2006,203(2):269-273.

[9]曹雪濤.醫學免疫學[M].6版.北京：人民衛生出版社,2013:52-55.

[10]唐可京,李幼基,謝汕茂.ICAM-1與VCAM-1 的結構表達與調控[J].醫學分子生物學雜志,2002，24(3):173-177.

[11]Bochkov YA,Gern JE.Rhinoviruses and their receptors:implications for allergic disease[J].Curr Allergy Asthma Rep，2016，16(4):30.

[12]Alves MP,Sch?gler A,Ebener S，et al.Comparison of innate immune responses towards rhinovirus infection of primary nasal and bronchial epithelial cells[J].Respirology,2016,21(2):304-312.

[13]Liu X,Qin X,Xiang Y,et al.Progressive changes in inflammatory and matrix adherence of bronchial epithelial cells with persistent respiratory syncytial virus (RSV) infection (progressive changes in RSV infection)[J].Int J Mol Sci,2013，14(9):18024-18040.

Effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelia cell 9HTE*

LiangMei1,GuoShuliang2△,ZhangHongmei3

(1.DepartmentofRespiratory,People′sHospitalofYubeiDistrict,Chongqing401120,China; 2.DepartmentofRespiratory,theFirstAffiliatedHospitalofChongqingMedicalUniversity,Chongqing400016,China; 3.DepartmentofRespiratory,theFifthPeople′sHospitalofChongqing，Chongqing400062,China)

Objective To research the effects of different titers of bacteriophage D29 on growth and function of airway epithelial cell 9HTE.Methods Cell viability rates was analyzed after applying high(109PFU/mL) and low(107PFU/mL) titers of bacteriophage D29 and phage buffer respectively by MTT colorimetry.Additionally,the secretion levels of IL-6，IL-8 in cell culture supernatant were detected by ELISA.RT-PCR was performed to detect the expression of ICAM-1 mRNA.Cell apoptosis rate was analyzed by flow cytometry.Results There was no difference in cell growth,secretion levels of IL-6,IL-8,ICAM-1 mRNA and cell apoptosis rate between cells treated with high and low titers of D29 and phage buffer(P>0.05).Conclusion Neither high nor low titer of bacteriophage D29 exerts effect on growth and function of airway epithelial cell 9HTE invitro.

bacteriophages；trachea；interleukins；vascular cell adhesion molecule-1；airway epithelial cells；security

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.15.003

國家自然科學基金資助項目(81570010)。作者簡介：梁梅(1984-)，住院醫師，碩士，主要從事呼吸系統疾病方面研究。△

，E-mail:guosl999@sina.com。

R329.2

A

1671-8348(2017)15-2024-03

2016-11-21

2017-01-09)