原花青素B2保護血管內皮細胞延緩凋亡及機制研究

李 強，楊成明

(1.重慶市南川區人民醫院心內科 408400；2.第三軍醫大學野戰外科研究所大坪醫院心內科 400042)

論著·基礎研究

原花青素B2保護血管內皮細胞延緩凋亡及機制研究

李 強1，楊成明2△

(1.重慶市南川區人民醫院心內科 408400；2.第三軍醫大學野戰外科研究所大坪醫院心內科 400042)

目的 以H2O2誘導人內皮細胞凋亡為模型，觀察原花青素B2(GSPB2)延緩人內皮細胞凋亡的保護作用及其機制。方法 用0.5 mmol H2O2預處理細胞，分別加入不同濃度的GSPB2(5.0、10.0、20.0 μmol/L)保護細胞，TUNEL法檢測細胞凋亡；Western blotting檢測凋亡相關分子Caspase-3、Bax、Bcl-2以及影響凋亡的相關分子PI3K、p-Akt、Akt的蛋白表達；Transwell小室檢測各組細胞遷移情況。結果 0.5 mmol H2O2致人內皮細胞凋亡明顯增加(P<0.01)，GSPB2能明顯減輕H2O2所致的人內皮細胞凋亡(P<0.05)，10 μmol/mL的GSPB2就能接近恢復到H2O2未處理的對照組水平。進一步研究發現：Caspase-3、bax蛋白表達上調，Bcl-2表達下調；PI3K、p-Akt、Akt表達上調。結論 不同濃度的GSPB2對H2O2誘導的血管內皮細胞具有保護作用，而且表現為濃度依賴性和時間依賴性，其機制與相關分子PI3K、p-Akt、Akt有關。

原花青素B2；凋亡；血管內皮細胞

心血管疾病的發病率和病死率在所有疾病中是最高的，血管內皮細胞分布廣，極易受到多種因素的影響，其中，氧化與抗氧化對弈、凋亡與抗凋亡的矛盾，都發生在血管內皮細胞，進而與心血管疾病相關聯。原花青素(grape seed proanthocyanidins,GSPs)廣泛存在于水果、蔬菜、花、堅果、種子和樹皮中，是一類多羥基黃烷-3-酚的低聚物，也有以高聚物形式存在的酚類化合物，原花青素與縮合單寧是同系物，是多羥基黃烷-3-酚的寡聚或高聚物，大多以C4→C8鍵相互連接，也存在C4→C6鍵連接[1]。具有抗氧化、清除自由基、心血管保護、抗炎、抗血小板聚集、抗腫瘤、調節血脂、抗高血壓、抑制細胞增殖、調節免疫、保護肝臟、抑制細胞凋亡以及抗疲勞、改善睡眠等廣泛的生物活性,且具有高效、低毒、生物利用度高等特點[2-5]。研究發現：Bax/Bcl-2蛋白和半胱天冬酶-3活化與GSP處理誘導的凋亡現象間有所關聯[6]。因此，探討原花青素對血管內皮細胞的保護機制具有重要的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 原花青素B2(GSPB2)(貨號B10957)，標準品大于或等于98%，購自上海士鋒生物科技有限公司；H2O2DMSO購自Sigma公司，小鼠抗人caspase-3、 抗人BCL-2 、抗人bax、抗人akt、抗人 p-akt、抗人PI3K單抗均購自Cell Signaling Technology公司。Tulne試劑盒購自羅氏公司，一次性細胞培養瓶(25 cm2、75 cm2)細胞培養板等購自Coster公司。CO2細胞培養箱購自Shellab公司；倒置顯微鏡購自日本奧林巴斯公司；電子天平(Thermo Scientific)、酶標儀、電泳儀購自Bio-Rad公司；純水制備系統購自Millipore公司；pH計購自上海大普儀器有限公司；光學顯微鏡及其成像系統購自Bio-Rad公司；搖床、組化筆、小型染色缸、濕盒(塑料飯盒與紗布)、塑料蓋玻片或封口膜、吸管、各種規格的移液器及槍頭等。

1.2 主要溶液配制方法 (1)GSPB2溶液：用DMSO直接溶解粉狀的GSPB2至終濃度為40 mmd/L，-20 ℃保存備用。(2)10%FBS的DMEM/H細胞完全培養基：于500 mL裝的DMEM/H培養液中加入青霉素與鏈霉素使其終濃度都為100 U/mL，于4 ℃保存。使用前與胎牛血清以9∶1的比例混合，4 ℃保存待用。(3)PBS溶液：將PBS緩沖體系(粉末)充分溶于超純水，配制成1×PBS緩沖液，分裝后高溫高壓滅菌。(4)0.25%胰酶：稱取0.25 g胰蛋白酶和0.02 g乙二胺四乙酸(EDTA)，溶解于100 mL PBS緩沖液中，充分攪拌混勻，4 ℃放置過夜后于超凈工作臺用一次性過濾器過濾除菌，4 ℃保存。

1.3 細胞培養及分組 人臍靜脈血管內皮細胞株CRL-2932細胞購自ATCC公司。用含有10%胎牛血清的DMEM/H的完全培養基，在37 ℃、5%CO2且濕度飽和的恒溫細胞培養箱中培養。顯微鏡下觀察細胞貼壁生長至80%～95%時，用0.25%胰蛋白酶進行消化傳代。

1.3.1 分組 (1)空白對照組,換無血清DMEM/H繼續培養；(2)H2O2組，換無血清DMEM/H培養基2 h后，加入終濃度為1 mmol/L的H2O2培養24 h。(3)GSPB2+H2O2組，換無血清培養基，不同濃度的GSPS(5.0、10.0、20.0 μmol/L)預處理2 h后加H2O2孵育24 h。但是免疫印跡選用的時間為24 h，GSPB2的濃度為10.0 μmol/L。

1.3.2 CCK-8 法檢測細胞的存活率 取對數生長期的細胞，接種于96孔板(每孔接2 000個細胞)，在37℃、5%CO2培養條件培養過夜，按分組要求給予不同因素的處理，每組設8個平行孔，培養24 h后，每孔加入10 μL的CCK-8，繼續培養2 h，用分光光度計在540 nm出讀取光度值(OD)，取其8孔的平均值按公司計算細胞的存活率，細胞的存活率(%)=處理組OD/對照組×100%。

1.3.3 TUNEL檢測細胞的凋亡取對數生長的細胞，消化成為細胞懸液，1×105個細胞/每孔接種于24孔板中，24孔板內放入細胞爬片，在37 ℃、5%CO2培養條件培養過夜，按分組要求給予不同因素的處理，培養24 h后。PBS洗3次-4%多聚甲醛固定-PBS洗3次-0.3%triton-100透化細胞-PBS洗3次-滴加TUNEL反應物，37 ℃孵育60 min-沖洗樣品5～20 min-用抗熒光碎滅封片劑封片，熒光顯微鏡拍照分析結果。

1.4 免疫印跡檢測Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K、p-Akt、Akt蛋白表達 提取各組CRL-2932細胞的總蛋白，用BCA法測定各組細胞蛋白的含量，每孔上樣25 μg的總蛋白，用5%積層膠和10%的分離膠電泳后，半干轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，室溫用TBST配制的5%脫脂奶粉封閉1 h。分別加入人抗的總Caspase-3(1∶500稀釋)，活化的Caspase-3(1∶500稀釋)，人抗的Bax(1∶1 000稀釋)，人抗的PI3K(1∶1 000稀釋)，人抗的p-Akt(1∶1 000稀釋) 人抗的Akt(1∶1 000稀釋)，4℃過夜孵育，復溫半小時，TBST洗3次，每次10 min，加入HRP標記的兔抗人的二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗3次，每次10 min，化學發光顯影目的條帶和內參，用Quantity Qne軟件分析光密度值，代表蛋白表達的相對含量。

2 結 果

2.1 細胞存活率 用H2O2孵育內皮細胞24 h后，明顯下降(P<0.05)，細胞的存活率僅為對照組的59.1%±1.2%。用不同濃度的GSPB2和H2O2共同孵育內皮細胞后，細胞的存活率依次分別為：64.5%±1.8%，80.5 %±2.2%，85.4 %±1.9%。隨著GSPB2濃度增高，內皮細胞的存活率增加，成濃度依賴性，但10.0 μmol/L和20.0 μmol/L之間對細胞的活性差異無統計學意義(P>0.05)。

圖1 10.0 μmol/L GSPB2對H2O2誘導內皮細胞的凋亡保護作用

A:對照組；b：H2O2(0.5 mmol/L)；c：H2O2(0.5 mmol/L)+GSPB2(10 μmol/L)。

圖2 10 μmol/L GSPB2對內皮細胞的保護作用

2.2 GSPB2對H2O2誘導內皮細胞凋亡的影響 采用TUNEL染色檢測內皮細胞的凋亡，觀察GSPB2(濃度10.0 μmol/L)保護H2O2誘導的內皮細胞發生凋亡情況。結果發現：正常情況下細胞凋亡率為1.0%，存活率為99.0%，在濃度為1.0 mml/L的H2O2孵育24 h后，細胞的凋亡率明顯增加，為41.0%，存活率為59.0%。用濃度為10.0 μmol/L的GSPS預處理2 h后，再加H2O2孵育，在第6小時尚未見明顯變化，但在第12、24、48小時的凋亡率分別為：36.0%、27.0%、25.0%。第48小時與24小時的凋亡率差異無統計學意義(P>0.05)，見圖1。

2.3 Caspase-3、Bax、Bcl-2、PI3K 、p-Akt、Akt的蛋白表達 Western bloting結果顯示：H2O2處理內皮細胞24 h后，與對照組比較，總Caspase-3的表達不變，活化的Caspase-3表達上調，用10 μmol/L的GSPB2預處理后，再加入H2O2，活化的Caspase-3表達下調(圖2E)。同時Caspase-3的下游蛋白bax上調，Bcl-2上調(圖2，A、B)。影響細胞凋亡的信號分子PI3K(圖2D)明顯增加；同時，p-Akt、Akt明顯增加(圖2C)。

3 討 論

原花青素是一種天然多酚類化合物，是由不同數量的兒茶素、表兒茶素縮合而成的聚合體，因其具有極強的抗氧化活性和清除自由基能力，而被廣泛應用于保健食品、護膚品及醫藥衛生等領域。以往的研究發現GSPE主要有以下作用，(1)調節血脂:GSPE能夠降低血清TC、TG、LDL水平，同時升高HDL水平，而且還能夠增加血清卵磷脂膽固醇酰基轉移酶(LACT)活性，調節膽固醇外流，減少膽固醇聚集，減輕泡沫細胞的聚集；(2)抗炎作用:GSPE主要通過下調細胞黏附分子的表達，減少單核細胞向內膜下的遷入以及抑制類花生燒酸合成酶的基因轉錄和酶活性,抑制炎性介質的產生，以及對NF-kB途徑的調控等發揮其強大的抗炎作用,對類風濕性關節炎等多種急慢性炎性疾病都有很好的抗炎作用[7-9]；(3) GSPE可以抑制多種腫瘤細胞的生長并促進其凋亡，對抗血管內皮細胞損傷，抑制VSMC的增殖和遷移,發揮心血管保護效應，能夠抑制心臟損傷時心肌細胞的凋亡等等。凋亡是由抗凋亡和促凋亡效應分子，如Bcl-2和Bax，所組成的復雜調控網絡來調控的，Bax/Bcl-2比率升高會導致半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶的裂解且會誘導凋亡過程[10-12]。體內體外實驗都證實與食物中不添加GSPs的無胸腺裸鼠體內生長的腫瘤內相關蛋白表達水平相比，GSPs可在鼠乳腺癌細胞(4T1)和人類鱗狀細胞癌A431細胞中下調Bcl-2表達的同時上調Bax的表達，半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3的表達水平增加。血管內皮功能紊亂則是AS的起始環節，與CHD的發生有密切的關系[14]，因此，保護內皮功能也已成為心血管疾病防治的重要目標之一。

Akt可以磷酸化Caspas-9前體(ProCaspas-9)從而阻斷內源性蛋白酶的活性，已知ProCaspas-9是Caspas級聯反應的起始蛋白酶，Caspas-9的活化可以激活Caspas-3、Caspas-6、Caspas-7等蛋白酶，在凋亡級聯反應中起中間的轉接作用，在凋亡調控中發揮主要功能。本實驗發現：不同濃度的GSPB2可以有效保護血管內皮細胞延緩凋亡，作用的影響，而且是通過調節Akt磷酸化的方式發揮作用的[13]。

[1]Prieur JR,Cheynier L,Moutounet M.Oligomeric and polymeric procyanidins from grape seeds[J].Phytochemistry,1994,36(3):781-789.

[2]Yamakoshi J,Kataoka S,Koga T,et al.Proanthocyanidin-rich extract from grape seeds attenuatesthe development of aortic atherosclerosis thecholesterol in fed rabbits[J].Atherosclerosis,1999,142(1):139-149.

[3]Dongmo AB,Kamanyi A,Anchang MS，et al.Anti-inflammatoy and amilgesicpropeities of thestem bark extract of erythrophleumsuaveolens(caesalpiniaceae),guillemin samp perrottet[J].J Ethnopharmacol,2001,77(2/3):137-141.

[4]Zhang JQ,Gao BW,Wang J,et al.Critical role of foxO1 in granulosa cell apoptosis caused by oxidative stress and protective effects of grape seed procyanidin B2[J].Oxid Med Cell Long,2016(4):1-16.

[5]Cai X,Bao L,Ren J,et al.Grape seed procyanidin B2 protects podocytes from high glucose-induced mitochondrial dysfunction and apoptosis via the AMPK-SIRT1-PGC-1α axis in vitro[J].Food Funct，2016，7(2):805-815.

[7]Roy AM,Baliga MS,Elmets CA,et al.Grape seed proanthocyanidins induce apoptosis through p53,Bax,and caspase 3 pathways[J].Neoplasia,2005,7(1):24-36.

[8]Yin W,Li B,Li X,et al.Anti-inflammatory effects of grape seed procyanidin B2 on a diabetic pancreas[J].Food Funct，2015，6(9):3065-3071.

[9]Baselga-Escudero L,Blade C,Ribas-Latre AA,et al.Chronic supplementation of proanthocyanidins reduces postprandial lipemia and liver miR-33a and miR-122 levels in a dose-dependent manner in healthy rats[J].J Nutritional Biochemistry,2014,25(2):151-156.

[10]Devi A,Jolitha AB,Ishii N.Grape seed proanthocyanidin extract(GSPE) and antioxidantdefense in the brain of adult rats [J].Med Sci Monit,2006,12(4):124-129.

[11]Clarke RB.p27(KIP1) phosphorylation by PKB/Akt leads to poor breast cancer prognosis[J].Breast Cancer Res,2003,5(3):162-163.

[12]Engelbrecht AM,Mattheyse M,Ellis B,et al.Proanthocyanidin from grape seeds inactivates the PI3-kinase/PKB pathway and induces apoptosis in a colon cancer cell line[J].Cancer Lett,2007,258(1):144-153.

[13]Meeran SM,Katiyar SK.Grape seed proanthocyanidins promote apoptosis in human epidermoid carcinoma A431 cells through alterations in Cdki-Cdk-cyclin cascade,and caspase-3 activation via loss of mitochondrial membrane potential[J].Exp Dermatol,2007,16(5):405-415.

[14]郭兵,秦觀海,袁英.α生育酚對鏈脲菌素誘導乳鼠胰島細胞凋亡的影響[J] 重慶醫學，2010，39(16)：2190-2194.

Study on effect and mechanism of GSPB2 for protecting vascular endothelial cell and delaying apoptosis

Li Qiang1,Yang Chengming2△

(1.Department of Cardiology,Nanchuan District People′s Hospital，Chongqing 408400；2.Department ofCardiology,Daping Hospital,Third Military Medical University，Chongqing 400042,China)

[Abstract] Objective To observe the protective effect of GSPB2 for delaying the human endothelial cells apoptosis with H2O2induced human endothelial cells apoptosis as the model and to investigate its mechanism.Methods The human endothelial cells were pre-treated by 0.5 mmol H2O2,then different concentrations of GSPB2(5.0,10.0,20.0 μmol/L) was added for protecting cells.The cellular apoptosis was detected by TUNEL method;the apoptosis related molecules,such as Caspase-3,Bax,Bcl-2,and influencing apoptosis related molecules such as PI3K,p-Akt and Akt protein expression were detected by Western blot;Transwell chamber was used to detect cell migration situation.Results 0.5 mmol H2O2induced obvious increase of human endothelial cells (P<0.01).GSPB2 could significantly alleviate the H2O2induced apoptosis of human endothelial cells(P<0.05).10 μmol/mL GSPB2 could be close to return to H2O2untreated control group level.Further found that Caspase-3,Bax protein expression were up-regulaed,Bcl-2 expression was down-regulated and the expression of PI3K,p-Akt and Akt wa sup-regulated.Conclusion The different concentrations of GSPB2 has a protective effect on vascular endothelial cells induced by H2O2,moreover which manifested by the concentration and time dependence.Its mechanism is related with the related molecules PI3K,p-Akt and Akt

GSPB2;apoptosis;vascular endothelial cell

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.008

李強(1971-)，本科，副主任醫師，主要從事高血壓、冠心病的臨床診治方面的研究。△

，E-mail:yangchmi@163.com。

R54

A

1671-8348(2017)13-1753-03

2016-11-24

2017-01-12)