人牙源性iPSCs 3種培養底物的比較*

譚小兵，劉 佳，郭 宇，徐靜舒，戴青原

(1.云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院口腔內科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032)

論著·基礎研究

人牙源性iPSCs 3種培養底物的比較*

譚小兵1，劉 佳1，郭 宇1，徐靜舒1，戴青原2△

(1.云南省第一人民醫院/昆明理工大學附屬醫院口腔內科，昆明 650032；2.昆明醫科大學第一附屬醫院心內科，昆明 650032)

目的 對比研究3種人牙源性誘導性多能干細胞(iPSCs)培養底物的特點。方法 使用3種底物培養人牙源性iPSCs：小鼠胚胎成纖維細胞(MEF)、基質膠和重組人玻連蛋白(VTN-N)，對比iPSCs的生長情況。結果 3種底物的制備時間分別為14、3、1 h，三者間差異有統計學意義(P<0.05)；iPSCs重編程時間分別為(30±1.6)、(26±2.1)、(27±1.4)d，其中MEF組明顯多于其他兩組(P<0.05)；重編程效率分別為0.3%±0.03%、0.56%±0.08%、0.7%±0.02%(P<0.05)。3種底物均能較好支持iPSCs生長，使其保持未分化狀態。結論 重組人玻連蛋白無異源性動物組分，制備簡便、標準可控、重編程時間較短，是目前理想的支持iPSCs生長的底物。

人誘導性多能干細胞；小鼠胚胎成纖維細胞；基質膠；重組人玻連蛋白

2007年Yamanaka等[1-2]兩個獨立研究小組先后將轉錄基因Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc或Oct4/Sox2/Nanog/Lin28導入人皮膚成纖維細胞，將其誘導為具有胚胎干細胞(embryonic stem cells,ESCs)性質的細胞，并命名為誘導性多能干細胞(induced pliripetent stem cells，iPSCs)，為干細胞治療與再生醫學研究提供了新的思路[3-6]。iPSCs在形態、細胞倍增能力、類胚體和畸胎瘤形成、分化能力等多方面與ESCs非常相似，在組織再生、疾病模型、個性化治療等方面具有巨大的應用前景[7-9]。iPSCs應用于臨床研究時必須考慮其生物安全性，除了采用非整合性重編程方法(如仙臺病毒、質粒載體、mRNAs、蛋白等)進行誘導以外[10]，飼養層底物也是影響iPSCs生物安全性的重要影響因素。人牙髓干細胞(dental pulp stem cells，DPSCs)為間充質干細胞(mesenchymal stem cells,MSCs)來源，一定條件下可分化為脂肪、成骨或軟骨系細胞，但與iPSCs相比其增殖和分化能力有限。本研究采用仙臺病毒將人DPSCs誘導為iPSCs，觀察比較3種培養底物對iPSCs生長的支持程度，篩選符合臨床要求的最佳底物。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 α-MEM、2.5 g/L胰蛋白酶、0.25 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、bFGF、重組人玻連蛋白(VTN-N)、Ⅰ型膠原酶購自美國Invitrogen公司，胎牛血清購自美國Hyclone公司，基質膠(生長因子減少型)購自美國BD公司，Ⅱ型中性蛋白酶購自瑞士Roche公司，CytoTune?-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kit購自美國Life公司，重編程培養基、PSC-easy培養基購自北京賽貝生物科技公司，H9細胞購自美國國家干細胞庫。

1.2 方法

1.2.1 人DPSCs的分離培養 參照Gronthos方法[11]：收集本院口腔頜面外科拔除的下頜第三磨牙，術前告知并取得書面同意。分離牙髓組織、剪碎，Ⅰ型膠原酶與Ⅱ型中性蛋白酶混合液(3∶4，mg/mL)孵育60 min，離心、棄上清液，加入完全培養基(α-MEM + 15% FBS + 1%谷氨酰胺 + 1%青/鏈霉素)，過濾得到單細胞懸液，37 ℃、5%CO2常規培養，90%融合后傳代，第3～5代用于實驗。觀察細胞形態特征，流式細胞儀檢測特異標記物的表達。所有實驗均經云南省第一人民醫院倫理委員會批準。

1.2.2 人DPSCs重編程及培養 利用Sendai Reprogramming Kit試劑盒進行細胞轉染，0.5 mmol/L EDTA液消化傳代。人胚胎干細胞H9為標準對照。仙臺病毒(Sendai virus，SeV)轉染：前兩天，第3代DPSCs鋪到6孔板內(1×105/孔)常規培養。轉染當天(第0天)，將適量SeV溶解到70 μL DPSCs培養基內，1 d后再加入130 μL 培養基，第2天換新鮮含SeV培養液。第3天將已轉染細胞分別轉移到3種底物覆蓋的6孔板內，加入重編程培養基繼續培養，3周左右可觀察到克隆出現。克隆成熟時，“十字法”分割，轉移到新培養板內，PSC-easy培養基培養。

1.2.3 3種培養底物的制備 小鼠胚胎成纖維細胞(mouse embryonic fibroblasts，MEF)按照文獻[12]制備：處死受孕小鼠，去除胚胎所有臟器、剪碎，0.25%胰酶/EDTA、37 ℃消化15 min，制成單細胞懸液，37 ℃、5%CO2培養(此時為第0代MEF)，90%融合時傳代或凍存。傳代90%融合時，加入含絲裂霉素C的培養液(10 μg/mL)，2 h后消化細胞，轉入培養皿，第2天即可使用。基質膠(matrigel)：4 ℃解凍，預冷槍頭混勻，冷PBS稀釋(50 μg/mL，1∶100)，取適量包被培養板，37 ℃孵育2 h或4 ℃過夜，吸去基質膠，加入PSC-easy液備用；Vitronectin，VTN-N：常溫解凍，常溫PBS液稀釋(5 μg/mL，1∶100)，取適量包被培養板，37 ℃孵育1 h，吸去VTN-N，加入PSC-easy液備用。

1.2.4 3種不同底物培養系統的比較

1.2.4.1 iPSCs克隆生長情況 (1)觀察iPSCs克隆在3組不同底物上的形態特征(H9為標準對照)。(2)RT-PCR：TriZOL試劑盒提取iPSCs總RNA，20 μL體系逆轉錄試劑盒合成單鏈cDNA，反應條件25 ℃ 5 min，42 ℃ 30 min，85 ℃ 5 min，4 ℃保存。PCR反應程序：95 ℃ 5 min，35次循環(95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 7 min，電泳檢測、成像，檢測iPSCs特異性標記物Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc的表達情況，人H9為標準對照，水為陰性對照。根據目的基因設計相應引物(表1)。

表1 人DPSCs-iPSCs標記物基因上下游引物堿基序列

1.2.4.2 重編程時間 包括3組不同底物的準備時間(培養基、飼養層細胞的制備)、從目標細胞接種到iPSCs克隆出現所需時間，重復3次，取平均值。

1.2.4.3 重編程效率 出現克隆數占重編程體細胞數量的比例是一個重要參數。計算公式：克隆數/體細胞數量×100%，重復3次，取平均值。

2 結 果

2.1 人DPSCs培養及鑒定 分離培養第1天即可看到細胞貼壁生長，第4天形成克隆，第10天形成單細胞層。細胞為紡錘形或長梭形，形態較大(圖2A、2B)。流式細胞儀結果顯示DPSCs不表達CD34、CD45，幾乎所有細胞為CD90、CD105陽性，CD146染色陽性(28.4%)，說明為MSCs來源；Stro-1和Oct-4染色均為陽性(分別為28.3%、43.6%)，說明細胞具有多向分化潛能。

圖2 人DPSCs培養及鑒定

2.2 人iPSCs重編程及其在3種底物上的培養 轉染細胞接種到3組底物，重編程3 d即可觀察到纖維細胞樣克隆出現，7～10 d后生長停止，出現胞核凝固，細胞分解，克隆松散直至消失。ES樣克隆多出現于轉染后4周左右，表現為轉染細胞縮小為圓形或規則多邊形，單層排列緊密，邊緣銳利清晰，邊界清楚。此時ES樣克隆即為iPS原代細胞(P0)。吸取原代iPSCs克隆種植于底物上傳代培養，此時為iPS第1代(P1)。克隆生長迅速，EDTA液消化傳代，4～5 d傳代1次，細胞繼續維持ES樣克隆特征。3種底物均可很好地支持DPSCs-iPS和H9細胞的生長，克隆呈集落樣生長；與周圍有清晰分界線，克隆內細胞排列致密，保持未分化狀態(圖3)。RT-PCR結果顯示iPSCs特異標記物的表達穩定，提示iPSCs處于未分化狀態(圖4A)。

A:MEF;B:基質膠；C：重組人玻連蛋白；D：MEF;E:基質膠；F：重組人玻連蛋白。

圖3 人DPSCs-iPS與H9生長于不同培養底物

2.3 3種底物準備及重編程時間 MEF培養基準備2 h，鋪板過夜12 h，絲裂霉素處理時間2 h，總計14 h，重編程第30天左右克隆開始出現。基質膠準備時間1 h，包被孵育2 h，重編程第26天時克隆開始，VTN-N準備時間0.2 h，包被孵育1 h，重編程第25天克隆開始出現(P<0.05)(圖4B)。

2.4 重編程效率 人DPSCs重編程前細胞數量為1×104，重編程后3種底物上分別得到30、56、70個克隆，重編程效率為0.3%±0.03%、0.56%±0.08%、0.7%±0.02%，重編程效率間差異有統計學意義(P<0.05)，見圖5。

圖4 人DPSCs-iPS特異性標記物RT-PCR分析及不同底物重編程時間比較

圖5 人DPSCs-iPS不同培養底物上的重編程效率比較

3 討 論

考慮到倫理道德及免疫排斥因素，iPSCs比ESCs更適于細胞移植和再生醫學，是目前最有應用前景的種子細胞[13]。能滿足臨床應用要求的iPSCs稱為臨床級別iPSCs，理論上須滿足以下3個條件：(1)細胞捐獻者須符合《組織捐獻指南》的要求；(2)細胞處理全過程須在GMP級別實驗環境中進行，使用無異源性動物組分試劑；(3)獲得的iPSCs無外源性基因或病毒整合，生物安全性有保證[14]。

目前制約iPSCs應用于臨床的其中一個因素就是其生物安全性，如重編程載體帶來的致瘤性可能、培養底物成分、含異源性動物組分試劑等。本實驗采用一種非整合性RNA載體-仙臺病毒誘導人DPSCs重編程為iPSCs，RT-PCR結果證實得到的iPSCs無仙臺病毒或外源性轉染基因的表達，同時所用iPSCs培養基無異源性動物組分(重編程培養基和PSC-easy培養基)，保證了iPSCs的生物安全性(結果另文報道)。在此基礎上筆者選擇3種培養底物，對比研究哪種可以最佳支持iPS細胞的生長。

自從人ESCs成功培養以來，許多人ESCs和iPSCs系陸續成功建立，細胞生物學特性的研究有助于了解自我更新和定向分化過程中的關鍵通道和轉錄因子，而這又反過來促進了iPSCs的培養條件最佳化。iPSCs的培養底物經歷了從飼養層到無飼養層體系的發展。早期iPSCs培養大多基于Thomson等創立的ESCs培養體系[15]，MEF作為飼養層可以分泌多種生長因子、激素和胞外基質如轉化生長因子β、激活素A、層粘連蛋白和玻連蛋白，支持穩定可靠的iPSCs。但MEF存在異源性動物組分污染可能，成分不明，制備耗時，標準不易控制，同時MEF及其產物對iPSCs本身是可能的病原體[16]。為了純化細胞產物，需要采用無飼養細胞的培養體系。無飼養細胞培養體系大多基于Thomson體系加以改良[17]，matrigel首先用于培養底物。有研究將人iPSCs培養于3種不同的底物，結果發現matrigel可以很好支持iPSCs生長，與MEF無明顯差異[15]。matrigel是一種富含層粘連蛋白111的可溶性基底膜基質，同時含TGF-β、成纖維細胞生長因子、組織纖維酶原活化因子等[18]。matrigel在室溫下可自動聚集產生類似于哺乳動物細胞基底膜的生物活性基質材料，生成類似體內環境的良好基底膜狀態，有助于iPSCs的附著生長，為iPSCs保持未分化狀態提供理想支持，是常用的培養底物[17]。matrigel成分相對單一，制備簡便，標準可控，但其為小鼠源性腫瘤組織，限制了iPSCs的臨床使用。重組人玻連蛋白(VTN-N)來自于人血漿的純化，其主要整合素結合多肽是精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸(RGD)，通過αvβ5整合素支持人ESCs和iPSCs的生長，使其保持未分化和自我更新能力[18]。本研究從細胞形態、特異性標記物表達等方面進行分析，結果發現3種底物均能很好地使人DPSCs-iPSCs和H9長期維持未分化狀態，與其他學者研究結果一致[17-19]。同時本研究分別在3種底物上對人DPSCs進行重編程，結果發現VTN-N所需重編程時間最短，重編程效率也明顯高于其他兩組，說明VTN-N可以為iPSCs的生長提供理想支持條件。

重組人玻連蛋白無異源性動物組分污染，制備簡便，標準可控，是人牙源性iPSCs的理想底物。GMP標準下嚴格要求iPSCs重編程的全過程，包括目標細胞捐獻者篩選、非整合性重編程載體的選擇、合適底物、目標細胞及iPSCs的生物安全性檢測、無異源性動物組分試劑的使用等方面，建立安全的臨床級別人牙源性iPSCs，是筆者今后的研究方向。

[1]Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.

[2]Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.

[3]Ramalho-Santos M.iPS cells:insights into basic biology[J].Cell,2009,138(138):616-618.

[4]Liu L,Huang JS,Han C,et al.Induced pluripotent stem cells in huntington′s disease:disease modeling and the potential for cell-based therapy[J].Mol Neurobiol,2016，53(10)：6698-6708.

[5]Pozzobon M,Ghionzoli M,De Coppi P.ES,iPS,MSC,and AFS cells.Stem cells exploitation for pediatric surgery:current research and perspective[J].Pediatr Surg Int,2010,26(1):3-10.

[6]Casaroli-Marano RP,Nieto-Nicolau N,Martínez-Conesa EM,et al.Potential role of induced pluripotent stem cells(IPSCs) for cell-based therapy of the ocular surface[J].J Clin Med,2015,4(2):318-342.

[7]Wang A,Tang Z,Park IH,et al.Induced pluripotent stem cells for neural tissue engineering[J].Biomaterials,2011,32(22):5023-5032.

[8]Tafaleng EN,Chakraborty S,Han B,et al.Induced pluripotent stem cells model personalized variations in liver disease resulting from α1-antitrypsin deficiency[J].Hepatology,2015,62(1):147-157.

[9]Montgomery A,Wong A,Gabers N,et al.Engineering personalized neural tissue by combining induced pluripotent stem cells with fibrin scaffolds[J].Biomater Sci,2015,3(2):401-413.

[10]Hibaoui Y,Feki A.Concise review:methods and cell types used to generate down syndrome Induced pluripotent stem cells[J].J Clin Med,2015,4(4):696-714.

[11]Bilic J,Izpisua Belmonte JC.Concise review:induced pluripotent stem cells versus embryonic stem cells:close enough or yet too far apart[J].Stem Cells,2012,30(1):33-41.

[12]Thomson JA,Odorico JS.Human embryonic stem cell and embryonic germ cell lines[J].Trends Biotechnol,2000,18(2):53-57.

[13]Vallier L.Serum-free and feeder-free culture conditions for human embryonic stem cells[J].Methods Mol Biol,2011,690(1):57-66.

[14]Ninomiya H,Mizuno K,Terada R,et al.Improved efficiency of definitive endoderm induction from human induced pluripotent stem cells in feeder and serum-free culture system[J].In Vitro Cell Dev Biol Anim,2015,51(1):1-8.

[15]Ghasemi-Dehkordi P,Allahbakhshian-Farsani M,Abdian N,et al.Comparison between the cultures of human induced pluripotent stem cells(hiPSCs) on feeder-and serum-free system(matrigel matrix),MEF and HDF feeder cell lines[J].J Cell Commun Signal,2015,9(3):233-246.

[16]Nagaoka M,Kobayashi M,Kawai C,et al.Design of a vitronectin-based recombinant protein as a defined substrate for differentiation of human pluripotent stem cells into hepatocyte-like cells[J].PLoS One,2015,10(8):e0136350.

[17]Badenes SM,Fernandes TG,Cordeiro CS,et al.Correction:defined essential 8 medium and vitronectin efficiently support scalable xeno-Free expansion of human induced pluripotent stem cells in stirred microcarrier culture systems[J].PLoS One,2016,11(5):e0155296.

[18]Braam SR,Zeinstra L,Litjens S,et al.Recombinant vitronectin is a functionally defined substrate that supports human embryonic stem c ell self-renewal via alphavbeta5 integrin[J].Stem cells,2008,26(9):2257-2265.

[19]Rowland TJ,Miller LM,Blaschke AJ,et al.Roles of integrins in human induced pluripotent stem cell growth on Matrigel and vitronectin[J].Stem Cells Dev,2010,19(8):1231-1240.

Comparison among 3 kinds of culture substrates of odontogenic induced pluripotent stem cells*

Tan Xiaobing1，Liu Jia1,Guo Yu1,Xu Jingshu1,Dai Qingyuan2△

(1.Department of Endodontics,Yunnan Provincial First People′s Hospital/Kunming Univerty ofscience and Technology Affiliated Hospital,Kunming,Yunnan 650032,China;2.Department of Cardiology,First Affiliated Hospital of Kunming Medical University,Kunming,Yunnan 650032,China)

[Abstract] Objective To comparatively study the characteristics of 3 kinds of culture substrates of human odontogenic induced pluripotent stem cells(iPSCs).Methods The human odontogenic iPSCs were cultured by 3 kinds of substrates:mouse embryonic fibroblasts(MEF),matrigel and recombinant human vitronectin(VTN-N).The iPSCs growth situation was compared among three groups.Results The preparation time of these 3 kinds of substrates was 14,3,1 hlespectively,and,the difference was statistically significant (P<0.05).The iPSCs reprogramming time was (30±1.6),(26±2.1),(27±1.4)d,lespectively,wht that in the MEF group significantly higer than in other two groups (P<0.05).The reprogramming efficiencies were 0.3%±0.03%,0.56%±0.08%,0.7%±0.02% respectively(P<0.05).Three kinds of substrate could better support iPSCs growth and make them to maintain un-differentiation status.Conclusion with no heterologous animal components,and the adrantaga of simple pleparation,oonfrollable standard and shorter gramming time is easy to prepare,the standard is controllable and the reprogramming time is shorter,which is an ideal substrate for supporting iPSCs growth.

human induced pluripotent stem cell；MEF；matrigel;vitronectin

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.005

國家自然科學基金資助項目(81360161)；云南省教育廳基金資助項目(2015Y153)。 作者簡介：譚小兵(1974-)，碩士，副主任醫師，主要從事干細胞在牙髓再生中的應用研究。△

，E-mail:dqy0823@163.com。

R78

A

1671-8348(2017)13-1743-04

2016-11-25

2017-01-13)