塞來昔布下調(diào)Apaf-1蛋白表達(dá)促進(jìn)大鼠顱腦損傷后學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)的研究*

張 濤，國建飛，邢琳琳，張金玲，張宇新

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺人民醫(yī)院，河北邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北邢臺 054001；3.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北唐山 063000)

·論 著·

塞來昔布下調(diào)Apaf-1蛋白表達(dá)促進(jìn)大鼠顱腦損傷后學(xué)習(xí)記憶功能恢復(fù)的研究*

張 濤1，國建飛1，邢琳琳1，張金玲2，張宇新3

(1.河北醫(yī)科大學(xué)附屬邢臺人民醫(yī)院，河北邢臺 054031；2.邢臺醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，河北邢臺 054001；3.華北理工大學(xué)醫(yī)學(xué)院,河北唐山 063000)

目的 探討塞來昔布對大鼠創(chuàng)傷性腦損傷后學(xué)習(xí)記憶功能和環(huán)氧化酶(COX-2)及凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)蛋白表達(dá)的影響。方法 將72只成年雄性Wistar大鼠等量分為對照組、假手術(shù)組、損傷組和治療組，術(shù)后72 h灌注取腦，應(yīng)用免疫組化法和Western blot法分別檢測 COX-2 及Apaf-1蛋白表達(dá)變化；術(shù)前5 d和術(shù)后72 h采用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)觀察大鼠學(xué)習(xí)記憶功能。結(jié)果 損傷組COX-2和Apaf-1蛋白表達(dá)明顯高于其他組，治療組與損傷組比較蛋白表達(dá)均下降(P<0.05)，但仍高于假手術(shù)組和對照組(P<0.05)；Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，損傷組逃避潛伏期時(shí)間延長為4組之最(P<0.05)，治療組較損傷組時(shí)間有所縮短(P<0.05)。結(jié)論 COX-2抑制劑塞來昔布可下調(diào)COX-2和Apaf-1蛋白表達(dá)，抑制炎性反應(yīng)、細(xì)胞凋亡，改善腦損傷后的學(xué)習(xí)、記憶障礙。

腦損傷；環(huán)氧化酶-2；凋亡蛋白酶活化因子-1；學(xué)習(xí)；記憶

眾多的研究表明，炎癥因子所激發(fā)的一系列炎性反應(yīng)，是加重繼發(fā)性腦損傷的重要原因之一[1]，因此臨床上迅速減少炎性反應(yīng)所帶來的繼發(fā)性損傷尤為重要。環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase-2,COX-2)是花生四烯酸代謝的限速酶，后者產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)，與繼發(fā)性腦損傷關(guān)系密切[2]。凋亡蛋白酶活化因子-1(antipernicious anemia factor,Apaf-1)作為線粒體凋亡途徑中一個(gè)重要促凋亡因子，能促進(jìn)凋亡小體的形成，激活通路下游的一系列Caspases成員[3]，切割特定的凋亡底物，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[4]。本實(shí)驗(yàn)以大鼠顱腦損傷為模型，通過塞來昔布對COX-2蛋白的超選擇性抑制，調(diào)節(jié)凋亡因子Apaf-1蛋白的表達(dá)，抑制顱腦損傷后炎性反應(yīng)和減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡，為腦損傷的臨床治療提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物 Wistar大鼠72只，雄性，體質(zhì)量(280±20)g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SCXX(京)2007-0008]，自由進(jìn)食飲水，室溫(25±2)℃，自然光照。

1.2 藥品與試劑 塞來昔布購自北京輝瑞制藥有限公司(國藥準(zhǔn)字J20120063，規(guī)格200 mg，批號C1420006862)；總蛋白提取試劑盒(北京普利萊基因技術(shù)有限公司)；BCA蛋白濃度測定試劑盒(南京碧云天生物技術(shù)研究所)；增強(qiáng)型ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒(美國Biologycal Industries公司)；DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物有限公司)；兔抗COX-2及Apaf-1多克隆一抗(美國Santa Cruz公司)；兔抗GAPDH多克隆一抗、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔二抗(美國Abcam公司)；JEM-1230投射電子顯微鏡(日本Jeol公司)；分子生物學(xué)凝膠電泳儀及化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)；LEICA-Rm2145型半自動輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.3 方法

1.3.1 動物分組 將72只SPF級雄性Wistar大鼠分為對照組、開顱即縫合的假手術(shù)組、改良Foda[5]自由落體法建立的損傷組和損傷組基礎(chǔ)上腹腔注射塞來昔布的治療組(250 mg/kg/6 h)，前3組相同條件下注入等量生理鹽水，每組18只大鼠，各組均在造模前5 d隨機(jī)選取6只大鼠進(jìn)行Morris水迷宮訓(xùn)練，其余各組剩余12只大鼠直至術(shù)后72 h常規(guī)灌注取材。

1.3.2 顱腦損傷模型制備 參照文獻(xiàn)[5]大鼠重型顱腦損傷模型構(gòu)建方法加以改良，制備損傷組模型。術(shù)前禁食8 h并在術(shù)前0.5 h時(shí)，腹腔注射阿托品(30 mg/kg)，無不良反應(yīng)后，以10%水合氯醛(350 mg/kg)腹腔注射麻醉，顱頂除毛，75%乙醇消毒術(shù)區(qū)。將大鼠取俯臥位固定于腦立體定向儀上，沿正中矢狀線切口開顱，在冠狀縫及人字縫交匯處暴露骨膜并固定打擊片，將450 g打擊錘以1.2 m高度自由落體后，迅速保護(hù)大鼠，防止二次損傷。明膠海綿止血并人工輔助呼吸及傷口清創(chuàng)縫合，術(shù)后常規(guī)飼養(yǎng)。

1.3.3 標(biāo)本制備 術(shù)后72 h將各組大鼠以10%水合氯醛(350 mg/kg)經(jīng)腹腔麻醉，沿胸腹腔正中線暴露心尖，用生理鹽水及4%多聚甲醛先后灌注，充分固定后斷頭取腦。腦組織行后固定經(jīng)常規(guī)梯度乙醇脫水、透明、浸蠟、包埋后石蠟橫切片(厚5 μm)，烘干后待染色。

1.3.4 COX-2和Apaf-1免疫組織化學(xué)及結(jié)果判斷 術(shù)后72 h，采用Envision二步法對組織切片進(jìn)行SP染色，分別加入兔抗COX-2、Apaf-1多克隆一抗(1∶50)，用鹽酸鹽緩沖液(PBS)取代一抗作為陰性對照，各組圖片均使用200倍光鏡從左上、左下、右上、右下及中間5個(gè)視角攝取結(jié)果。結(jié)果判定：以細(xì)胞顏色呈棕褐(黃)色顆粒且強(qiáng)度高于背景非特異性著色則視為陽性結(jié)果。評分要求：一個(gè)視野內(nèi)細(xì)胞數(shù)大于75%、51%～74%、11%～50%、<10%時(shí)分別對應(yīng)分值為4、3、2、1分，陰性為0分；染色強(qiáng)度評分依次為棕褐色3分、棕黃色2分、淡黃色1分，無色0分；兩項(xiàng)得分相乘為陽性表達(dá)“+、++、+++”分別代表3、4、5分，“-”為0～2分屬陰性表達(dá)。

1.3.5 Western blot法檢測COX-2、Apaf-1蛋白表達(dá)變化 術(shù)后72 h，迅速剝離各組大鼠頂葉皮層下方海馬區(qū)域腦組織，按蛋白提取試劑盒說明提取各組總蛋白。依照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明測定總蛋白濃度，各組攝取統(tǒng)一濃度樣品行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)跑膠、聚偏氟乙烯(PVDF) 轉(zhuǎn)膜、5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后行一抗反應(yīng)(COX-2、Apaf-1一抗1∶200和GAPDF一抗1∶400)，4 ℃孵育過夜，次日行二抗反應(yīng)1∶500，室溫孵育2 h，ECL試劑盒顯影后使用Bio-Rad攝片，運(yùn)用Quantity One系統(tǒng)分析各組目的蛋白/GAPDH的相對表達(dá)量。

1.3.6 學(xué)習(xí)記憶能力測試 造模前5 d從各組選取6只大鼠，進(jìn)行全天各4次，每次60 s，持續(xù)5 d的Morris水迷宮方法定位航行試驗(yàn)及空間探索訓(xùn)練[6]。將大鼠從左上、左下、右上、右下方向隨機(jī)放入渾濁水中，從入水到爬上隱藏平臺所需時(shí)間即逃避潛伏期(escape latency，EL)，記錄每只大鼠每天的EL平均值就是平均逃避潛伏期(average escape latency，AEL)，如超過120 s未能登陸隱藏平臺則引導(dǎo)其登陸，并記錄搜索平臺線路軌跡，此時(shí)EL記為120 s，用于觀察學(xué)習(xí)認(rèn)知能力；移除水下平臺，記錄大鼠120 s內(nèi)穿過原始平臺所在的位置次數(shù)(停留2 s以上)，考察其記憶能力。

2 結(jié) 果

2.1 COX-2和Apaf-1免疫組織化學(xué)結(jié)果 腦組織海馬區(qū)域中運(yùn)用免疫組織化學(xué)法分別檢測4組模型COX-2和Apaf-1表達(dá)變化，陽性表達(dá)主要位于細(xì)胞質(zhì)中呈棕褐或黃色，結(jié)果發(fā)現(xiàn)對照組及假手術(shù)組均呈陰性表達(dá)(圖1A、B；圖2A、B)，兩組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1；損傷組呈棕褐色且數(shù)量較多(圖1C、圖2C)，加入塞來昔布后的治療組呈棕黃色表現(xiàn)(圖1D、圖2D)，與損傷組比較COX-2、Apaf-2均有所減少但仍高于其他兩組(P<0.05)，見表1。

A：對照組；B：假手術(shù)組；C：損傷組；D：治療組。

圖1 腦組織海馬區(qū)域中的COX-2表達(dá)(SP，×200)

A：對照組；B：假手術(shù)組；C：損傷組；D：治療組。

圖2 腦組織海馬區(qū)域中的Apaf-1表達(dá)(SP，×200)

2.2 Western blot檢測COX-2 和 Apaf-1在各組中蛋白表達(dá)變化 COX-2和Apaf-1各組目的條帶分別在72×103和130×103處顯示，與其相對分子質(zhì)量相符(圖3)。蛋白定量分析結(jié)果顯示，COX-2和Apaf-1假手術(shù)組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，損傷組與其他各組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，治療組與損傷組比較均有所降低，但數(shù)值仍高于對照組及假手術(shù)組(P<0.05)，見表2。

表1 免疫組織化學(xué)檢測各組COX-2和Apaf-1的陽性表達(dá)情況

圖3 Western blot檢測COX-2和Apaf-1在各組中的蛋白表達(dá)變化

組別COX-2/GAPDHApaf-1/GAPDH對照組0.46±0.090.57±0.05假手術(shù)組0.57±0.140.42±0.09損傷組2.79±0.482.41±0.33治療組1.64±0.361.24±0.12F16.44838.514

2.3 Morris水迷宮測試結(jié)果 術(shù)后1周對各組大鼠進(jìn)行連續(xù)4 d Morris水迷宮測試，其中AEL和探索次數(shù)可有效反映大鼠認(rèn)知功能，而大鼠游泳軌跡分為4種：隨機(jī)型、邊緣型、直線型及趨向型，其中直線型和趨向型則最能反映大鼠記憶功能。通過對比各組大鼠行為學(xué)測試發(fā)現(xiàn)，對照組和假手術(shù)組無論AEL、探索次數(shù)還是游泳軌跡均較為接近，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。損傷組與其他3組比較AEL時(shí)間均明顯延長，探索次數(shù)也均顯著降低，認(rèn)知功能顯著下降(P<0.05)，通過對游泳軌跡發(fā)現(xiàn)，直線型和趨向型次數(shù)均屬組別最低，記憶能力嚴(yán)重受損(P<0.05)。治療組與創(chuàng)傷組比較AEL時(shí)間、探索次數(shù)以及直線型和趨向型游泳軌跡次數(shù)均有所改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表3 各組大鼠Morris水迷宮AEL和探索次數(shù)

表4 Morris水迷宮大鼠游泳軌跡檢測(次)

3 討 論

腦損傷后尋找有效的神經(jīng)保護(hù)藥物，對于患者的學(xué)習(xí)記憶及運(yùn)動功能障礙的恢復(fù)尤為重要。炎性反應(yīng)是導(dǎo)致神經(jīng)元繼發(fā)性損傷進(jìn)行性加重的重要原因，而COX-2 是介導(dǎo)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵酶，因此在繼發(fā)性腦損傷中如何抑制COX-2介導(dǎo)的炎性反應(yīng)有著重大意義。COX-2是花生四烯酸(AA)代謝的限速酶，產(chǎn)生的前列腺素及血栓素是腦創(chuàng)傷后炎癥級聯(lián)反應(yīng)的重要介質(zhì)。炎癥介質(zhì)前列腺素E2(Prostaglandin，PGE2)生物合成的限速酶[7-9]，其代謝產(chǎn)物可導(dǎo)致白細(xì)胞介素(IL)-1、一氧化氮(NO)及腫瘤壞死因子-α(TNF-α)增多[7]。Apaf-1 是一個(gè)具有多功能結(jié)構(gòu)域的蛋白，JNK 途徑中是線粒體依賴的關(guān)鍵蛋白酶，由3個(gè)結(jié)構(gòu)域組成，其氨基末端有一個(gè)半胱氨酸蛋白酶募集域(caspase recruitment domain，CARD) ，CED24 同源域內(nèi)包含一個(gè)保守P環(huán)，羧基末端則由12 個(gè) WD240 重復(fù)片段組成。另外，Apaf-1在細(xì)胞凋亡過程中，起著“扳機(jī)點(diǎn)”的作用，活化的 Apaf-1通過 N 端的 CARD 結(jié)構(gòu)域與 Pro-Caspase-9 分子中的 CARD 結(jié)構(gòu)域形成寡聚化，活化的Caspase-9 可激活下游其他 Caspases 成員，導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[10-13]。

Caspases-3在凋亡過程中處于蛋白級聯(lián)反應(yīng)的核心位置，一旦被活化將使蛋白酶級聯(lián)反應(yīng)放大，促使細(xì)胞發(fā)生不可逆的凋亡[14]。筆者在既往的實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，塞來昔布能夠減少顱腦損傷后大鼠海馬區(qū)域Caspases-3 蛋白的表達(dá)，并且與COX-2蛋白表達(dá)呈正相關(guān)[15]。有研究報(bào)道COX-2/NF-κB信號通路與Apaf-1/caspase凋亡通路緊密相關(guān)，通過抑制COX-2表達(dá)可明顯降低Apaf-1表達(dá)，從而抑制細(xì)胞凋亡[16]。本研究通過免疫組織化學(xué)及Western blot結(jié)果均證實(shí)損傷組COX-2、Apaf-1的蛋白表達(dá)較假手術(shù)組均明顯增高，治療組表達(dá)量均明顯低于損傷組，提示COX-2抑制劑塞來昔布可有效抑制或減少細(xì)胞凋亡；海馬作為腦損傷后易損區(qū)，損傷后出現(xiàn)神經(jīng)細(xì)胞延遲性死亡，可導(dǎo)致長期學(xué)習(xí)記憶功能障礙[1]。Morris水迷宮檢測方法是檢測動物學(xué)習(xí)記憶功能的經(jīng)典方法，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示通過塞來昔布治療后AEL時(shí)間、探索原始平臺以及游泳軌跡較損傷組均有明顯改善，且差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這表明塞來昔布能夠顯著提高顱腦損傷后對大鼠的認(rèn)知能力和記憶能力。

另外COX-2作用下產(chǎn)生PG類產(chǎn)物可以通過誘導(dǎo)bcl-2和Bax 基因突變，抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，并能逆向降低Bax蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步促進(jìn)了細(xì)胞凋亡[16]，而且增多的Bax蛋白還可以通過以下原因加速細(xì)胞的凋亡：(1)線粒體滲透性轉(zhuǎn)換、氧化磷酸化和三磷酸腺苷的合成功能被破壞；(2)細(xì)胞氧化還原作用改變；(3)促進(jìn)線粒體中的凋亡相關(guān)分子Apaf-1釋放，與細(xì)胞色素C相互作用，激活Caspase信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[11]。

COX-2 在炎癥組織中可被IL-1、TNF-α等多種炎性因子所誘導(dǎo)，表達(dá)水平迅速升高，引起炎癥部位的PGE、PGI的快速增加，加劇炎性反應(yīng)和組織損傷。顱腦損傷后腦膠質(zhì)細(xì)胞以及神經(jīng)元中均有TNF-α、IL-1、IL-6和NO的表達(dá)增加，臨床檢驗(yàn)也證實(shí)，患者的腦脊液及血漿中上述炎癥因子檢測值遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常值水平，而上述炎癥因進(jìn)一步通過誘導(dǎo)COX-2表達(dá)，加速了由其介導(dǎo)的炎性反應(yīng)[17]。推斷COX-2可能通過以下途徑加重繼發(fā)性腦損傷：(1)打破PGI2和TXA2保持動態(tài)平衡，導(dǎo)致TXA2增多，引發(fā)了血管的收縮以及微血栓的形成，導(dǎo)致腦缺血的發(fā)生；(2)使血-腦屏障通透性增加，加速了炎癥因子進(jìn)入腦組織，引發(fā)了神經(jīng)元的損傷；(3)COX-2增強(qiáng)興奮性氨基酸的毒性作用，特別是增加了N甲基-D天冬氨酸介導(dǎo)的神經(jīng)毒性作用，引發(fā)神經(jīng)元直接損傷。上述諸多因素均導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞凋亡壞死，引發(fā)相應(yīng)的神經(jīng)功能障礙[18]。

學(xué)習(xí)記憶功能是大腦最重要的高級神經(jīng)功能之一，同時(shí)也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能的整合。創(chuàng)傷后遺留的記憶障礙嚴(yán)重影響患者的康復(fù)，探尋創(chuàng)傷后改善學(xué)習(xí)記憶障礙的藥物具有極其重要的意義。塞來昔布作為經(jīng)典的COX-2高選擇性特異性抑制劑，已廣泛應(yīng)用于臨床的鎮(zhèn)痛治療，筆者研究發(fā)現(xiàn)該藥能顯著改善傷后大鼠的認(rèn)知功能障礙。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，顱腦損傷后塞來昔布能通過抑制由COX-2介導(dǎo)的一系列炎性反應(yīng)，來減少由Apaf-1 作為“扳機(jī)點(diǎn)”引發(fā)的神經(jīng)元的凋亡，既減少由炎性反應(yīng)帶來的繼發(fā)性腦損傷，能減少神經(jīng)元的凋亡，為改善顱腦損傷后學(xué)習(xí)記憶功能障礙提供了新的思路。

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Celecoxib down-regulates Apaf-1 protein expression for promoting learning and mem craniocerebral traumaory function recovery after in rats*

Zhang Tao1,Guo Jianfei1,Xing Linlin1,Zhang Jinling2,Zhang Yuxin3

(1.Hebei Medical University Afficiated Xingtai People′s Hospital,Xingtai,Hebei 054031,China;2.Xingtai Medical College,Xingtai,hebei 054001,China;3.Medical College,North China Institute of Technology,Tangshan,Hebei 063000,China)

[Abstract] Objective To study the effect of celecoxib on learning and memory function,cyclooxygenase(COX-2) and the apoptotic protease-activating factor -1(Apaf-1) protein expression after traumatic brain injury in rat.Methods A total of 72 adult male Wistar rats were equally and randomly divided into the normal control group,sham operation group,trauma group and Celecoxib treatment group.Postoperative 72 h-reperfusion was performed for taking brain specimens.The immunohistochemical method and Western blot were used to respectively detect COX-2 and Apaf-1 protein expression change;the Morris water maze test was adopted to detect the learning and memory function on preoperative 5 d and at postoperative 72 h.Results The COX-2 and Apaf-1 protein expression in the trauma group was significantly higher than that in other groups (P<0.05),and the protein expression in the treatment group and trauma group was decreased,but still higher than that in the sham operation group and normal group(P<0.05);in the Morris water maze test,the prolongation of escape latency time in the trauma group was maximal among 4 groups (P<0.05),but the treatment group had a shorter time compared with the trauma group (P<0.05).Conclusion Craniocerebral trauma can cause different degrees of learning and memory dysfunction,and COX-2 inhibitor celecoxib can downregulate the expression of COX-2 and Apaf-1 protein,inhibit inflammation reaction and cellular apoptosis,and improve the learning and memory dysfunction after traumatic brain injury.

brain injuries;cyclooxygenase-2;apoptotic protease-activating factor-1;learning;memory

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.13.002

河北省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(C2004000689)；河北省博士基金資助項(xiàng)目(05547008D-4)；河北省科學(xué)技術(shù)與社會發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(04276135)。 作者簡介：張濤(1980-)，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事顱腦損傷治療研究。

R651.1+5

A

1671-8348(2017)13-1732-04

2016-11-19

2017-01-07)