人重組煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2的表達(dá)、純化及酶活力測(cè)定

王之涵,任力,趙亮

(1.上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,上海 200092;2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市浦東醫(yī)院神經(jīng)外科,上海 201300)

人重組煙酰胺單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶2的表達(dá)、純化及酶活力測(cè)定

王之涵1,任力2,趙亮2

(1.上海同濟(jì)大學(xué)醫(yī)學(xué)院,上海 200092;2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市浦東醫(yī)院神經(jīng)外科,上海 201300)

目的：通過(guò)大腸桿菌體系誘導(dǎo)表達(dá)煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶2(NMNAT2)，并測(cè)定純化的重組NMNAT2酶蛋白催化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)生物合成的酶比活力。方法：在大腸桿菌BL21(DE3)體系優(yōu)化條件下誘導(dǎo)表達(dá)NMNAT2重組蛋白，利用Ni-NTA Superflow Kit進(jìn)行目的蛋白的純化，Western blot法進(jìn)行鑒定，并通過(guò)酶聯(lián)熒光法測(cè)定其催化產(chǎn)物NAD，測(cè)定其酶活性。結(jié)果：人重組質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a可以在大腸桿菌BL21(DE3)體系中誘導(dǎo)表達(dá)。誘導(dǎo)條件為：LB培養(yǎng)液(卡那霉素，15 μg/mL)中37 ℃，IPTG(1.0 mM)誘導(dǎo)表達(dá)4 h。純化獲得的NMNAT2重組蛋白具有較高的酶活性。結(jié)論：NMNAT2-pET-24a可在大腸桿菌BL21(DE3)體系中穩(wěn)定表達(dá)，優(yōu)化條件下可獲得較高活性的純化NMNAT2重組蛋白，可用于神經(jīng)保護(hù)功能及酶蛋白的活性調(diào)控研究。

煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶-2; 純化; 酶活力; 軸突退變; 神經(jīng)保護(hù)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinate adenine dinucleotide，NAD)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的一個(gè)重要分子，在生物體內(nèi)的生命活動(dòng)中起著至關(guān)重要的作用，不僅是生物體內(nèi)200多種氧化還原酶的輔酶，還是細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路的一個(gè)重要組成部分[1]。作為NAD的合成酶，煙酰胺單核苷酸腺苷酰轉(zhuǎn)移酶(nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase，NMNAT)廣泛存在于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中。在補(bǔ)救途徑中，其可直接催化煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMA)而生成NAD。人和小鼠的NMNAT家族有3個(gè)成員，即NMNAT1、NMNAT2和NMNAT3，均具有保護(hù)神經(jīng)元完整性，維持腦、神經(jīng)系統(tǒng)功能正常運(yùn)轉(zhuǎn)的功能[2]。在哺乳動(dòng)物中，NMNAT1～3具有不同的亞細(xì)胞定位，NMNAT1定位于細(xì)胞核中，NMNAT2存在于高爾基體，NMNAT3存在于線(xiàn)粒體中[3-5]。研究[6]發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)退行性疾病、神經(jīng)元功能退變及軸突功能減弱或喪失均與NMNAT基因失功能性突變或蛋白表達(dá)量較少有關(guān)。然而，細(xì)胞或體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究[7]證實(shí)，NMNATs蛋白過(guò)度表達(dá)具有神經(jīng)保護(hù)，對(duì)抗因環(huán)境、藥物等因素所致的神經(jīng)元活性降低、損傷和老化等神經(jīng)功能障礙和退變的作用，可在一定程度上維持神經(jīng)系統(tǒng)細(xì)胞和組織的生理功能。

軸突功能退變是廣泛存生于生物發(fā)育和疾病病變過(guò)程中的一種軸突自我清除現(xiàn)象。近年來(lái)的研究[8]已證實(shí)，延緩軸突退變可以緩解或者推遲某些神經(jīng)退行性相關(guān)疾病模型動(dòng)物的發(fā)病癥狀和發(fā)病進(jìn)程。NMNAT家族中NMNAT2特異性地存在于高爾基體中，參與對(duì)應(yīng)的生物功能。與NMNAT1和NMNAT3比較，NMNAT2在大腦中高度表達(dá)。Yan等[9]發(fā)現(xiàn)，在APPswe/PS1dE9轉(zhuǎn)基因小鼠中，NMNAT2與阿爾茨海默癥密切相關(guān)。Feng等[10]認(rèn)為，在斑馬魚(yú)模型中，NMNAT2在Mauthner-細(xì)胞中的過(guò)度表達(dá)能有效延遲神經(jīng)退行性病變。此外，破壞NMNAT2的NAD合成活性可明顯抑制軸突的保護(hù)功能。可見(jiàn)，NMNAT2在神經(jīng)退行性疾病中具有極其重要的功能[11-12]；調(diào)節(jié)具有神經(jīng)保護(hù)功能的NMNAT2酶蛋白活性，可用于人類(lèi)腦神經(jīng)疾病的治療[13-14]。本研究利用人重組質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a在BL21(DE3)大腸桿菌體系誘導(dǎo)表達(dá)NMNAT2蛋白，并鑒定和測(cè)定了純化的重組NMNAT2酶蛋白催化NAD生物合成的酶比活力，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人重組質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a(50 ng/μL)購(gòu)自上海近岸生物科技有限公司；BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博大泰克生物基因技術(shù)責(zé)任有限公司；LB Broth培養(yǎng)液、LB Agar、LB粉末、卡那霉素、異丙基硫代半乳糖苷(isopropyl thiogalactoside，IPTG)均購(gòu)自日本寶生物工程株式會(huì)社；BugBuster Master Mix蛋白裂解液購(gòu)自Novagen公司；Halt Protease Inhibitor Cocktail購(gòu)自Thermo公司；Ni-NTA Superflow Kit購(gòu)自凱杰(蘇州)轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究有限公司；0.25～2.0 μg/μL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液、BCA Protein Assay Kit購(gòu)自Thermo公司；酶標(biāo)板購(gòu)自Corning公司；LDS sample buffer(4X)、Sample reducing agent(10X)、NuPAGE 4%～12% Bis-Tris(1.0 mm，12 well)預(yù)制膠、MOPS running buffer(20X)、預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)品、Gel transfer stocks(NC膜)均購(gòu)自L(fǎng)ife Technologies公司；5%脫脂奶粉自配；Anti-NMNAT2抗體一抗、NAD/NADH Assay Kit購(gòu)自Abcam公司；IRDye 800CW羊抗鼠二抗購(gòu)自L(fǎng)I-COR公司；β-煙酰胺單核苷酸(nicotinamide mononucleotide，NMN)50 mM，10×Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM MgCl2和2 M NaCl，5×Stop Buffer：200 mM EDT，pH 8.0；ATP(100 mM)購(gòu)自Sigma-Aldrich公司。

細(xì)菌培養(yǎng)箱、水浴鍋、細(xì)菌培養(yǎng)搖床、超聲破碎儀、平板振蕩器、側(cè)板搖床、超凈臺(tái)、pH計(jì)等購(gòu)自上海精宏儀器儀表公司；MilliQ純水儀購(gòu)自Millipore公司；低溫高速離心機(jī)、分光光度計(jì)購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；蛋白電泳槽、電泳儀、轉(zhuǎn)膜裝置iBlotTM購(gòu)自L(fǎng)ife Technologies公司；Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)購(gòu)自L(fǎng)I-COR公司；多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自BioTek公司。

1.2 方法

1.2.1 人NMNAT2蛋白表達(dá) 第1天，取出重組表達(dá)質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a(50 ng/μL)，化凍，3 000 rpm離心2 min；取出-80 ℃保存的BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞(100 μL/管)，冰上化凍5 min，吸取30 ng質(zhì)粒與感受態(tài)細(xì)胞混勻，冰上放置30 min；取出后立即放入水浴鍋42 ℃，熱激80 s，隨后冰上放置5 min；加入熱激的感受態(tài)細(xì)胞到1 mL LB Broth培養(yǎng)液中，37 ℃搖床，200 rpm，培養(yǎng)50 min；3 000 rpm離心3 min，吸棄上清，留100 μL，重懸沉淀；吸取60 μL懸液涂于LB Agar板，放入37 ℃培養(yǎng)箱中，過(guò)夜(12～14 h)培養(yǎng)。第2天，從平板中挑取單菌落至對(duì)應(yīng)卡那霉素抗性的LB(3 mL)試管中，37 ℃搖床，200 rpm, 活化培養(yǎng)；約2.5 h，測(cè)光密度(optical density，OD)600值至0.4～0.8；轉(zhuǎn)入1.5 mL EP管中，4 ℃保存過(guò)夜。第3天，3 000 rpm離心3 min，吸棄上清，重懸細(xì)胞沉淀在1 mL新鮮的LB培養(yǎng)液中，轉(zhuǎn)移至100 mL培養(yǎng)液(卡那霉素，15 μg/mL)中，37 ℃搖床培養(yǎng)，200 rpm，約2 h，測(cè)OD 600值至0.4～1.0之間，0.6較適宜；加入IPTG儲(chǔ)液，終濃度為1.0 mM，37 ℃搖床，200 rpm，誘導(dǎo)表達(dá)培養(yǎng)3 h，冰上放置5 min，轉(zhuǎn)至離心管中，4 ℃，5 000 rpm離心5 min；用0.25倍體積的預(yù)冷20 mM Tris-HCl，pH 8.0 洗滌細(xì)菌2次，收集細(xì)菌，-80 ℃保存、備用。

1.2.2 NMNAT2蛋白的純化 (1)配制BugBuster Master Mix 蛋白裂解液，含蛋白酶抑制劑Halt Protease Inhibitor Cocktail；(2)取出-80 ℃保存的菌體，冰上化凍10 min，加入裂解液，充分重懸，冰浴超聲處理3次，每次15 s，間隔1 min；(3)室溫放置充分裂解20 min，12 000 rpm離心，4 ℃，20 min，收集細(xì)菌沉淀及上清液，蛋白電泳分析；(4)根據(jù)His·Tag融合蛋白純化操作手冊(cè)說(shuō)明，上樣，柱層析，洗滌，蛋白洗脫等步驟純化蛋白，收集各組分，行蛋白電泳分析。

1.2.3 BCA法蛋白定量 (1)牛血清白蛋白0.25～2.0 μg/μL作為標(biāo)準(zhǔn)品，稀釋待測(cè)樣品至合適濃度，取一塊酶標(biāo)板，依次加入10 μL樣品及標(biāo)準(zhǔn)品；(2)根據(jù)樣品及標(biāo)準(zhǔn)品數(shù)量，按50 倍體積BCA試劑A 加1體積BCA 試劑B(50∶1)，配制適量BCA 工作液，充分混勻；(3)各孔加入 200 μL BCA 工作液，把酶標(biāo)板放在振蕩器上振蕩 30 s，37 ℃放置30 min，而后在562 nm下讀板測(cè)定，記錄OD值；(4)以標(biāo)準(zhǔn)品蛋白含量(μg)為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。根據(jù)所測(cè)樣品OD值，依標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)即可求得相應(yīng)樣品的蛋白濃度(單位：μg/μL)，乘以樣品稀釋倍數(shù)即為樣品實(shí)際濃度(單位：μg/μL)。

1.2.4 蛋白電泳分析 上述蛋白質(zhì)樣本溶液，按3體積蛋白樣本加1 體積LDS sample buffer (4X，含Sample Reducing Agent)(4∶1)準(zhǔn)備蛋白電泳樣品，95 ℃煮沸5 min，備用；準(zhǔn)備N(xiāo)uPAGE 4%～12% Bis-Tris預(yù)制膠，電泳緩沖液 MOPS running buffer(1X)，預(yù)染蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)，每孔上樣量為10 μg 蛋白，純化后NMNAT2上樣1 μg；使用專(zhuān)用槍頭，防止樣品溢出加樣孔；100 V電壓，電泳100 min，當(dāng)染料到達(dá)膠的底部，關(guān)電源停止電泳。

1.2.5 Western blot 蛋白質(zhì)鑒定 蛋白質(zhì)電泳完成后，使用標(biāo)準(zhǔn)轉(zhuǎn)膜裝置iBlotTM及NC膜轉(zhuǎn)膜，設(shè)定轉(zhuǎn)膜程序?yàn)镻rogram 3，轉(zhuǎn)膜7 min；完畢后，將膜放置到去離子水中，漂洗1～2 min，洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液；加入blocking buffer(5%脫脂奶粉)，在搖床上緩慢搖動(dòng)，室溫封閉1 h，一抗孵育，按照1∶1 000比例用blocking buffer稀釋一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；吸棄一抗溶液后，加入PBST洗膜5～6 min，共3次；二抗孵育，按照1∶20 000比例用blocking buffer稀釋二抗，加入二抗室溫孵育45 min，吸棄二抗溶液后，PBST 洗膜5～6 min，共3次；去離子水漂洗膜2次，Odyssey紅外激光成像系統(tǒng)掃描，蛋白顯色。

1.2.6 重組NMNAT2蛋白酶酶比活力測(cè)定 準(zhǔn)備純化的重組蛋白NMNAT2(25 μg/mL)，96孔酶標(biāo)板，β-NMN 50mM，10×Reaction Buffer：500 mM Tris-HCl，pH 8.0，50 mM MgCl2和2 M NaCl，5×Stop Buffer：200 mM EDTA，pH 8.0，NAD/NADH assay Kit和ATP 100 mM。

將各試劑溶液加入至96孔板中，最后加入純化的NMNAT2蛋白。NMNAT2 催化生成NAD/NADH。室溫反應(yīng)時(shí)間為：5 s、10 s、20 s、30 s，1 min、2 min、5 min、10 min、15 min、20 min、25 min、30 min。加入10 μL 5×Stop Buffer終止催化反應(yīng)，總體積為50 μL。參照NAD/NADH assay Kit步驟，準(zhǔn)備標(biāo)準(zhǔn)品和以上反應(yīng)終產(chǎn)物混合溶液，按50 體積NAD Cycling Buffer Mix加1 體積NAD Cycling Enzyme Mix(50∶1)混勻，得NAD Cycling Mix 溶液，加入至96孔板中，混勻，室溫反應(yīng)5 min，加入NADH顯影劑， 室溫放置3 h。OD 450 nm讀板，記錄OD值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求得對(duì)應(yīng)NAD/NADH濃度。設(shè)定酶催化的標(biāo)準(zhǔn)單位為U/mgP，即1.0 mg酶每分鐘催化產(chǎn)生的NAD的量為一個(gè)單位，計(jì)算表達(dá)純化的NMNAT2 蛋白酶的酶比活力。

2 結(jié)果

2.1 人NMNAT2蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a轉(zhuǎn)化到適宜的表達(dá)宿主菌BL21(DE3)的化學(xué)感受態(tài)細(xì)胞中，LB培養(yǎng)液，37 ℃搖床培養(yǎng)，OD600值至0.6較適宜，1.0 mmol/L IPTG 誘導(dǎo)目的蛋白NMNAT2表達(dá)，獲得的菌體變性裂解后，NuPAGE電泳可見(jiàn)(圖1)。可檢測(cè)到在相對(duì)分子質(zhì)量約35 kDa處有目的蛋白表達(dá)，蛋白成功誘導(dǎo)表達(dá)。蛋白裂解后，誘導(dǎo)的蛋白主要以不溶形式存在，少量以溶解形式存在。其溶解組分可應(yīng)用于后續(xù)蛋白的純化與濃縮。

2.2 人NMNAT2蛋白的純化

利用Ni-NTA Superflow Kit 親和層析柱進(jìn)行目的蛋白NMNAT2 純化，其結(jié)合NMNAT2重組蛋白上6×His標(biāo)簽。電泳結(jié)果顯示，可溶性組分經(jīng)過(guò)Ni-NTA柱純化后，可獲得純化的NMNAT2蛋白，主要存在于洗脫液組分2(E2)中(圖1)；Western blot結(jié)果示，純化后，NMNAT2蛋白可與NMNAT2抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，分子量約34 kDa(圖2)。獲得的大量含有純的目的蛋白洗脫液，可行進(jìn)一步濃縮，供后續(xù)蛋白鑒定、酶活力測(cè)定及其他蛋白功能研究。

2.3 人NMNAT2蛋白的酶活力測(cè)定

本研究應(yīng)用商業(yè)化的NAD/NADH定量試劑盒，利用酶聯(lián)熒光法檢測(cè) NMNAT2重組蛋白酶的活性[15]。其檢測(cè)原理為：NMN 在 ATP 的存在下，由 NMNAT2催化生成 NAD， NAD 可被乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)轉(zhuǎn)化為 NADH。適時(shí)終止反應(yīng)，測(cè)定終止時(shí)，單位時(shí)間內(nèi)NMNAT2催化合成NAD的量。標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.003 5X+0.027 2,R2=0.997 5。

測(cè)定兩批純化的NMNAT2時(shí)，測(cè)定曲線(xiàn)見(jiàn)圖3～圖4。反應(yīng)初始階段 0～2 min，依反應(yīng)初始速率，獲取酶活力曲線(xiàn)斜率(圖5)。酶活力曲線(xiàn)為：Sample-A，y=0.017 3X+0.613 3，R2=0.997；Sample-B，y=0.011 5X+0.004 27，R2=0.990 7。X軸為時(shí)間參數(shù)；Y軸為產(chǎn)生NAD的量。測(cè)定時(shí)，加入蛋白量為Sample-A，0.012 mg；Sample-B，0.008 mg，所得酶比活力為Sample-A 86 500 U/mgP；Sample-B 86 250 U/mgP，即1.0 mg酶每分鐘催化產(chǎn)生的NAD的量分別為86 500 pmol、86 250 pmol。

3 討論

近年來(lái)，隨著老年人群的不斷增加，如何預(yù)防和治療神經(jīng)退行性疾病已成為亟待解決的難題。軸突退行性病變是一種在慢性神經(jīng)退行性疾病情況下出現(xiàn)的一種病理現(xiàn)象，而軸突退變則被視為是一個(gè)很好的治療神經(jīng)退行性疾病的靶點(diǎn)。NAD在軸突退變發(fā)病過(guò)程中起重要作用， NMNAT是NAD生物合成的關(guān)鍵酶，對(duì)維持體內(nèi)NAD水平的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要[16]。哺乳動(dòng)物中存在3種NMNAT，即NMNAT1、NMNAT2、NMNAT3。NMNAT1或 NMNAT3的過(guò)表達(dá)可以減緩軸突退變，但NMNAT2在軸突退變中的作用目前尚未完全闡明。NMNAT2是分子量為34 kDa的二聚體結(jié)構(gòu)，共有307個(gè)氨基酸殘基，內(nèi)部含有由3個(gè)外顯子編碼的亞型特異性序列，其性質(zhì)不穩(wěn)定，易于氧化，在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)半衰期<2 h。人NMNAT2在中樞神經(jīng)組織中含量豐富，特別在大腦中高度表達(dá)，其在神經(jīng)細(xì)胞體內(nèi)的缺失會(huì)直接導(dǎo)致軸突生長(zhǎng)停滯，繼而發(fā)生軸突截?cái)啵禽S突生長(zhǎng)和生存的必要條件[17]。

本研究確定了人工構(gòu)建的重組質(zhì)粒NMNAT2-pET-24a在體外大腸桿菌BL21(DE3)體系中37 ℃、IPTG(1.0 mM)誘導(dǎo)表達(dá)NMNAT2重組蛋白的條件與方法，建立了應(yīng)用Ni-NTA Superflow Kit進(jìn)行目的蛋白的純化條件，并通過(guò)酶聯(lián)熒光法測(cè)定其催化產(chǎn)物NAD的方法來(lái)測(cè)定酶活性。研究結(jié)果表明，適宜的宿主對(duì)蛋白的表達(dá)具有較重要的作用，通過(guò)優(yōu)化蛋白表達(dá)的溫度、時(shí)間、IPTG 濃度等外界條件，也可改善NMNAT2重組蛋白的表達(dá)情況。NMNAT作為調(diào)節(jié)體內(nèi)NAD水平的關(guān)鍵酶，在神經(jīng)退行性疾病治療、能量代謝和信號(hào)通路中起重要作用。最終獲得的高純度酶活性的NMNAT2重組蛋白，為深入研究NMNAT2在神經(jīng)保護(hù)功能、酶蛋白的活性調(diào)控、軸突退變和神經(jīng)退行性疾病中的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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(學(xué)術(shù)編輯：吳碧華)

Expression, purification and determination of enzyme activity of human recombinant nicotinamide mononucleotide Adenylyltransferase-2

WANG Zhi-han1,REN Li2,ZHAO Liang2

(1.TongjiUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200092;2.DepartmentofNeurosurgery,ShanghaiPudongHospitalAffiliatedtoFudanUniversity,Shanghai201300,China)

Objective：To induce the expression of nicotinamide mononucleotide adenylyltransferase-2 (NMNAT2) through E.coli system,and to determine the enzyme specific activity of purified recombinant NMNAT2 apoenzyme in catalyzing the biosynthesis of nicotinate adenine dinucleotide (NAD).Methods：Under the optimized condition of E.coli BL21 (DE3) system,NMNAT2 recombinant protein was induced to express.The target protein was purified using Ni-NTA Superflow Kit,and was indentified using Western blot method.Besides,its catalysate NAD was measured by enzyme-linked assay,and the enzyme actively was also determined.Results：The human recombinant plasmid construct NMNAT2-pET-24a could be induced to express in E.coli BL21 (DE3) system.The induction conditions were:LB broth (kanamycin,15 μg/mL) in 37 ℃,IPTG (1.0 mM) for 4 hours.And the purified recombinant protein NMNAT2 had high enzyme activity.Conclusion：NMNAT2-pET-24a can be expressed stably in E.coli BL21 (DE3) system.The purified recombinant protein NMNAT2 with higher activity can be obtained under the optimized condition,which can be applied in the study of neuroprotective function and regulation of apoenzyme activity.

Nicotinamide mononucleotide adenylyl transferase 2;Purification;Enzyme activity;Axonal degeneration;Neuroprotection

10.3969/j.issn.1005-3697.2017.02.016

上海市浦東新區(qū)衛(wèi)生系統(tǒng)重點(diǎn)專(zhuān)科建設(shè)項(xiàng)目(PWZz2013-18)

2017-02-12

王之涵(1982-)，男，主治醫(yī)師。

任力，E-mail: slysw@sina.com

時(shí)間：2017-5-5 16∶46

http://kns.cnki.net/kcms/detail/51.1254.R.20170505.1646.030.html

1005-3697(2017)02-0209-05

R741.0

A